Electroencephalographic רכישה בצפיפות גבוהה במודל מכרסם שימוש בעלות נמוכה ומשאבי קוד פתוח

Summary

Instructions for the low-cost construction and surgical implantation of a chronic transcranial high-density electroencephalographic montage into mice are provided. Signal recording, extraction, and processing techniques are also described.

Abstract

טכניקות ניתוח מתקדמות electroencephalographic המחייבים ברזולוציה מרחבית גבוהה, כולל הדמיה ואמצעי מקור חשמל של קישוריות רשת, החלות על מגוון הולך וגדל של שאלות במדעי המוח. ביצוע סוגים אלה של ניתוחים במודל מכרסם דורש צפיפות אלקטרודה גבוהה אלקטרודות בורג מסורתית יכולה להשיג. בעוד מצרפי electroencephalographic בצפיפות גבוהה מכרסמים קיימים, הם זמינים מוגבלים רוב החוקרים, אינם חזקים מספיק ניסויים חוזרים ונשנים על פני תקופה ארוכה של זמן, או מוגבלים לשימוש במכרסמים בהרדמה. ^1-3 בעלות נמוכה המוצע שיטה לבניית מערך אלקטרודות, עמיד ביותר ספירה, transcranial, מורכב headpieces מושתלת בילטרלי נחקרה כאמצעי לבצע ניתוחים אלקטרואנצפלוגרם מתקדמים עכברים או חולדות.

נהלי ייצור כיסוי ראש ו n השתלה כירורגיתecessary לייצר אות גבוהה לרעש, electroencephalographic נמוכה עכבת אותות electromyographic מוצגים. בעוד המתודולוגיה שימושי בשני החולדות ועכברים, כתב היד הזה מתמקד ביישום מאתגר יותר עבור גולגולת העכבר הקטנה. עכברים לנוע בחופשיות הם קשורים רק כבלים באמצעות מתאם משותף במהלך ההקלטה. גרסה אחת של מערכת אלקטרודה זו הכוללת 26 ערוצי electroencephalographic ו -4 ערוצי electromyographic מתואר להלן.

Introduction

פעילות עצבית ניתן להקליט extracellularly עם רמות שונות של פירוט מתפריט מיקרוסקופי (פוטנציאל פעולה יחיד) כדי mesoscopic (פוטנציאלים בשדה מקומיים) כדי מקרוסקופית (אלקטרואנצפלוגרם). עקבות גל מוח אלה מנותחים קלסיים בתחום התדר לאפיין התנהגות, הנוירופיזיולוגיים או מדינות אלקטרו. ניתן לעשות זאת עם biopotential יחיד, ⁴ אבל קלטות EEG הצפיפות דלילות לא יכול לפתור את הרכיב המרחבי של פעילות עצבית. ניתוח אלקטרואנצפלוגרם מודרני מסתמך על אלקטרודות מרובים כדי לייצר מפות מפורטות של חלוקת spatiotemporal של פעילות קליפת מוח על מנת לתאם פעילות עם תנאים פסיכולוגיים ספציפיים ותהליכים פיסיולוגיים. ^5-7 שתיים בקטגוריות יותר הנפוצות של ניתוח המחייב מצרפי EEG צפיפות גבוהה הם הדמית מקור חשמל ואמצעי קישוריות רשת עצבית. ^8-11

> הדמית מקור חשמל כרוכה הלוקליזציה של אזורים במוח פעילים מבחינה תפקודית. מיפוי טופוגרפי של מערך אלקטרודות יכול לדמיין את צפיפות מקור הזרם של הפעילות החשמלית בתוך המוח במהלך פוטנציאלים הקשורים לאירוע (ERPs) ואת הפוטנציאלים עוררים (EPS). לוקליזציה מקור חשמל הוא נפוץ בשני מחקרי התפיסה כמו גם חלוקת כוח מנתח. ^12-15 מאז יש EEG רזולוציה גבוהה זמנית, מחקרי EEG אפשר הערכה בזמן אמת של ERPs והרווח למניה וכן ניתוח פוסט הוק מדויק ובזמן. ^{3,11 , 12}

שיוך מדינות תפקודים קוגניטיביים עם משחק הגומלין של תנודות לראות על אלקטרואנצפלוגרם היא המטרה הסופית של האמצעים השונים של קישוריות רשת עצבית. מחקרים רבים הראו סנכרון ושלב הנעילה של תנודות בין אזורי מוח שונים הקשורים במדינות ספציפיות של עוררות, תשומת לב, ופעולה. ^{6,13,14,16-19} הוכחת עמותות אות כזה בין אזורים במוח דורשת מערכי צפיפות גבוהה המאפשרים ערכות של קישוריות רשת.

לוקליזציה רשת מקור מנתח אותות EEG מקורו במחקרים בבני אדם, אך חקירות הבסיס העצבי עבור האותות הללו בהכרח כרוכות במודלים של בעלי חיים, כפי שהם דורשים טכניקות פולשניות שאי אפשר אחרת בבני אדם. על מנת לשכפל ניתוחים אלו במודלים של מכרסמים, שיטה לכידה אותות EEG צפיפות גבוהה המוח של מכרסם נדרשת. בעוד קבוצות אחרות יש לבנות מערכים microelectrode בצפיפות גבוהה לשימוש בעכברים, גישות כאלה של זמינות מוגבלת לחוקרים ללא גישה למתקני nanofabrication, אינם חזקים מספיק ניסויים חוזרים ונשנים על פני תקופה ארוכה של זמן, או מוגבלים לשימוש הרדים עכברים. ^1-3,7 פרוטוקול חלופי בעלות נמוכה לבניית צפיפות גבוהה כרונית, transcranial אלקטרודה ערהy מודגם כאן.

גישת רכישת האות המתוארת כאן אינה מוגבלת EEG, אך כולל electromyographic אותות (EMG). רכישת אותות EMG יכולה להיות גישה משלים להגדרת מדינת התנהגות והוא שימושי במיוחד עבור חקר-השינה. דרך זו מספקת ביניים בין רשתות תוך גולגולתי היקרה, אולטרה-צפיפות גבוהה, ומספרים להוביל המוגבלים אפשריים עם אלקטרודות בורג מסורתיות כי אין מספיק גישות ניתוח מתקדמות. עיצוב כיסוי הראש בנוי בקלות ובמחיר סביר ללימודי תפוקה גבוהה. שימוש במערכת רכישה זו בשילוב עם טכניקות מניפולטיביות גנטיות שונות או תרופתיות בתוך במודלים של מכרסמים יכול לעזור לחשוף את המנגנונים של יצירת תנודת קליפת מוח, סטיות התנהגותיות מהפרשי גנוטיפ נכון, מקור לוקליזציה של ERPs והרווח למניה, ותקשורת רשת בקנה מידה גדולה.

Protocol

המחקרים שבוצעו לאורך החקירה הזו היו בהסכמה עם ה- National Institutes of Health מדריך עבור לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש באוניברסיטת פנסילבניה.

1. פריט לשיער עיצוב ובנייה

1. הסר כל שורה שמינית של סיכות מן הלבנים הפיניים 2 x 50 של מחבר קיבול 100 עמדה עם פינצטה על ידי לחיצה על חלק הקיבול של הסיכה דרך לבני פלסטיק.
   הערה: פיני פונה כלפי מטה יהיה הכיוון כי יהיה בהפניה למשך השארית של הפרוטוקול. (שימו לב זה דווקא 2.6).
2. מכסים את סיכות עם מעיל בהיר מאוד של לק לבודד ולתת לק להתייבש לחלוטין.
3. הסר את לק מקצות הפינים עם אצטון מטלית קטנה.
4. חתוך את עודפי הניילון של 2 x 7 האישי באמצעות p סכין גילוח או חוט חיתוךliers. זה יגרום 2 x 7 לבנים כי הם מבודדים לאורכו של הסיכות חשופות בקצה הסיכה. אלו בסופו של דבר יהפכו את האלקטרודות EEG transcranial. שני 2 x 7 לבנים נחוצים עבור מערך אלקטרודות כרוני שלם (איור 1 א).
5. חותך שני 1 x 2 לבני סיכה להקלטת אותות EMG. השתמש באותו תהליך של הסרת סיכות רצויות עם פינצטה חיתוך פלסטיק לנזול החוצה כדי ליצור את הלבנים 1 x 2. ודא 1 אלה x 2 נעיף צד חלק להם משקע Position 100 המקורי כפי המרחק הזה יהפוך את המרחק הפיני הסטנדרטי עבור כל כיסוי ראש כך מתאם יחיד יעבוד עבור כל headpieces (איור 1 א).
6. השתמש אפוקסי 2-חלק לצרף את חתיכת סיכת 1 x 2 אל היצירה הפינית 2 x 7 (האיור 1D).
   1. כמו בשני הקבוצות של סיכות חייבות להיות בכיוון הזהה, אפוקסי 1 x 2 בצד הלטרלי של שני החצאים של כיסוי הראש עם הצדדים החלקים של x 1 x 2 ו -27 פנייה זה לזה. יישר את 1 x 2 וחורי-סיכה וסיכות עם סיכות 2 השורות האחוריות-ביותר על 2 x 7.
      הערה: שני חצאים של כיסוי ראש אינם epoxied יחד. דבר זה מאפשר גמישות בתוך שני חצאים של מתאם כיסוי ראש לחיבור קל במהלך הרגלה ובמהלך ימי הניסוי (איור 1E).
   2. תן חצאים כיסוי הראש לרפא לילה. בסיום, כיסוי הראש הוא סימטרי בילטרלי. כל חצי מורכב לבן פיני 2 x 7 עם לבנה פינית 2 מצורפת רוחבי x 1 כי הוא עולה בקנה אחד עם האחורי ביותר 2 שורות של הלבנים הפיניים 2 x 7.
7. כן חוטים להקלטת אותות EMG. חוט כסף יחיד תקוע, 31 G-מבודד perfluoroalkoxy משמש אות EMG הקלטה (איור 1D). עם זאת, רב-גדילים או חיווט מתכת אחר ניתן להחליף אם ירצה בכך.
   1. כדי ליצור חוטים החזי EMG לקחת חתיכת 3.0 ס"מ של חוט כסף perfluoroalkoxy-מבודדים rem1 ס"מ אובה של בידוד פלסטיק מקצה אחד עם סכין גילוח. עוטפים את החוט הלא מבודדים ברחבי פינצטה פעמיים. הסר את החוט מהמלקחיים ולהסיר 25 מ"מ של בידוד על הקצה שאינו כרך בסכין גילוח.
   2. כדי לבנות חוטי EMG צוואר הרחם, חזור על התהליך עם קטע 1.5 ס"מ של חוט. שני חוטי EMG צוואר רחם ושני חוטי EMG החזי נדרשים על כיסוי ראש מלא.
8. הסר את הסיכה לרוחב בשורה קדמית הקליעה של שתי headpieces, אשר תואמת את קואורדינטות stereotaxic של 3.3 מ"מ קדמי של גבחת ו 2.3 מ"מ לרוחב של גבחת, שכן אין מוח מתחת למיקום זה כפי שנקבע על ידי אטלס מוח עכבר ²⁰ (איור 2A).
9. משני חצאים כיסוי הראש, לחתוך את הפינים של לבני 1 x 2 לבסיס הפלסטיק של כיסוי הראש עם זוג מספרי תיל (3.0 מ"מ מהקצה של הסיכה) לרתך חוט EMG צוואר הרחם לפין הקדמי ואת החזה EMG אל p האחוריב.
   1. בדוק כי כל סיכה היא חשמלי מבודדת. בצע בדיקת המשכיות עם מודד דיגיטלי על ידי חיבור השני המוביל של מד המתח לפינים שונים תוך במצב ההמשכיות. חשמלית סיכות מבודדות לא לייצר צפצוף נשמע עם מבחן מודד זה; עם זאת, מצמידים חשמלי סיכות תהיינה. מכסים את המפרקים מולחמים עם לק ופעם יבש, לכופף את החוטים EMG כזה שהם נמצאים מקביל לציר הקדמי / האחורי עם תזוזה לרוחב מינימלי.
10. סיכות Trim באורך יחסים כל כך הם תואמים את פרופיל פני השטח של המוח.
    1. עם עוזרו של אטלס מוח עכבר, מרחק גחון שיא כדי משטח המוח מפני גבחת עבור כל סיכה לתאם. ²⁰ הפין אשר מרחק גחון מ גבחת הוא גדול ישמש כאינדיקטור עבור זמירה פינית. הסיכה הזאת לא תיחתך בעוד כל הסיכות האחרות תקוצצנה ביחס סיכת מרחק גחון מקסימלי זה (לוח 1).
       הערה: פיני יכול להיות grinded עד גודל אבל זה חייב להיעשות בזהירות כפי החיכוך בין סיכה שחיקה ההגה יכול לגרום הפינים של כיסוי ראש להתכופף. אם סיכה היא כפופה, להשתמש בפינצטה, כדי ליישר אותו. חלופה שחיקה הפינים עד אורך היא לקצץ אותם עם צבת חיתוך חוט.
11. מכסים כל הטיפים סיכה עם פתרון כסף באמצעות עט פתרון כסף ולתת להתייבש. צעד זה מוריד עכבות אלקטרודה כדי ≤30 קילו-אוהם, דבר המגדיל את יחס אות לרעש ובמקביל מבטל את הקצוות הגסים שנגרם מן סיכה זמירה, ולכן קיימת האפשרות להקטין את הסיכויים של נזק לרקמות והאצת התאוששות מניתוח. משקולות חצי כיסוי ראש השלימו כ 0.5 גרם.

2. מתאם בינוי מיפוי הערוץ

1. חותכים את החוטים למחבר של מחבר זכר שורה Dual 36 עמדה ננו-מיניאטורות באורך אחיד של 2 ס"מ או 3 באמצעות סכין גילוח. עבור כל חוט, stלתלוש 2.5 מ"מ של בידוד מסוף ופח המתכת החשופה לכל חוט. ודא כאשר tinning יש גדיל בודד, דקה של חוט משומר עבור כל חוט מתאם נאנו בתור זה הוא חיוני לבודד סיכות. לקטום את הבידוד הפשיט עם צבת חוט חיתוך (איור 1 ג).
2. צור מחבר זכר / זכר התאמה כדי כיסוי הראש באמצעות קונטיקט רצועת כותרת 2 x 50. Cut שני 2 x 7 של ושני 2 x 1 של מ לבן 2 x 50. הסר סיכות רצויים מתוך לבנים 2 x 50 על ידי ניתוק אחד פיני זכר, ולאחר מכן דחף את המחצית השנייה רצוף מאותו חתיכה למחבר עם פינצטה (איור 1B).
   הערה: צד אחד של סיכות אלה ישמש סיכות מתאם כדי לחבר אל כל כיסוי ראש, ואילו החצי השני יהיה מולחמי החוטים למחבר ננו משומרים. הקפד יש את קצות פלסטיק השטוחים של הנגיעה 2 x 1 ו -2 x 7 כדי להבטיח הזדווגות נאותה של מחבר הזכר / הזכר עם כיסוי הראש שנוצר בשלב1.
3. הלחמה על אחד חוטי קרקע / הפניות ממחבר ננו לפין קרקע / פניות הרצויות. חוטי קרקע ועיון קשורים יחד על שבב מגבר RHD2132. השתמש סיכה היחידה שהנה קדמי מ"מ 0.60 כדי גבחת ו 1.00 לרוחב מ"מ של גבחת כמו גם התייחסות קרקע. (כיסוי ראש שמאל, סיכה המדיאלי של השורה הקדמית ביותר השלישית, אולם כל סיכה אחרת יכול להיות מוקצה אם מועדף, איור 2.) שים לב כי ניתן להפריד קרקע ועיון על שבב המגבר ידי הסרת הנגד 0Ω קושרת קרקע והתייחסות יחד אם לבודד את שני הוא רצוי.
4. הלחם את החוטים למחבר ננו משומרים לאותו הצד של גבר / מחברי זכר כחיבור סיכת קרקע / התייחסות. חוט כל מפות לערוץ מסוים, כך מערך ערוצים ניתן להשלים בשלב זה. דיאגרמות מפת הערוץ עבור headstages המגבר נמצאות באתר להרחיב Ephys Wiki (https://open-ephys.atlassian.net/wiki/display/OEW/Home). הלחם את החוט המתאים שבערוץ ידוע לפין המתאים כדי להשיג את המיפוי הרצוי.
5. חותכים חוטים בשימוש בבסיס למחבר ננו עם צבת חיתוך חוט.
6. השתמש מד מתח על מנת להבטיח כי כל סיכה היא מבודדת חשמלי מכל הסיכות האחרות. לאחר הבידוד הוא אישר, מרח שכבה דקה של לק מסביב לכל מפרק הלחמה לבודד עוד יותר כל סיכה.
7. באמצעות אפוקסי 2-חלק, לחזק את מתאם ננו התאמת אל 2 x 7 ו -2 x 1 פינים הבילטרליים על הלבנים בין גברים.
   הערה: יהיו שני חצאים למתאם היחיד הזה, להתאים את הסדר הסיכה של חצאים כיסוי הראש שנוצרו קודם לכן. זה קריטי כדי לוודא כי החלק המדיאלי של כל מחצית של המתאם אין אפוקסי עודף גדותיו קצה הפלסטיק של מחבר הזכר / זכר, זה ימנע את שני החצאים של כיסוי הראש להיות מחובר בכבלים לחשמל בעת ובעונה אחת. אל תרשה לאף אפוקסי לזרום לחלק התחתון של por מתאם סיכהtion של המתאם, כמו זו גם תמנע חיבורים נכונים. השתמש 2 חצאים כיסוי הראש כמו עובש ליישור פיני נכון.
8. אפוקסי שני החצאים של המתאם ואפוקסי בבסיס מחבר ננו כדי להגדיל את עמידותו. הקפד לכסות את כל מפרקי ההלחמה עם אפוקסי. תן לילה תרופת מתאם.
9. אישור של מיפוי ערוץ נכון יכול להתבצע באמצעות מדידות עכבה בממשק המשתמש הגרפי הפתוח Ephys (GUI). מתאם השלים שוקל כ 1.3 גרם (איור 1F).

3. כירורגיה

1. כן שדה כירורגי סטרילי.
   1. ללבוש כפפות סטריליות וציוד מגן אישי אחר כנדרש. לעקר כלים ב חיטוי. לעקר את מסגרת stereotactic עם פתרון דו תחמוצת כלור 1.0 מ"מ. רסס את הפתרון על המסגרת ומתן 5 דקות לפני השטיפה עם מים סטריליים.
   2. כדי לעקר headp מושתלתחלקי iece, לרסס את הרכיבים עם פתרון דו תחמוצת כלור 1.0 מ"מ, ומתן 5 דקות לפני השטיפה עם מים סטריליים. מניחים את החומרה מושתלת עכשיו סטרילית לתוך צלחת פטרי סטרילית.
2. השג משקל טרום ניתוחית עבור העכבר, ואז להרדים את העכבר בתא אינדוקציה 200 מ"ל באמצעות isoflurane 1.5-2.0% ב 100% חמצן. השתמש קצב הזרימה לתוך תא של בערך 500 מ"ל / דקה.
3. אשר אובדן ליישר רפלקס על ידי החלפה של תא אינדוקציה. הסר את העכבר מאולם אינדוקצית המקום לתוך חרטומו על מסגרת stereotactic בלי ראשו של הבטחת העכבר לחלוטין עם ברי אוזניים. המשך לעקוב אחר עבור עומק נאות של הרדמה על ידי הערכת קמצוץ בוהן תוך הערכת סימנים חיוניים.
4. לשמור על טמפרטורת גוף ליבה ב 37 מעלות צלזיוס עם בקר טמפרטורת לולאה סגורה, כגון מערכת כרית חללית וחימום רקטלית. מכסים את העיניים של העכבר עם משחת עיניים עיניים לפני זמירה את הפרווהעל החלק העליון של הגולגולת באמצעות מספריים או קוצצים מעוקלים. לחטא את הראש בבטאדין ולאפשר בבטאדין להתייבש לחלוטין לפני שתמשיך.
5. נהל משככי כאבים ואנטיביוטיקה יחד עם נוזלים intraperitoneally. עבור עכבר 25 גרם, 0.5 Cefazolin מ"ג, 0.125 meloxicam מ"ג, 0.5 מ"ל תמיסת מלח, ו -2.5 מיקרוגרם עצירות q 4-6 PRN hr.
6. להזריק 250 μl 0.25% מתחת לעור bupivacaine לאורך קו האמצע על הראש, ולהזריק 100 μl תת עורי bupivacaine 0.25% משני קשתות הזיגומטית של העכבר.
7. אבטח את העכבר בתוך מסגרת stereotaxic ולחשוף את הגולגולת.
   1. אבטח את הראש של העכבר עם ברי אוזני stereotaxic למסגרת stereotaxic. ודא כי העכבר הוא מטוס כירורגית של הרדמה על ידי המאשר בהעדר רפלקס קמצוץ הבוהן. צור חתך 1.5-2.0 סנטימטר יחד עם אזמל חד פעמי 11 מס 'לאורך קו אמצע של הגולגולת. החתך יתחיל מ בין העיניים ולהמשיך בדיעבד על העורף.
   2. לחשוף את הגולגולת על ידי הפצת העור רוחבית עם מלחציים מיקרו. צמצום ריכוזיות isoflurane מ -2.0% לריכוז המקיים מטוס כירורגית של הרדמה, אך לא להפחית נמוך יותר isoflurane 1.0% ב 100% חמצן. שיכוך כאבים טרום ניתוחיים מפחית את כמות הרדמה נשאפת צורך לשמור על עומק של הרדמה כירורגית, ויכולים להוביל להתאוששות מהירה ותוצאות הישרדות משופרות.
8. אזן את החורים ברי הגולגולת לקדוח.
   1. לזהות גבחת ואפס את הקואורדינטות stereotactic ב גבחת, אשר הופך את המקור של מערכת קואורדינטות. בכדי לכוון את גובה הגולגולת בציר המדיאלי / לרוחב, לעבור בדיקת פילוס מחוברת זרוע מניפולטור stereotaxic רוחבית 1.50 מ"מ בשני הכיוונים מ גבחת ולאשר כי עומק הגב / הגחון הוא פחות מ 0.05 מ"מ כאשר מגעי הבדיקה על ימין ועל שמאל הצדדים של הגולגולת.
      הערה: 10 מיקרומטר ברזולוציה של ar מניפולטור הגב / הגחוןמ 'הפועל בשיתוף עם דיגיטלי לתאם תצוגה מפשטת פילוס. פילוס ציר הקדמי / האחורי על גבחת כדלקמן באותה טכניקה. ההבדל במרחק הגחון שפנה גבחת ו למדא צריך להיות גם פחות מ -0.05 מ"מ.
      1. התאם את הגולגולת עד הפילוס יושלם בשני הכיוונים, כך המטוס הרוחבי הוא מקביל לקרקע. זה מאפשר קואורדינטות stereotactic נכון כפי שניתן לראות אטלס מוח עכבר. ²⁰
   2. עם מקדח מייקרו בקוטר 0.5 מ"מ בתוך מקדח stereotaxic, חורים ברי תרגיל מן קדמי 3.30 מ"מ עד אחורי 4.50 מ"מ עד גבחת ב 1.30 במרווחי מ"מ 1.00 מ"מ רוחבי אל קו האמצע משני חצאים של הגולגולת. עבור 2.30 מ"מ העמודים לרוחב של אלקטרודות, חורים בר תרגיל מן הקדמי 2.00 מ"מ עד גבחת ל 4.50 האחורי מ"מ עד גבחת ב 1.30 במרווחים מ"מ משני צדי קו האמצע (איור 2). דיוק ואמינות גבוהה כי נדרשת לר זומבצע Illing הוא פשוט בהחלטת 10 מיקרומטר של זרוע מניפולטור דיגיטלית stereotaxic.
      הערה: על מנת הפינים של כיסוי ראש השתלתו כראוי, הגולגולת של העכבר חייב להיות בבטחה במקום בתוך מסגרת stereotaxic. אם הגולגולת נעה במהלך קידוח, חוסר תיאום בין חורי headpiece ו ברי עשוי להתחולל.
9. שתל headpieces.
   1. עם מלקחיים ישר, להכין מנהרות חוט EMG עבור חוטי EMG החזה. מחילת 2.5 סנטימטר בין העור והשרירים בגב הוא מהשמאל וחוטי EMG תקינים. הכנס את החזה ואת EMGs צוואר הרחם לתוך החלל שנוצר עם המלקחיים הישרים הראשון, ולאחר מכן לתמרן את הלבנים EEG עם מלקחיים מעוקלים כך הסיכות ליישר עם החורים ברי קדח בעבר.
   2. להפעיל לחץ קל על כיסוי הראש לנענע את הסיכות לתוך הגולגולת. קוטר פין הוא 0.46 מ"מ. עם בידוד לק, הסיכות תתאמנה בחוזקה את בר הקדח הוles. כיסוי הראש יהיה יציב פעם שהוא מוכנס כראוי. התאם חוטי EMG לעמדות סופיות. חזור על אותו התהליך עבור כיסוי הראש בצד השני.
10. אבטח את headpiece במקום באמצעות מלט שיניים.
    1. כאשר שני headpieces נקבע במקום, לערבב 1: 1 יחס של methacrylate מהתיל עם מתחם crosslinking שלה. החל את התערובת כך שהוא מכסה את הגולגולת החשופה, חלקים מלוטשים-ציפורן של האלקטרודות הסיכה, וחלקה הפרוקסימלי של חוטי EMG, אך אינו מכסה את הקיבול הנשי של כיסוי הראש.
    2. הקפד שלא לקבל מלט על פרווה. אל תאפשר עבור רכסים של מלט כדי ליצור ושהעכבר תוכל להיאחז. ודא מספיק זמן עבור הבטון להתייבש, ולאחר מכן הסר את העכבר מהמסגרת stereotactic. המשקל כולל ושהעכבר יצטרך לשאת הוא מ- 2 חצאי הכיסוי הראש ואת מלט ההבטחה הוא כ -1.2 גרם.
11. מניח את החיה בתוך נקיאזור התאוששות.
    1. לשמור על טמפרטורת גוף ליבה עם כרית חימום. צג את העכבר עד שהוא חוזר כל הרפלקסים היציבים, מסמל הופעתה מן ההרדמה. דיור בודד מומלץ עבור התאוששות ארוך טווח.
    2. מעקב יומי למשך תקופה מינימלית של 3 ימים לאחר הניתוח מומלץ עם שיכוך כאבים התערבותית. אפשר 10-14 ימים של התאוששות לאחר ניתוח לפני תחילת תקופת התרגלות קשורה.

4. בעלי חיים להרגיל קשירה

1. חבר את מתאם העכבר באמצעות משענת ראש העכבר (איור 1G-H). תחזיק פינות נגדיות של headpieces כי הם בצרו למקומו עם hemostats המעוקל פעם העכבר מרוסן והכנס באיטיות את סיכות המתאם לתוך כיסוי הראש המושתל משני הצדדים.
2. חבר את מגבר 32 ערוצים למתאם (1H איור). הקפד ליישר את הלוגו הוא במתאם והמגבר בתוך שיתוףאוריינטציה nsistent עבור הן מתאם ואת המגבר כדי למנוע טעויות ערוץ מיפוי. חבר את מגבר ממשק היקפי סדר תקן RHD2000 כבל (SPI). כבל זה יתחבר למערכת הרכישה להקלטת אות.
3. מניח את העכבר בתוך תא שיש לו זרוע שלוחה מותקנת על הקיר בתא. חבר את כבל ממשק SPI לזרוע שלוחה ולהתאים את המתח בזרוע השלוחה כדי לנטרל את משקל הכבל הקשור. העכבר הוא מסוגל לנוע בחופשיות והוא מורגל במשך שעה ביום השבוע לפני ההקלטה.
4. כדי לנתק את העכבר, פשוט לנתק את כבל ומתאם מן העכבר תוך כדי בעזרת מרית מיקרו חלד שטוח פלדה עוזרו של ניתוק מתאם מן העכבר.

5. הגדרת מערכת הפקת איתותים / הקלטת איתותים

1. חבר את המתאם נבנה לתוך כיסוי הראש של עכבר מושתל. חבר מגבר headstage למתאםלחבר כבל ממשק SPI תקן למגבר ו ללוח הרכישה. יש כבל SPI לצרף שלוחה מתוחה כמו שצריך, כך המשקל הנוסף על ראשו של העכבר ממוזער.
2. מניחים כלוב פאראדיי המקומי, נוצר באמצעות רדיד רשת או אלומיניום ניצוח, סביב headstage וטחן כלוב פאראדיי המקומי.
3. השג עכבות אלקטרודה לפני תחילת כל הקלטה על ידי בחירת עכבות קצב הדגימה 30 KS / sec ולמדוד באמצעות מודול ב GUI. ערך עכבה פחות או שווה ל 10 קילו-אוהם עבור סיכת פרט נדרש אישור של קשר אלקטרודה נכון. ערכי עכבה גבוהים לגרום נתונים דחו מן האלקטרודה כי.
4. להקלטה, ליצור שרשרת אותות של FPGA הקצב, מסנן bandpass, וצופת LFP ב GUI. מומלץ לבחור קצב דגימה של 1.00 KS / s, רוחב הפס של 0.1-7,500 הרץ ולבטל את הבחירה DSP. הגדר את מסנן bandpass כדי 0.1-250 הרץ ו להציג את הערוצים על ידי opening הצופה LFP. 250 ו -400 אמפליטודות ערוץ מיקרו-וולט עם שיטת ההגרלה שנבחרו הטובה חזותי את נתוני.
5. להתחיל את ההקלטה באמצעות GUI. צור תיקייה חדשה עבור כל הקלטה להגדיר את הנתיב לשמירת קבצים לתיקייה זו. כדי להתחיל הקלטה פשוט פגע שיא. כל 32 הערוצים מן המחבר נרשמים כברירת מחדל, אך ניתן שלא נבחרו ערוצים רצויים על ידי הלחיצה על הצד הימני של מודול ה- FPGA קצב לפני תחילת ההקלטה.
6. נתוני יבוא לתוך Matlab לניתוח. ישנם מספר רב של ארגזי כלים בקוד פתוח, שניתן להשתמש בהם כדי לסייע בניתוח.

תוצאות

נתוני מדגם נרשמים עכבר לנוע בחופשיות מושתל עם כיסוי ראש EEG צפיפות גבוהה מוצגים באיור 3. גל EEG בודד מתאים את ערכת ערוץ המיפוי שמוצגת באיור 2. דוגמאות EMG צוואר רחם החזי גם מוצגות באיור 3. ראוי לציין, כי הקלטת EMG החזה מכילה גם פעילות חשמלית מוטבעת שמקורם בלב של העכבר כי מתברר בקלות כאשר אות הפרשים בין שני חוטי EMG החזי (T) מחושבת. עם הקלטה זו היא גם ניתן לחשב את קצב הלב של העכבר על ידי מדידת הזמן בין קוצי QRS באק"ג. ^23-24 באופן דומה, אפשר למדוד את קצב הנשימה של העכבר על ידי חישוב השתנות פאזית של ספייק QRS כמו את חלל בית החזה מתרחב חוזים עם כל נשימה. ²⁵ לפיכך, התקנה זו היתרים לרכישת opolysomnography murine f. יתר על כן, ההתקנה מאפשרת מיפוי קליפת המוח של פוטנציאלים חזותיים עוררים (איור 4). כאשר דופק 10 msec האור מועבר רק לעין השמאל של העכבר, תגובות קלסיות נרשמות הנגדי (אבל לא ipsilateral) בקליפת הראייה העיקרית כי הם ואחריו תגובה מושהה בקליפת ראייה משנית נגדית. הסרט מוטבע איור 4 מראה את השעה משתנית פוטנציאלים חשמליים על פני השטח של קליפת המוח כולו יחד עם גרפי פעילות V1 הנגדי ו- V2.

AP
3.3			0	0
2		0.4	0.6	0.6	0.4
0.7		0.6	0.9	0.9	0.6
-0.6		0.9	1	1	0.9
-1.9		1	1.1	1.1	1
-3.2	3	1	1	1	1	3
-4.5	3	0.7	0.7	0.7	0.7	3
ML		-2.3	-1	1	2.3

טבלה 1:. פין זמירת אורכי נתון זה מראה את אורכי זמירה הנדרשים, מ"מ, לכל פינים עבור כיסוי הראש. אורכים עבור זמירת סיכה נרכשו מתוך אטלס מוח עכבר. באפter סיכות זמירה, כיסוי הראש תואם את פרופיל פני השטח של המוח. ²⁰ סיכות EMG מנותקות לחלוטין כמו החוטים המשמשים להקלטת אותות EMG מולחמים על הבדל הפיני.

איור 1:. פריט לשיער רכיבים, מדרגות בניית ביניים, ו חיבור תקין עבור הקלטה נתון זה מראים את חומר הגלם המשמש ליצור headpieces. החל עם connecter קיבול 100 פינים, קטן 2 x 7 ו -2 x 1 רכיבים נוצרים. שים לב ברכיב 2 x 1, הקצה המקורי של 50 2 x הוא תם, המתיר בניית כיסוי ראש עקבית ומאפשר מתאם אחד להתחבר עכברים מושתלים רבים. איור 1B ו 1C להציג את חומרי הגלם הנדרשים כדי ליצור את המתאם מן הקצה העליון למגבר. 1B הציג סוף כיסוי הראש של המתאם שניכר דומה להתחבר כיסוי הראש. שים לב 2 כי x 1 שוב יש יתרון מקורי ממרכיב הגלם, הבטחת חיבור תקין בין המתאם לבין כיסוי הראש. תרשים 1C מציג את קצו של מתאם המתחבר המגבר. 1D האיור ממחיש את epoxied 2 x 7 ו -2 1 x רכיבים יחד עם חוטים מוכנים EMG הקלטת אות. איור 1E מדגים כיסוי ראש הושלם. איור 1F מציג מתאם הושלם. איור 1G מראה שיש קשר ראוי בין headpieces ואת המתאם. לבסוף, איור 1H מראה עכבר מושתל עם מתאם ומגבר מחוברים. שבב המגבר מחובר בכבל ממשק שיוצא ללוח הרכישה (לא מוצג). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

class = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1">
איור 2:. אלקטרודה Montage באופן מלא נבנה פריט לשיער נתון זה מראה מיקום האלקטרודה ביחס במוח העכבר. מקומות אלקטרודה מבוססים על קואורדינטות stereotaxic מ גבחת. קואורדינטות של כל אלקטרודה ניתן למצוא בשלב 4.8 של הפרוטוקול. צבע אלקטרודה תואם את אזורי המוח הבסיסיים של כל אלקטרודה. לבן = הקורטקס אסוציאטיבי חזיתית (FRA), אורנג '= הקורטקס המוטורי ראשוני (M1), ורוד = הקורטקס מוטורי משני (M2), ירוק כהה = קליפה חושית עיקרית, באזור forelimb (S1FL), ירוק = קליפה חושית עיקרית, אזור dysgranular (S1DZ ), אור ירוק = קליפה חושית עיקרית, שדה חבית (S1BF), הקורטקס אסוציאטיבי הקודקודית צהוב = המדיאלי (MPtA), קליפת ראייה הכחולה כהה = עיקרית (V1), תכלת = קליפת ראייה משנית, אזור mediomedial (V2MM), שחור = dy retrosplenialקליפת sgranular (RSD). ²⁰ Common הפניה / קרקע מוצגת גם כן. ערכת אזכור זה ממזער חפץ נשימה בתוך אות הגלם. מספרים המשויכים לכל אלקטרודה פרט לספק מפת ערוץ עבור המערך כולו. תמונה השונה מן אלן עכבר מוח האטלס. ^21,22 איור 2B מראה כיסוי ראש בנוי באופן מלא בקנה מידה ביחס אגורה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: EEG לדוגמא EMG רשמים מן אלקטרודה Montage גל אלקטרודה מתאימה מיפוי הערוץ שמוצג באיור 1 א.. EMG צוואר הרחם (C) מספק את היכולת לקבוע את טונוס שרירים עורפי (+). אותות EMG מכילים גם דחפים חשמליים QRS לב(*). ברים סולם של 200 מיקרו-וולט עבור משרעת קורט 1 שניות משך עקבות מוצגים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4: פריסה המרחבית של פוטנציאל עורר חזותי פריסה המרחבית של היישום הבא פוטנציאל העורר של בזק אור חד צדדי מנוהל רק על עינו השמאלית.. התרשים העליון מתאר את מונטאז EEG בצפיפות גבוהה עם כל עיגול מייצג אלקטרודה. שינוי צבע לאורך זמן מתאים מתח שינויים לאורך זמן של כל אלקטרודה בהתאמה. בשלב = 0 msec, דופק אור 10 msec מועבר וייצג באיור באמצע. גרפי תחתון ממחיש מתכוון עקבות פוטנציאל עוררות לאלקטרודות V1 ו- V2 EEG הנגדית (n = 108 ניסויי EP). pul אורse מתרחשת ב 0 msec. ראוי לציין, כי בתגובת הפוטנציאל העוררת המתאימה הוא ציינה V1 הנגדי (זכר שחור), ואחריו חביון כבר עוררה תגובה פוטנציאלית V2 הנגדי (זכר אדום). (קליק ימני להוריד).

Discussion

בניית הבעלות הנמוכה צעדי ניתוח נחוצים כדי כראוי להשיג 26 ערוץ, בצפיפות גבוהה מונטאז EEG בעכבר מתוארת. קשר אלקטרודה אפידורלית נכון הוא קריטי ברכישת אותות EEG האיכות במערכת זו. שני צעדים בתוך כתובת פרוטוקול בנושא זה: סיכת זמירה להתאים קונטור המוח, והשתלת כיסוי ראש לפני חיזוק אקריליק. חשוב לא לחתוך סיכה קצרה מדי בשלב הבנייה. כאשר להשתיל את headpieces, זה הכרחי כדי לבדוק מיקום הסיכה לפני חיזוק אקריליק הסופי. דרך אחת כדי לאשר קשר אלקטרודה נכון היא באמצעות בדיקות עכבה. לכאורה, עכבות של 5-10 קילו-אוהם מציעות מיקום אפידורל ראוי. ²⁶   מדידות עכבה להדגים את העמידות 'headpieces, כערכים עכבה אלקטרודה יציבים בתוך 5-10 זה מגוון קילו-אוהם למשך 4 חודשים לפחות לאחר ההשתלה. האחרצעד חיוני כרוך יישור פיני EMG עם שתי השורות האחוריות ביותר של לבני EEG 2 x 7. זה קריטי עבור חיבור מתאם, כמו EMG המיושר וסיכות EEG יגרמו חוסר יכולת לחבר את המתאם או סיכות מתאם מכופפות.

יתרון עיקרי של מערכת רכישה זו הוא הקלות של שינוי הצורה של מערך אלקטרודות כדי לייעל את צרכי ניסוי מגוונים. הסדרים אלקטרודה אישית מותאמים בצורה אופטימלית עבור ניסויים ספציפיים ניתן ליצור בקלות. התאמה אישית עבור ניסויים ספציפיים שעלול לשלב EEG עם צינורית למסירת תרופה מכוונת עבור תרופתי משולב, electroencephalographic, ומחקרים התנהגותיים. ²⁷ headpieces, מתאמים, ניתוחים מותאמים בקלות למספר רחב של מחקרים כאשר בעקבות השיטות שתוארו בפרוטוקול לעיל . יתרון עיקרי שני של מערכת רכישה זו הוא העלות הנמוכה שלה. נכון לעכשיו, מערכת רכישה זו יכולהשיא 128 ערוצי קלט על עד 4 כבלים נפרדים, המתיר הקלטות בו זמנית מ -4 עכברים או אם רוצים, חולדות עם רשתות צפיפות גבוהה יותר. רחבה כזו הייתה רק דורשת כבלים ומתאמים נוספים.

גישה זו הרכישה בצפיפות גבוהה EEG כתובות חסרונות של שיטות רכישה בצפיפות גבוהה אחרות EEG בעכברים. המערכת המתוארת בעבודה זו נבנית בלי בעיות עם חומרים פשוטים ומשתמשת חומרת קוד פתוחה ותוכנה כי הוא זול ויציב, מאפשרת מדידות חוזרות באותו החיה במשך חודשים, מאפשרת תנועה חופשית במהלך ניסוי, ואינה דורשת עכברים להיות הרדים להקלטה. מגבלות של מערכת זו הן שזה יאומת רק עד כה בעכברים שוקלים 20 גרמו או יותר, והם מעל גיל 12 שבועות. קטנים או צעירים עכברים עלולים להתקשות עם השתלת כיסוי הראש. מגבלה משנית של מתודולוגיה זו היא חוסר היכולת לשלוט עומק אלקטרודה דווקא אחרי headpייצור iece. עם זאת, מגבלה אותה זה מתייחס אליהם אלקטרודות EEG בורג המסורתית מאז אין דרך בדיוק לדעת את עומק בורג טרום מורטם יחסית אל פני השטח קליפת המוח. פתרון בעיות בשיטה זו בדרך כלל כרוכה מיגון אות להתערב כראוי מן העכבר כאשר קשור על מנת לקבל אות רעש חינם.

מערכי EEG בצפיפות גבוהה חיוניים ניתוחי spatiotemporal המורכבים של נתוני ה- EEG כי הם דבר שבשגרה בפרשנות EEG המודרנית. בעוד פריסה המרחבית של פוטנציאל חזותי עורר מודגמת, נתונים רכשו באמצעות מערכת זו ניתן לנתח באמצעות טכניקות הדמית מקור חשמל ואמצעי קישוריות עצביות. הפחתה של 60% עד 70% בשטח מגע בין פיני אלקטרודה אלה לעומת קשר בורג מסורתי מאפשרת לוקליזציה אות מדויקת יותר, כפי שמוצגת באיור 4. העסקת טכניקות אנליטיות בצפיפות גבוהה בעכברים מהונדסים גנטי, בעקבות Pharmacolהתערבות ogical, או בחיות עם פתולוגיה מהותי כגון התקפים יכולים לעזור להבחין המנגנונים ליצירת תנודות קליפת מוח ספציפיים, למקם מקורות ERPs והרווח למניה, ולחשוף מאפייני רשת בקנה מידה גדולה. על ידי מערכות אנושיות במעיין קבלה טובה יותר, גישה זו תשפר במודלים של בעלי חיים קטנים של לנוירופיזיולוגיה האדם בנוירופתולוגיה, מתן תרגום קל של תגליות במודלים של מכרסמים רלוונטיים מדעי קלינית בבני אדם.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
32 Channel RHD2132 amplifier headstage	Intan Technologies	C3314
Aquistion Board	Open Ephys	v2.2
100 Position Receptable Connector	Digi-Key	ED85100-ND	Headpiece
Acetone (1 L)	Sigma Aldrich	179973-1L
Razor Blade (100 pack)	McMaster Carr	3962A4
Wire-Cutting Pliers	MSC Industrial	321786
2-Part Epoxy	McMaster Carr	7605A18
PFA Coated Silver Wire (25 ft)	A-M Systems	787000	EMG Wire
CircuitWriter Pen	MCM Electronics	200-175	Silver Applicator for Electrode Tips
36 Position Dual Row Male Nano-Miniature Connector	Omnetics Connector Corporation	A79028-001	Headpiece to Amplifier Adapter
Conn Strip Header 2 x 50	Digi-Key	ED83100-ND	Headpiece to Amplifier Adapter
Clidox Base and Acitvator	Pharmacal	95120F & 96120F	Sterilant
Isoflurane	Priamal Enterprises Ltd	66794-019-10
Oxygen	Airgas	OX USP300
Closed Loop Temperature Controller	CWE Inc.	08-130000
Curved Scissors	FST	14085-09
0.25% Bupivicaine Hydrochloride	Hospira	0409-1159-02	Local Anesthetic
Meloxicam 5mg/ml	Henry Schein	6451602845	Pain/Inflammation Relief
0.9% Sodium Chloride	Hospira	0409-4888-20	Fluids
Cefazolin	Hospira	0409-0806-01	Antibacterial
No.11 Disposable Scapel (20 pk)	Feather	2975#11
Micro Serrefines	FST	18052-3
Cotton Swabs (1,000 pk)	MSC Industrial	8749574
0.5 mm Micro Drill Bit	FST	19007-05
Stereotaxic Drill	Kopf	Model 1471
Curved Forceps	Roboz	RS-5136
Methyl Methacrylate	A-M Systems	525000	Cement for headpiece
Methyl Methacrylate Crosslinking Compound	A-M Systems	526000
Curved Hemostats	FST	13003-10	Aide in Adapter Connection
RHD2000 standard SPI interface cable (3ft)	Intan Technologies	C3203
Cantilever Arm	Instech	MCLA
Micro Spatula (12 pk)	Fischer Scientific	S50822
Digital Soldering Station	MCM Electronics	21-10115
Rosin Core Solder 60/40 Tin/Lead	MCM Electronics	21-1045
Color Craze Nail Polish with Hardeners (Nitrocellulose based)	L.A. Colors	CNP508
Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console	Kopf	Model 940