على نطاق الجينوم التحوير بوساطة "تحليل المانع هداك" ميكرورناس ومرناس في "ب الخلايا التي يسببها" للخضوع تبديل فئة جزئ الحمض النووي وتمايز خلية البلازما

Summary

عوامل جينية يمكن أن تتفاعل مع البرامج الوراثية لتعدل التعبير الجيني وتنظيم وظيفة الخلية ب. من خلال الجمع بين التحفيز في المختبر ب-الخلايا وقرة-بكر، والفائق microRNA-تسلسل ونهجا مرناً-تسلسل، يمكننا تحليل جينية تحوير التعبير ميرنا والجينات في الخلايا باء.

Abstract

يتم إنجاز استجابات الأجسام المضادة من خلال العديد من العمليات الحرجة الخلية ب-الذاتية، بما في ذلك هايبرموتيشن جسدية (SHM)، وتبديل فئة جزئ الحمض النووي (CSR)، وتمايز خلية البلازما. تم في السنوات الأخيرة، أظهرت تعديلات جينية أو عوامل مثل هيستون ديسيتيليشن وميكرورناس (ميرناس)، للتفاعل مع البرامج ب-الخلايا الوراثية لتشكيل جسم الاستجابات، بينما تم العثور على اختلال وظيفي لعوامل جينية تؤدي إلى استجابات الأجسام. تحليل التعبير على نطاق الجينوم ميرنا ومرناً في الخلايا ب ردا على المغيرون جينية مهم لفهم تنظيم استجابة الدالة وجسم ب-خلية جينية. هنا، علينا أن نظهر بروتوكول لحفز الخلايا ب الخضوع للتمييز بين المسؤولية الاجتماعية للشركات، وخلايا البلازما، علاج هذه الخلايا ب مع مثبطات هيستون deacetylase (هداك) (دعم)، وتحليل التعبير مرناً وميكرورنا. في هذا البروتوكول، نحن نحلل مباشرة مكملة تسلسل الحمض النووي (كدنا) استخدام تكنولوجيات seq ميرنا، والجيل المقبل مرناً التسلسل (مرناً-seq) يقرأ تعيين تسلسل الجينوم، وكمية النسخ العكسي (قرة)-بكر. مع هذه النهج، حددنا في الخلايا ب الناجمين عن الخضوع للمسؤولية الاجتماعية للشركات، وتمايز خلايا البلازما، المبادرة، منظم جينية، بشكل انتقائي ينظم التعبير ميرنا ومرناً ويغير تمايز خلية البلازما والمسؤولية الاجتماعية للشركات.

Introduction

علامات جينية أو عوامل، مثل التعديلات هيستون بوستترانسلاشونال مثلايشن الحمض النووي والكشف غير الترميز (بما في ذلك ميكرورناس)، تعدل وظيفة الخلية بتغيير التعبير الجيني¹. تعديلات جينية تنظيم وظيفة باللمفاويات، مثل جزئ الحمض النووي تبديل الطبقة الغلوبولين المناعي (CSR)، هايبرموتيشن جسدية (SHM) والتمايز إلى خلايا الذاكرة ب أو خلايا البلازما، وبالتالي تحوير بجسم والأجسام الردود^2،3. المسؤولية الاجتماعية للشركات و SHM خطيرة تتطلب ديامينان سيتيديني التي يسببها التنشيط (المعونة، ترميز كأيكدا)، الذي هو الناجم عن درجة عالية في الخلايا ب استجابة لتعتمد على T والمستقلة T المستضدات⁴. الفئة-تحولت/هايبرموتاتيد ب خلايا أخرى تفرق في خلايا البلازما، التي تفرز كميات كبيرة من الأجسام المضادة بطريقة يتوقف بصورة حاسمة على البروتين نضوج المستحثة اللمفاويات ب 1 (Blimp1، ترميز ك Prdm1)⁵. قد يؤدي تغييرات جينية غير طبيعي في الخلايا ب استجابات جسم/الأجسام الشاذة، التي يمكن أن تؤدي إلى استجابة الحساسية أو المناعة الذاتية^1،4. فهم عوامل جينية كيف، مثل ميرناس، تعدل الخلية ب-الذاتية التعبير الجيني ليس هاما لتطوير اللقاحات، ولكن ضروري أيضا للكشف عن آليات استجابات جسم طبيعي/الأجسام المحتملة.

هيستون acetylation وديسيتيلاتيون بتعديلات مخلفات يسين على البروتينات هستون عادة ما تحفزها acetyltransferase هستون (هات) و deacetylase هيستون (هداك). هذه التعديلات تؤدي إلى إمكانية الوصول إلى تزايد أو تناقص من الكروماتين وكذلك السماح أو منع ربط عوامل النسخ أو البروتينات للحمض النووي وتحوير الجينات التعبير^{5،6، 7 , 8}-مثبطات هداك (المبادرة) هي فئة من المركبات التي تتداخل مع وظيفة هداكس. هنا، نحن تستخدم المبادرة (جيش فيتنام الشعبي) لمعالجة تنظيم هداك الشخصية التعبير الجيني الجوهرية من خلايا ب وآليتها.

ميرناس هي الصغيرة، غير الترميز الكشف ما يقرب من 18 إلى 22 النيوكليوتيدات في المدة التي يتم إنشاؤها من خلال عدة مراحل. ميرنا المضيفة جينات يتم نسخها وشكل دبوس ميكرورناس الأولية (pri-ميرناس). أنها تصدر إلى السيتوبلازم، حيث تتم معالجة pri-ميرناس كذلك إلى السلائف ميرناس (ما قبل-ميرناس). وأخيراً، تتشكل ميرناس ناضجة من خلال الانقسام من قبل--ميرناس. ميرناس الاعتراف بتسلسل التكميلية داخل المنطقة 3 ' غير مترجمة على^6،مرناس الهدف⁷. من خلال إسكات بوستترانسكريبشونال، ميرناس تنظيم النشاط الخلوي، مثل انتشار، والتمايز، والمبرمج^10،11. منذ ميرناس متعددة يمكنك استهداف نفس مرناً، وميرنا واحد واحد يمكن أن يحتمل أن تستهدف مرناس متعددة، من المهم أن يكون رأياً في سياق تعريف التعبير ميرنا لفهم قيمة الفرد والجماعية أثر ميرناس. ميرناس أظهرت أن تشارك في التنمية ب-الخلية والتمايز هامشية، فضلا عن ب-الخلية الخاصة بمرحلة التمايز واستجابة الأجسام المضادة والمناعة الذاتية^1،،من⁴⁹. في 3 ' UTR أيكدا و Prdm1، هناك عدة مواقع تقحم المصانة تم التحقق من صحتها أو المتوقعة التي يمكن أن تكون مستهدفة من قبل ميرناس⁸.

تعديل جينية، بما في ذلك التعديل بعد انتهاء النسخ هيستون وميرناس، عرض نمط لائحة الخاصة بالمرحلة من نوع الخلية والخلية من التعبير الجيني⁹. هنا، يمكننا وصف أساليب لتحديد تعديل المبادرة بوساطة ميرنا والتعبير مرناً والمسؤولية الاجتماعية للشركات، وتمايز خلية البلازما. وتشمل هذه البروتوكولات لحفز خلايا ب الخضوع للمسؤولية الاجتماعية للشركات، وتمايز خلية البلازما؛ لعلاج الخلايا ب مع مبادرة التنمية البشرية؛ ومن أجل تحليل التعبير ميرنا ومرناً ببكر قرة وميرنا seq seq مرناً^{10،11،12،،}من⁸¹³.

Protocol

البروتوكول المبادئ التوجيهية الرعاية الحيوانية "مؤسسات الرعاية الحيوانية" و "استخدام اللجان التابعة" لجامعة تكساس مركز علوم الصحة في سان أنطونيو.

1. "تحفيز الخلايا ب الماوس" للمسؤولية الاجتماعية للشركات، والتمايز خلية البلازما، ومعاملة المبادرة

1. إعداد تعليق خلية الطحال
   ملاحظة: تنفيذ كافة الخطوات في غطاء الاندفاق الصفحي باستثناء الماوس القتل الرحيم والتشريح.
   1. يوثانيزي محددة خالية من العوامل الممرضة C57BL/6J الماوس (8-12 أسبوعا عمر) باستنشاق أول أكسيد الكربون ₂.
   2. تقع على عاتق الماوس على متنها تشريح البطن الأعلى. دبوس كل أربعة أقدام للماوس مع 18-قياس 1.5 في إبر الإبر.
   3. تعقيم الجلد باستخدام مناديل غارقة في الإيثانول 70%-
   4. استخدام مجموعة واحدة من الأدوات الجراحية يعقم (ملقط ومقص تشريح) لقطع طريق الجلد أسفل القفص الصدري تصور الطحال (في الجانب الأيسر من البطن أسفل الكبد)-
   5. استخدام ملقط معقم آخر والمقص المقص لاستخراج الطحال، التي تقع تحت انحناء أكبر من المعدة، لقط الطحال بلطف مع الملقط وقطع جميع أنسجة الربط مع تشريح. تأكد من إزالة جميع الأنسجة الاتصال-
   6. مكان الطحال في أنبوب 1.5 مل ميكروسينتريفوجي التي تحتوي على 1,000 ميليلتر الكامل RPMI1640 المتوسطة (المتوسط RPMI 1640 تستكمل مع مصل العجل الجنين إبطال الحرارة 10% (FBS)، 2 مم ل الجلوتامين، 100 ميكروغرام/مل البنسلين، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين و 0.25 ميكروغرام/مل الامفوتريسين ب 50 ميكرومتر β-ميركابتوثانول)-
   7. وضع مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب 50 مل البوليبروبيلين مخروطية أجهزة الطرد مركزي وصب الطحال من أنبوب ميكروسينتريفوجي على مصفاة الخلية. استخدام غيض من أنبوب الطرد المركزي المخروطية البوليبروبيلين 15 مل إلى الهريس بلطف الطحال من خلال المصفاة. شطف مصفاة الخلية مع 15 إلى 20 مل متوسطة كاملة-
   8. زيادة ونقصان لأسفل الخلايا في 350 غ س لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية.
   9. إزالة خلايا الدم الحمراء من تعليق خلية الطحال. ريسوسبيند بيليه الخلية في المخزن المؤقت لتحلل ACK (5 مل في الطحال). احتضان لمدة 4 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الهز عرضية واخماد ثم مع 25 مل متوسطة كاملة-
   10. تدور أسفل الخلايا في 350 غ س لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية. ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 أو 10 مل من المتوسطة كاملة. عد الخلايا قابلة للتطبيق باستخدام هيموسيتوميتير.
2. العزلة ب-خلية
   ملاحظة: "ب عزل" الخلايا بالانتقاء السلبي بعد الشركة المصنعة ' تعليمات s. وتستهدف الخلايا ب عدم لإزالة مع بيوتينيلاتيد الأجسام المضادة الموجهة ضد الخلايا غير ب (CD4، CD8، CD11b، CD43، CD49b، CD90.2، Ly-ج 6/غرام (غرام-1) و TER119) وجزيئات مغناطيسية المغلفة ستريبتافيدين.
   1. تحضير تعليق خلية 0.25 إلى 2 مل 1 × 10 ⁸ خلايا/مل في المتوسط كاملة في البوليسترين معقم 5 مل (12 × 75 مم) جولة لأسفل الأنبوبة. إضافة مصل الفئران العادية (50 ميليلتر/mL) للعينة.
   2. إضافة 50 ميليلتر/mL العزلة كوكتيل للعينة. مزج الخلايا بلطف بيبيتينج أعلى وأسفل 2-3 مرات واحتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 10
   إضافة
   3. ميليلتر/مل 75 المغلفة ستريبتافيدين من الجزيئات المغناطيسية للعينة. مزج الخليط بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً 2-3 مرات واحتضانها ل 2.5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
   إضافة
   4. كاملة RPMI 1640 المتوسطة. مزج الخلايا بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً 2-3 مرات-
   5. وضع الأنبوب (بدون الغطاء) في المغناطيس واحتضان في درجة حرارة الغرفة ل 2.5 كحد أدنى من أجل إيقاف المادة طافية تتضمن متأثر ب الخلايا في أنبوب 15 مل مخروطية الشكل جديد.
   6. عد الخلايا قابلة للتطبيق باستخدام هيموسيتوميتير ووصمة عار تريبان الأزرق. تقييم نقاء الخلايا ب بالتدفق الخلوي تحليل الواسمات السطحية ب-الخلية، مثل B220 و CD19.
3. ب-خلية التحفيز ومعاملة المبادرة
   1. ريسوسبيند الخلايا ب المنقاة في المتوسط RPMI 1640 كاملة بتركيز 0.3 × 10 ⁶ خلايا/مل نهائي.
   2. استخدام لوح ثقافة 48-جيدا خلية للخلية والثقافة. لكل بئر، أضف 1 مل المنقي ب-خلية تعليق (0.3 × 10 ⁶ خلايا/مل) أو لبس (3 ميكروغرام/مل تركيز النهائي) من الإشريكيّة القولونية، وايل-4 (5 نانوغرام/مليلتر تركيز النهائي)، و 0 أو 500 ميكرومتر المبادرة (حمض فالبرويك؛ جيش فيتنام الشعبي)-
   3. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO ₂ ح 60 قرة-بكر وتحليل الفائق مرناً-وميرنا-التسلسل، أو 96 ساعة لتحليل التدفق الخلوي-
4. تدفق التحليل الخلوي للمسؤولية الاجتماعية للشركات، وتمايز خلية البلازما
   1. بعد 96 ساعة ثقافة، فصل الخلايا من كل بئر من بيبيتينج الخلايا صعودا وهبوطاً عدة مرات. نقل تعليق خلية في أنبوب 1.5 مل ميكروسينتريفوجي. وتدور أسفل الخلايا في 350 غ س لمدة 5 دقائق مقاعد البدلاء-أعلى للطرد مركزي باستخدام تجاهل المادة طافية.
   2. ريسوسبيند في الخلايا التي تحتوي على 100 ميليلتر هبس المخزن المؤقت الذي يحتوي على جيش صرب البوسنة 1% و 0.5 نانوغرام/مل فلوريسسين (FITC)- الماعز مترافق المضادة للأجسام المضادة IgM – الماوس (Ab) ، اللوفيكوسيانين نانوغرام/مليلتر 0.2 (APC)-الماوس لمكافحة الفئران مترافق IgG1 [مونوكلونل] Ab (ماب)، 0.2 phycoerythrin نانوغرام/مليلتر (PE)-مترافق ماب B220 الماوس لمكافحة الجرذان والفئران PE-Cy7-مترافق نانوغرام/مليلتر 0.2 الماوس المضادة CD138 ماب 2 نانوغرام/مل 7-أمينواكتينوميسين د (7-عاد).
   3. احتضان الخلايا مع مترافق fluorescence الأجسام المضادة (الخطوة 1.4.2) في الظلام في درجة حرارة الغرفة عن 30 دقيقة
   4. تغسل الخلايا مع 1 مل حبس مع جيش صرب البوسنة 1%-
   5. زيادة ونقصان لأسفل الخلايا في 1,500 س ز لمدة 5 دقائق باستخدام أجهزة الطرد المركزي benchtop وتجاهل المادة طافية.
   6. ريسوسبيند الخلايا في 300 ميليلتر من حبس مع جيش صرب البوسنة 1% ونقل تعليق خلية إلى أنبوب البوليستيرين القاع المستديرة. تغطية الأنبوب مع إحباط لتجنب التعرض للضوء.
   7. تنفيذ التدفق الخلوي التحليل على تعليق خلية واحدة. جمع الأحداث 50,000 لكل عينة التعويض والأحداث 250,000 للعينات الأخرى. تحليل البيانات باستخدام برنامج المعدات.
   8. إزالة الحطام ودوبليتس باستخدام بوابة هندسة نبض (منتدى التعاون الأمني-ح س منتدى التعاون الأمني-أ وال SSC-ح س ال SSC-أ). على نحو مناسب من بوابة المؤامرة على 7-عاد استبعاد الخلايا الميتة.

2. الفائق مرناً-Seq

ح

1. بعد 60 من الثقافة، استخراج الجيش الملكي النيبالي إجمالي من 2-4 × 10 ⁶ الخلايا باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي الريبي مجموع يمكن استرداد رنا الصغيرة عقب الشركة المصنعة ' تعليمات s. وتشمل الدناز أنا خطوة العلاج.
2. التحقق من سلامة الحمض النووي الريبي استخدام بيواناليزير، عقب الشركة المصنعة ' تعليمات s-
3. استخدام 500 1,000 نانوغرام من مجموع الجيش الملكي النيبالي عالية الجودة (عدد سلامة الحمض النووي الريبي رين > 8.0) لتسلسل الحمض النووي الريبي عينة إعداد مكتبة مع الحمض النووي الريبي تجارية فطقم مندوب عقب الشركة المصنعة ' تعليمات s-
4. تجمع المكتبات seq مرناً الفردية استناداً على أجزاء كل منها 6-bp مؤشر من المحولات وتسلسل المكتبات في 50 شركة بريتيش بتروليوم/تسلسل. استخدام نظام الفائق الحمض النووي وفقا للشركة المصنعة ' البروتوكولات s-
5. بعد تشغيل التسلسل، ديمولتيبليكس مع كاسافا لإنشاء ملف فستق لكل عينة. القيام بما يلي: رسم الخرائط، وتحليل المعلوماتية الحيوية، كما هو مبين سابقا ¹¹-
6. محاذاة كل القراءات التسلسل مع على مرجع الجينوم (mm9 بناء جينوم الفأر التسخن) باستخدام الإعدادات الافتراضية TopHat2 ¹⁴. معالجة الملفات أم من المحاذاة باستخدام العد هتسيق الحصول على التهم كل الجينات في جميع العينات-

3. ميرنا الفائق-Seq

1. استخدام 100 نانوغرام-1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي عالية الجودة الإجمالية، كما أعدت في الخطوة 2-1، لإعداد مكتبة تسلسل الحمض النووي الريبي الصغيرة باستخدام مجموعة تسلسل الحمض النووي الريبي صغيرة تجارية-
2. ليجت 3 تحولت ' محول إلى 5 ′ ينتهي جزيئات الحمض النووي الريبي الصغيرة البدء مع مجموعة أدوات ربط تجارية. سد 5 تحولت ' محول إلى 3 ′ ينتهي جزيئات الحمض النووي الريبي الصغيرة البدء مع مجموعة أدوات ربط تجارية. تحويل الجيش الملكي النيبالي لكدنا بالنسخ العكسي وتضخيم المكتبة تسلسل الحمض النووي الريبي صغيرة من [بكر] تضخيم مع مجموعات تجارية-
3. استخدم 6% TBE هلام صفحة أصلية لعزل المكتبة تسلسل الحمض النووي الريبي الصغيرة النهائي. تشغيل الهلام مع المخزن المؤقت X TBE 1 في 200 الخامس حتى تقترب الفرقة بروموفينول الأزرق تتبع صبغ الجزء السفلي من الهلام (0.5-1 سم)-
4. إزالة الجل من ألواح الزجاج ووصمة عار مع اثيديوم بروميد (0.5 ميكروغرام/مل في المياه) في حاوية نظيفة لتصور الجل الفرق في ترانسيلوميناتور الأشعة فوق البنفسجية أو صك آخر من الوثائق جل كحد أدنى 2-3-
5. قطع من الفرقة ~ 150-بي بي باستخدام الشفرة نظيفة ووضعه في أنبوب 1.7 مل.
6. استخراج الحمض النووي استخدام مجموعة أدوات استخراج هلام لإرشادات الشركة المصنعة.
7. التحقق من توزيع حجم المكتبة النهائي مع فحص الحمض النووي حساسية عالية تجارية والتركيز مع الإنزيم دسدنا تجارية كل المصنعين ' الإرشادات.
8. تجمع المكتبات للتضخيم وتسلسله لاحقة تشغيل مع نظام تسلسل الحمض النووي الفائق تجارية للشركة المصنعة ' البروتوكولات s-
9. ديمولتيبليكس مع كاسافا لإنشاء ملف فاستق لكل عينة الواحدة والشركة المصنعة ' البروتوكولات s-
10. لتحليل الحمض النووي الريبي seq الصغيرة كل عينة، استخدام وميض لمحاذاة رنا الصغيرة الواحدة والشركة المصنعة ' s البروتوكولات.
    1. إزالة ما يلي: أن يتم محاذاة للملوثات، مثل الميتوكوندريا، الرنا الريباسي، كبسولة تفجير، وهلم جرا.
    2. محاذاة البيانات إلى أن تنضج متواليات ميرنا.
    3. محاذاة البيانات إلى تسلسل حلقة دبوس (ميرنا السلائف).
    4. محاذاة البيانات إلى أخرى صغيرة الحمض النووي الريبي متواليات (باستخدام قاعدة بيانات فرنا) ¹⁵-
11. بعد جميع العينات كمياً، تعريف ميرناس أعرب التفاضلية بين المجموعات/عينات مختلفة. التنبؤ ميرناس التي تستهدف مرناس المحدد أو مرناس التي يمكن أن تكون مستهدفة من قبل انتقائية ميرنا استخدام أدوات التنبؤ الهدف ميرنا عبر الإنترنت، مثل تارجيتسكان ¹⁶ ومصغرا ¹⁷ بيكتار ¹⁸ .
12. إذا كان هناك حاجة إلى تحليل الشرح أو مسار وظيفي، يقدم الجينات المتوقعة لتحليل "مسار الإبداع" (IPA) أو ديفيد-

4. الكمية RT-PCR (قرة-PCR) مرناس وميرناس

1. قرة-PCR تحليل مرناً
   1. "استخراج الحمض النووي الريبي" من 0.2-5 × 10 ⁶ الخلايا باستخدام عزل الحمض النووي الريبي إجمالي تجاري كيت التي يمكن استرداد رنا الصغيرة، بعد الشركة المصنعة ' تعليمات s. وتشمل الدناز أنا خطوة العلاج.
   2. توليف كدنا من مجموع الجيش الملكي النيبالي مع نظام توليف كدنا حبلا أول استخدام التمهيدي اليغو-dT.
   3. قياس كدنا قبل بكر qRT مع الإشعال المناسبة، باستخدام 2 x ميكس سيد بكر في الوقت الحقيقي مع البروتوكول التالي: 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، دورات 40 94 درجة مئوية لمدة 10 s، 60 درجة مئوية لمدة 30 s، و 72 درجة مئوية لمدة 30 س.
   4. القيام باقتناء البيانات أثناء الخطوة ملحق 72 درجة مئوية، وإجراء تحليل منحنى ذوبان من 72 إلى 95 ° C.
2. تحليل PCR قرة ميرنا
   1. "الكوة الجيش الملكي النيبالي" من العينات التي تم إعدادها في الخطوة 4.1.1.
   2. عكس نسخ الجيش الملكي النيبالي في كدنا. استخدام أدوات نسخ عكسي microRNA تجارية، عقب الشركة المصنعة ' تعليمات s-
   3. إجراء PCR الوقت الحقيقي ميكرورنا باستخدام مزيج "الأخضر سيبر" سيد بكر في الوقت الحقيقي مع 250 نانومتر ميرنا ناضجة إلى الأمام الإشعال بالاقتران مع تمهيدي عكس عالمية.
      1. ذوبان الجليد 2 x ميكس سيد بكر، ميرنا محددة التمهيدي إلى الأمام، وعكس العالمي التمهيدي في درجة حرارة الغرفة. مزيج الحلول الفردية-
      2. إعداد مزيج رد فعل على النحو التالي لوحدة تخزين 25 ميليلتر الواحدة وكذلك فعل (المستخدمة في لوحات بكر 96-جيدا):
         2 × 12.5 ميكس ماجستير بكر ميليلتر
         ميرنا الأمام الإشعال (2.5 ميكرومتر) ميليلتر 2.5
         عالمية عكس التمهيدي (2.5 ميكرومتر) ميليلتر 2.5
         RN ميليلتر خالية من بورصة عمان water5
      3. ميكروليتر 22.5 إضافة رد فعل مزيج لصفيحة بكر 96-جيدا. إضافة 2.5 ميليلتر من قالب كدنا (50 نانوغرام pg-3) إلى الآبار لوحة الفردية-
      أحكام ختم
      4. الفيلم لوحة. الطرد المركزي في اللوحة لمدة 1 دقيقة ب 000 1 × ز ودرجة حرارة الغرفة.
      5. وضع اللوحة في cycler في الوقت الحقيقي، وبدء برنامج ركوب التالية: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، دورات 40 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 55 درجة مئوية لمدة 30 s، و 72 درجة مئوية لمدة 30 س.
   4. استخدم الأسلوب ΔΔCt لتحليل البيانات قرة-PCR مع جدول بيانات. تطبيع التعبير عن ميرناس ذات الصلة إلى التعبير عن الصغيرة النووية/النوية Rnu6 الكشف/RNU61/2، Snord61/SNORD61، Snord68/SNORD68، و Snord70/SNORD70-
3. التحليل الإحصائي
   1. إجراء تحليل إحصائي لتحديد قيم p إقران ومزاوج الطالب ' s t- اختبار باستخدام جدول بيانات والنظر في القيم ف < 0.05 كما كبير-

النتائج

استخدام لدينا بروتوكول، تنقية الخلايا ب وضعها مع لبس (3 ميكروغرام/مل)، وايل-4 (5 نانوغرام/مل) ليمكن أن يستحث ح 96 30-40 ٪ من المسؤولية الاجتماعية للشركات إلى IgG1 و ~ 10% من تمايز خلية بلازما. بعد العلاج مع المبادرة (500µM جيش فيتنام الشعبي)، المسؤولية الاجتماعية للشركات إلى IgG1 انخفض إ?...

Discussion

يوفر هذا البروتوكول نهج شاملة للحث على تبديل فئة بالخليه وتمايز خلية البلازما؛ لتحليل تأثيرها بجينيه المغيرون، إلا وهي مبادرة التنمية البشرية؛ والكشف عن أثر المبادرة على التعبير مرناً وميرنا في هذه الخلايا. معظم هذه النهج يمكن استخدامها أيضا لتحليل تأثير عوامل جينية في التعبير الدالة و?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 mice	Jackson Labs	664
Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine)	Fisher Scientific	MT 10-040-CV
FBS	Hyclone	SH300
HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL	Fisher Scientific - Hyclone	SV3007901
β-Mercaptoethanol	Fisher Scientific	44-420-3250ML
Falcon Cell Strainers	Fisher Scientific	21008-952
Trypan Blue Stain 0.04%	GIBCO/Life Technologies/Inv	15250
ACK Lysis Buffer	Fisher Scientific	BW10-548E
Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber	Fisher Scientific	02-671-51B
EasySep Magnet	Stem Cell Technologies	18000
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap	Fisher Scientific	14-959-1A
EasySep Mouse B cell Isolation Kit	Stem Cell Tech	19854
BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box	BD Biosciences	305199
PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody	BioLegend	142513 (25 ug)
PE-Cy7 B220 antibody	BioLegend	103222
7-AAD (1 mg)	Sigma Aldrich	A9400-1MG
APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody	Biolegend	103212
Mouse APC-IgG1 200 µg	Biolegend	406610
FITC anti-mouse IgM Antibody	Biolegend	406506
FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody	Biolegend	103206
PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2)	Biolegend	103208
HBSS 1X	Fisher Scientific	MT-21-022-CM
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated	Fisher Scientific	BP1600-100
LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5)	Sigma Aldrich	L2880-25MG
Recombinant mouse IL-4 (carrier-free)	BioLegend	574302 (size: 10 ug)
Valproic acid sodium salt	Sigma Aldrich	P4543
SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet	The Baker Company	SG404
Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator	Thermo Scientific	3950
Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205	Fisher Scientific	15-462-5Q
5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube	Fisher Scientific	14-959-5
Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	05-538-59A
1.7 mL Microtube, clear	Genesee	22-282
Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml	Fisher Scientific	06-443-18
ELMI SkySpin CM-6MT	ELMI	CM-6MT
Rotor 6M	ELMI	6M
Rotor 6M.06	ELMI	6M.06
Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller	Drummond Scientific	4-000-101
25 mL serological pipette tips	Fisher Scientific	89130-900
10 mL serological pipette tips	Fisher Scientific	89130-898
5 mL serological pipette tips	Fisher Scientific	898130-896
48-well plates	Fisher Scientific	07-200-86
Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated	Beckman Coulter	366802
GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance	Beckman Coulter	366650
Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated	Beckman Coulter	369434
TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle	Beckman Coulter	368298
Fisher Scientific AccuSpin Micro 17	Fisher Scientific	13-100-675
Fisher Scientific Analog Vortex Mixer	Fisher Scientific	02-215-365
miRNeasy Mini Kit (50)	Qiagen	217004
Direct-zol RNA MiniPrep kit	Zymo Research	R2050
Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology)	Fisher Scientific	BP1145-1
Rnase-Free Dnase set (50)	QIAGEN	79254
NanoDrop 2000 Spectrophotometers	Thermo Scientific	ND-2000
Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR	Invitrogen	175013897
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-rad	172-5121
Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25	Fisher	14-230-244
Microseal 'B' Adhesive Seals	Bio-Rad	MSB-1001
MyiQ Optics Module	Bio-Rad	170-9744
iCycler Chassis	Bio-Rad	170-8701
Optical Kit	Bio-Rad	170-9752
BD LSR II Flow Cytometry Analyzer	BD Biosciences
FACSDiva software	BD Biosciences
FlowJo 10	BD Biosciences
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2943CA
S200 Focused-ultrasonicator	Covaris	S200
SPRIworks Fragment Library System I for Illumina	Beckman Coulter	A288267
cBot Cluster Generation Station	illumina	SY-312-2001
HiSeq 2000 Genome Sequencer	Illumina	SY-401-1001
TruSeq RNA Library Prep Kit v2	Illumina	RS-122-2001
TruSeq Small RNA Library Prep Kit	Illumina	RS-200-0012
NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3	Bioo Scientific	5132-05
2200 TapeStation	Agilent	G2964AA