JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Epigenetik faktörler gen ekspresyonu modüle ve B hücre işlevi düzenleyen genetik programlarla etkileşim kurabilirsiniz. İçinde vitro B hücreli stimülasyon, qRT-PCR ve yüksek-den geçerek mikroRNA-sıra ve mRNA-sıra yaklaşımlar birleştirerek, B hücreleri miRNA ve gen ifadesinde epigenetik modülasyon analiz edebiliriz.

Özet

Antikor yanıt somatik Hipermutasyon (SHM), sınıf-anahtarı DNA rekombinasyon (CSR) ve Plazma hücre farklılaşma da dahil olmak üzere birkaç kritik B hücre-içsel süreçleri gerçekleştirilir. Son yıllarda epigenetik değişiklikler veya faktörlere Histon deasetilasyonu ve mikroRNA (miRNAs), B hücreli genetik programlar şekil antikor yanıt,'epigenetik faktörler disfonksiyon neden tespit edilmiştir iken etkileşimde gösterilmiştir antikor yanıt. B hücreleri epigenetik modülatörler cevaben genom çapında miRNA ve mRNA ifade analiz B hücreli işlev ve antikor yanıtı epigenetik Yönetmeliği anlamak için önemlidir. Burada, biz KSS ve Plazma hücre farklılaşması geçmesi B hücreleri inducing, Histon deacetylase (HDAC) inhibitörleri (HDIs) ile bu B hücreleri tedavi ve mRNA ve mikroRNA ifade analiz için bir protokol göstermek. Bu protokol için doğrudan yeni nesil mRNA sıralama (mRNA-seq) ve miRNA-seq teknolojileri, nasıl yapılacağını eşleme okur genom ve nicel ters transkripsiyon (qRT) kullanarak Tamamlayıcı DNA (cDNA) dizileri analiz-PCR. Bu yaklaşımlar ile CSR ve Plazma hücre farklılaşması geçmesi indüklenen B hücrelerde HDI, epigenetik bir regülatör, seçmeli olarak miRNA ve mRNA ifade modüle ve CSR ve Plazma hücre farklılaşması değiştirir, tanımladınız.

Giriş

Epigenetik işaretleri veya DNA metilasyonu, Histon ardından değişiklikler ve kodlamayan RNA'ların (mikroRNA'lar da dahil olmak üzere), gibi faktörler, hücre işlevi gen ifade1değiştirerek modüle. Epigenetik değişiklikler immünglobulin sınıf--düğme DNA rekombinasyon (CSR), somatik Hipermutasyon (SHM) ve bellek B hücreleri veya plazma hücreleri antikor ve antikor böylece oransal, farklılaşma gibi B lenfosit fonksiyon düzenleyen yanıt-e doğru2,3. CSR ve SHM eleştirel Etkinleştirme indüklenen sitidin birdeaminaz (yardım, Aicdakodlanmış), son derece B hücreleri T-bağımlı ve T-bağımsız antijenleri4yanıt indüklenen olduğu gerektirir. Sınıf-açık/hypermutated B hücreleri daha fazla 1 (Blimp1, Prdm1kodlanmış)5plazma hücrelerine antikorlar olgunlaşma B lenfosit kaynaklı protein eleştirel bağımlı bir biçimde büyük miktarda salgılar ayırt etmek. B hücreleri anormal epigenetik değişiklikleri Alerjik reaksiyon veya otoimmünite1,4yol açabilir anormal antikor/antikor yanıt neden olabilir. Nasıl epigenetik faktörleri anlama, miRNAs gibi B hücre içsel modüle gen ekspresyonu sadece aşı geliştirme için önemli değildir, ama aynı zamanda potansiyel anormal antikor/antikor yanıt mekanizmaları ortaya çıkarmak için önemlidir.

Histon asetilasyon ve deasetilasyonu değişimleri genellikle Histon asetiltransferaz (şapka) ve Histon deacetylase (HDAC) tarafından katalize Histon proteinleri üzerinde lizin arasında vardır. Bu değişiklikler Kromatin artan veya azalan erişilebilirlik kurşun ve daha fazla izin vererek veya bağlama transkripsiyon faktörleri veya proteinler DNA ve tadilat gen ifade5,6, için 7 , 8. HDAC inhibitörleri (HDI) bir sınıf HDACs fonksiyonu ile müdahale bileşikleri vardır. Burada, HDI (VPA) iç gen ifade profil B hücreleri ve onun mekanizma HDAC Yönetmeliği gidermek için kullanılan.

miRNAs çeşitli aşamalarından oluşturulan küçük, kodlamayan RNA'ların yaklaşık 18-22 nükleotid uzunluğunda vardır. miRNA ana bilgisayar genlerin transkripsiyonu ve saç tokası birincil mikroRNA (PRI-miRNAs) oluşturur. Onlar nerede PRI-miRNAs daha da habercisi miRNAs (pre-miRNAs) işlenir sitoplazma, ihraç edilmektedir. Son olarak, olgun miRNAs pre-miRNAs bölünme meydana gelir. miRNAs onların hedef mRNA'ların6,7' nin 3' Çevrilmeyen bölgesi içindeki tamamlayıcı dizileri tanıdım. Çoğu susturmak aracılığıyla miRNAs yayılması, farklılaşma ve Apoptozis10,11gibi hücresel aktivite düzenleyen. Birden fazla miRNAs aynı mRNA hedefleyebilir ve bir tek miRNA potansiyel olarak birden çok mRNA'ların hedefleyebilirsiniz beri miRNA ifade profil bireysel değerini ve miRNAs toplu etkisini anlamak için bir içerik görünümünü olması önemlidir. miRNAs B-hücre gelişimi ve periferik farklılaşma, hem de B hücreli sahne özgü farklılaşma, antikor yanıt ve otoimmünite1,4,9dahil olduğu gösterilmiştir. 3' UTR'nin Aicda ve Prdm1, miRNAs8tarafından hedeflenen birkaç doğrulanmış veya tahmin edilen evrimsel korunmuş siteleri vardır.

Epigenetik modülasyon Histon sonrası transkripsiyon değişiklik ve miRNAs, dahil olmak üzere, hücre tipi ve hücre sahne özel düzenleme desen gen ifade9görüntüleyin. Burada, HDI aracılı modülasyon miRNA ve mRNA ifade, CSR ve Plazma hücre farklılaşması tanımlamak için yöntemleri açıklanmaktadır. Bunlar B hücreleri CSR ve Plazma hücre farklılaşması geçmesi için ikna için protokol B hücreleri HDI ile tedavi etmek için; ve qRT-PCR, miRNA-seq ve mRNA seq10,11,12,8,13tarafından miRNA ve mRNA ifade analiz etmek için.

Protokol

protokol kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı Komiteler San Antonio, Teksas Sağlık Bilimleri Merkezi Üniversitesi hayvan bakımı kuralları izler.

1. CSR, Plazma hücre farklılaşma ve HDI tedavi için fare B hücre stimülasyon

  1. dalak hücre süspansiyonlar hazırlanması
    Not: laminar akış kukuIeta fare hariç tüm adımları uygulayın ötenazi ve diseksiyonu.
    1. Belirli patojen-Alerjik C57BL/6J fare (8-12 hafta-in yaş) CO 2 inhalasyon tarafından Euthanize.
    2. Fare yukarı bakacak şekilde karın ile parçalanmış tahta üzerinde yatıyordu. Fare 18'lik, 1.5 - inç Hipodermik iğneler ile tüm dört metrelik pin.
    3. % 70 etanol bulanmış mendil kullanarak cilt sterilize.
    4. Autoclaved cerrahi araç (forseps ve diseksiyon makası) sadece dalak (karaciğer hemen altından karın sol tarafında) görselleştirmek için göğüs kafesi altındaki deri yoluyla kesmek için kümesinin kullanın.
    5. Başka bir steril forseps kullanın ve dalak yavaşça Forseps ile sıkma ve anatomi ile bağlanan tüm doku kapalı kesim tarafından mide daha fazla eğrilik altında yatıyor dalak ayıklamak için makas makas. Bağlantı doku kaldırdığınızdan emin olun.
    6. Tam RPMI1640 orta 1.000 µL içeren bir 1.5 mL microcentrifuge tüpüne dalak yerleştirin (RPMI 1640 orta takviye ile % 10 ısı inaktive fetal buzağı serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 µg/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin, 0,25 µg/mL Amfoterisin B ve 50 µM β-mercaptoethanol).
    7. 50 mL polipropilen koni santrifüj tüpüne 70 µm hücre süzgeç koyun ve dalak microcentrifuge tüp hücre süzgeç üzerine dökün. 15 mL polipropilen koni santrifüj tüpü ucu hafifçe dalak süzgeç aracılığıyla püre için kullanın. 15-20 mL tam orta ile hücre süzgeç durulayın.
    8. 350 x g 5 min ve atma süpernatant için de hücreleri aşağı spin.
    9. Kırmızı kan hücreleri dalak hücre süspansiyonlar kaldırın. Hücre Pelet ACK lizis arabelleği (dalak başına 5 mL) resuspend. Ara sıra sallayarak ile oda sıcaklığında 4 dk için kuluçkaya ve tam orta 25 mL ile yavaşlaması.
    10. Spin 350 x g 5 min için de hücreleri aşağı ve süpernatant atın. Hücre Pelet tam orta 1 ya da 10 mL resuspend. Bir hemasitometre kullanarak canlı hücreleri saymak.
  2. B-hücre izolasyon
    Not: izole B hücreleri tarafından negatif seçim üretici takip ' s yönergeleri. Sigara-B hücreleri B hücreleri (CD4, CD8, CD11b, CD43, CD49b, CD90.2, Ly-6 C/G (Gr-1) ve TER119) ve manyetik parçacıklar streptavidin kaplı karşı yönetmen biotinylated antikorlar ile kaldırılması için hedeflenir.
    1. Hazırla 1 x 10 8 hücre/mL steril 5 mL (12 x 75 mm) polistiren tam ortamda bir 0,25-2 mL hücre süspansiyon yuvarlak alt tüp. Normal fare serum (50 µL/mL) için örnek ekleyin.
    2. Ekle 50 µL/mL yalıtım örnek için kokteyl. Hücreleri nazikçe pipetting tarafından mix yukarı ve aşağı 2 - 3 kat ve oda sıcaklığında 10 dakika süreyle kuluçkaya
    3. 75 µL/mL streptavidin kaplı manyetik parçacıklar için örnek ekleyin. Karışımı yavaşça yukarı ve aşağı pipetting tarafından mix 2 - 3 kat ve oda sıcaklığında 2.5 min için kuluçkaya.
    4. Tam RPMI 1640 orta ekleyin. Hücreleri yukarı ve aşağı 2 - 3 kez hafifçe pipetting tarafından mix.
    5. (Olmadan kapağı) tüp mıknatıs yerleştirin ve 2.5 dk. Pour kapalı bir yeni 15 mL konik tüp içine el değmemiş B hücreleri içeren süpernatant için oda sıcaklığında kuluçkaya.
    6. Bir hemasitometre ve Trypan mavi leke kullanarak canlı hücreleri saymak. Akış Sitometresi Analizi B220 ve CD19 gibi B-hücre yüzey işaretlerinin tarafından B hücreleri saflığı değerlendirmek.
  3. B-hücre stimülasyon ve HDI tedavi
    1. tam RPMI 1640 orta 10 6 hücre/mL x 0,3 son bir konsantrasyon, saflaştırılmış B hücrelerinde Resuspend.
    2. 48-şey hücre kültür plaka hücre kültürü için kullanın. Her şey için saf B-hücre süspansiyon (10 6 hücre/mL x 0.3), Escherichia coli, Il-4 (5 ng/mL nihai toplama) ve 0 LPS (3 µg/mL son konsantrasyonu) veya 500 µM HDI (Valproik asit; 1 mL ekleyin VPA).
    3. Hücreleri 37 ° C ve % 5 CO 2 60 h qRT-PCR ve yüksek üretilen iş mRNA ve miRNA sıralama çözümleme veya Akış Sitometresi Analizi için 96 h için kuluçkaya.
  4. Akış Sitometresi Analizi CSR ve Plazma hücre farklılaşması
    1. Hücreleri yukarı ve aşağı birkaç kez pipetting tarafından kültür 96 h sonra her şey hücrelerden bağlantısını kesin. Hücre süspansiyon 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. Spin aşağı 350 x g 5 min bir tezgah üstü santrifüj kullanarak için de hücreleri ve süpernatant atın.
    2. Resuspend % 1 BSA ve 0,5 ng/mL floresein (FITC) - içeren HBSS arabelleği 100 µL hücrelerle konjuge keçi - fare IgM antikor (Ab) , 0.2 ng/mL allophycocyanin (APC) anti-konjüge fare Anti-fare Igg1 monoklonal Ab (mAb), 0.2 ng/mL phycoerythrin (PE)-Birleşik fare Anti-fare B220 mAb, 0.2 ng/mL PE-Cy7-Birleşik fare Anti-fare CD138 mAb ve 2 ng/mL 7-aminoactinomycin D (7-AAD).
    3. Floresans Birleşik antikorlar (Adım 1.4.2), oda sıcaklığında 30 dakika süreyle karanlıkta hücrelerle kuluçkaya
    4. HBSS % 1 BSA ile 1 mL hücrelerle yıkayın.
    5. 1500 x g 5 min bir benchtop santrifüj ve atma süpernatant kullanarak için de hücreleri aşağı spin.
    6. HBSS % 1 BSA ile 300 µL hücrelerde resuspend ve hücre süspansiyon yuvarlak alt polistren tüp aktarın. Işığa maruz önlemek için folyo ile tüp kapak.
    7. Bir tek hücre süspansiyon gerçekleştir Akış Sitometresi Analizi. Her tazminat örnek için 50.000 olaylar ve diğer örnekleri için 250.000 olayları toplamak. Ekipman yazılım kullanarak veri analiz.
    8. Bir darbe geometri kapı (FSC-Y FSC-A ve SSC-H SSC-A x x) kullanarak enkaz ve birini ortadan kaldırmak. Uygun şekilde ölü hücreleri dışlamak için arsa üzerinde 7-AAD kapısı.

2. Yüksek işlem hacmi mRNA-Seq

  1. sonra 60 h kültür, ayıklamak toplam RNA küçük RNA üretici takip kurtarabilirsiniz bir toplam RNA izolasyon kit kullanarak 2-4 × 10 6 hücrelerden ' s yönergeleri. Bir Dnaz dahil ben tedavi adım.
  2. Üretici takip bir bioanalyzer kullanarak RNA bütünlüğünü ' s yönergeleri.
  3. Yüksek kaliteli toplam RNA'ın 500-1000 ng kullanın (RNA bütünlük numarası RIN > 8.0) RNA-seq için ticari bir RNA ile kütüphane hazırlık örnek pÜretici takip temsilcisi kiti ' s yönergeleri.
  4. Bağdaştırıcıları onların anılan sıraya göre 6-bp dizin bölümlerini dayalı bireysel mRNA-seq kitaplıkları havuz ve kütüphaneler, 50 bp/sıra sıra. Üreticiye göre yüksek üretilen iş DNA sistemi kullanmak ' s protokolleri.
  5. Her örnek için fastq dosyası oluşturmak için CASAVA ile sıralama çalıştırdıktan sonra demultiplex. Eşleme okuma ve Biyoinformatik analizi, Önceden Seviyelendirilmiş 11 olarak gerçekleştirmek.
  6. Tüm sıralama okuma TopHat2 varsayılan ayarları 14 kullanarak kendi başvuru genleri (UCSC fare genom yapı mm9) ile hizalayın. Gene tüm örneklerinde başına sayıları elde etmek için HTSeq-count kullanarak hizalama bam dosyalarından işlemek.

3. Yüksek işlem hacmi miRNA-Seq

  1. kullanımı 100 ng-1 µg yüksek kaliteli toplam RNA, hazırlanan gibi adım 2.1, ticari bir küçük RNA-seq kit kullanarak küçük RNA-seq Kütüphane hazırlık için.
  2. Ligate dejenere 3 ' bağdaştırıcısı 5 üzerine ′ başlangıç küçük RNA molekülleri bir ticari tüp ligasyonu kiti ile biter. Dejenere 5 ligate ' bağdaştırıcısı üzerine 3 ′ başlangıç küçük RNA molekülleri bir ticari tüp ligasyonu kiti ile biter. RNA tarafından ters transkripsiyon cDNA için dönüştürmek ve PCR güçlendirme ticari kitleri ile tarafından küçük RNA-seq Kütüphane yükseltmek.
  3. % 6 TBE yerel sayfa jel son küçük RNA-seq kitaplığı belirlemek için kullanın. Bromophenol boya izleme mavi bant jel (0.5 - 1 cm) sonuna yaklaştıkça kadar jel 200 V 1 X TBE arabellek ile çalıştırmak.
  4. Jel cam plakanın kaldır ve leke etidyum bromür (0,5 µg/mL suda) ile 2-3 dk. Visualize jel bantları UV transilluminator veya başka bir jel dokümantasyon araç temiz bir kapta.
  5. Kesme dışarı temiz jilet kullanarak ~ 150 bp bant ve 1.7 mL tüp içine yerleştirin.
  6. Bir jel ekstraksiyon kiti için üreticinin yönergelerini kullanarak DNA ayıklamak.
  7. Ticari bir yüksek-duyarlı DNA tahlil son kitaplıkla ve konsantrasyon üreticileri başına bir ticari dsDNA tahlil ile boyutu dağıtımını kontrol ' yönergeleri.
  8. Güçlendirme ve bir sonraki sıralamanın başına üreticinin ticari bir yüksek üretilen iş DNA sıralama sistemi ile çalıştırmak için kitaplıklarına havuz ' s protokolleri.
  9. Demultiplex üretici başına her örnek için fastq dosyası oluşturmak için CASAVA ile ' s protokolleri.
  10. Her örnek küçük RNA-seq analiz için üretici başına küçük RNA hizalama için titreme kullanmanız ' s iletişim kuralları.
    1. Kaldırmak rRNA, astar, mitokondri gibi kirletici için hizalı ve benzeri okuma.
    2. MiRNA dizileri olgun verileri hizalama.
    3. Saç tokası döngü sıraları (öncü miRNA) verileri hizalama.
    4. Hizala veri için diğer küçük RNA (fRNA veritabanı kullanılır) dizileri 15.
  11. Sonra tüm örneklerini sayılabilir, farklı gruplar/örnekler arasındaki fark ifade miRNAs tanımlarsınız. Hedef seçilen mRNA'ların veya TargetScan 16, evren 17 ve PicTar gibi online miRNA hedef tahmin araçları kullanarak bir seçici miRNA tarafından hedef mRNA'ların miRNAs tahmin 18 .
  12. Fonksiyonel ek açıklama veya yolu analizi gereklidir, marifet yolu analizi (IPA) için tahmin edilen genlerin gönderin veya DAVID.

4. Kantitatif RT-PCR (qRT-PCR) mRNA'ların ve miRNAs

  1. mRNA qRT-PCR analizi
    1. ayıklamak RNA 0,2-5 × 10 üzerinden 6 hücreleri aşağıdaki küçük RNA kurtarabilirsiniz bir ticari toplam RNA izolasyon kit kullanarak Üretici ' s yönergeleri. Bir Dnaz dahil ben tedavi adım.
    2. Oligo-dT astar kullanarak bir ilk-strand cDNA sentez sistemiyle cDNA üzerinden toplam RNA sentez.
    3. QRT-PCR ile 2 x gerçek zamanlı PCR ana karışımı ile aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak uygun astar tarafından cDNA ölçmek: 15 95 ° C s, 40 devredir 10 94 ° c s, 30 60 ° C s ve 72 ° C 30 s.
    4. Veri toplama sırasında 72 ° C uzantısı adım gerçekleştirmek ve 95'e 72 erime eğrisi çözümlemesi ° C.
  2. miRNA qRT-PCR analizi
    1. Aliquot RNA 4.1.1 adımda hazırlanan örneklerinden.
    2. Ters-uyarlamak RNA cDNA içine. Üretici takip bir ticari mikroRNA ters transkripsiyon setini kullanın ' s yönergeleri.
    3. Gerçek zamanlı PCR ile 250 nM olgun miRNA ileri astar birlikte evrensel bir ters astar ile SYBR yeşil gerçek zamanlı PCR ana hamuru kullanılarak mikroRNA gerçekleştirir.
      1. Tezcan 2 x PCR Master Mix, miRNA özgü ileri astar ve evrensel ters astar, oda sıcaklığında. Bireysel çözümler karıştırın.
      2. Hazırlamak bir reaksiyon karışım aşağıdaki gibi bir 25 µL-başına-da tepki birim (96-şey PCR levha kullanılır) için:
        2 x PCR Master Mix 12.5 µL
        miRNA ileri astar (2,5 μM) 2.5 µL
        evrensel ters astar (2,5 μM) 2.5 µL
        RN ASE-Alerjik water5 µL
      3. tepki Mix bir 96-şey PCR plakasına eklemek 22,5 μL. Şablon cDNA (50 pg-3 ng) 2.5 µL bireysel plaka wells ekleyin.
      4. Sıkıca tutkal plaka film. 1 dk 1000 x g ve oda sıcaklığında az plaka santrifüj kapasitesi.
      5. Plaka gerçek zamanlı cycler yerleştirin ve Bisiklete binme aşağıdaki programı Başlat: 95 ° C 5 min, 40 devredir 15 94 ° c için s, 30 55 ° C s ve 72 ° C 30 s.
    4. Bir elektronik tabloyla qRT-PCR veri analizi için ΔΔCt yöntemini kullanın. İfade küçük nükleer/genelde RNA'ların Rnu6/RNU61/2, Snord61/SNORD61, Snord68/SNORD68 ve Snord70/SNORD70 ilgili miRNAs ifade normalleştirmek.
  3. İstatistiksel analiz
    1. p değerleri ile eşleştirilmiş ve öğrenci unpaired belirlemek için istatistiksel analiz ' s t - bir elektronik tablo kullanarak test etmek ve p değerleri göz önünde < 0,05 olarak önemli.

Sonuçlar

Bizim iletişim kuralını kullanarak saf LPS ile yerleştirilen B hücreleri (3 µg/mL) ve Il-4 (5 ng/mL) CSR Igg1 için % 30-40 ve Plazma hücre farklılaşma ~ %10 96 h neden olabilir için. Plazma hücre farklılaşması % ~ 2'ye düştü iken HDI (500µM VPA) ile tedavi sonrası CSR Igg1 için 10-%20 Için azalmıştır (şekil 1). CSR HDI aracılı inhibisyonu daha düşük sayıda sonrası rekombinasyon Iμ-Cγ1 ve olgun VHDJHtarafından doğr...

Tartışmalar

Bu iletişim kuralı B hücre sınıf anahtarlama ve Plazma hücre farklılaşması ikna etmek için kapsamlı yaklaşım sağlar; epigenetik modülatörler tarafından Yani HDI etkisini analiz etmek; ve bu hücreler HDI etkisini mRNA ve miRNA ifadesine algılamak için. Bu yaklaşımların çoğu insan B hücreli işlev ve mRNA/miRNA ifade epigenetik faktör etkisini analiz etmek için kullanılabilir. QRT-PCR ve mRNA-seq/miRNA-seq yaklaşımlar fareler gibi HDIs epigenetik modülatörler ile tedavi dan izole B hücrele...

Açıklamalar

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Teşekkürler

Bu eser NIH hibe AI 105813 ve AI 079705 (PC için) tarafından desteklenen, Lupus araştırma hedef tanımlama Lupus Grant ALR 295955 (PC için) için İttifak ve artrit Ulusal Araştırma Vakfı araştırma (HZ) verin. TS desteklenen Pediatri Tıp Merkezi, ikinci Xiangya hastane, Merkezi Güney üniversite, Changsha, Çin, tarafından Xiangya-UT okul tıp San Antonio tıbbi öğrenci ziyaret programı bağlamında.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
C57BL/6 miceJackson Labs664
Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine)Fisher ScientificMT 10-040-CV 
FBSHycloneSH300
HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mLFisher Scientific - HycloneSV3007901 
β-MercaptoethanolFisher Scientific44-420-3250ML
Falcon Cell StrainersFisher Scientific21008-952  
Trypan Blue Stain 0.04%GIBCO/Life Technologies/Inv15250
ACK Lysis Buffer Fisher ScientificBW10-548E 
Hausser Scientific Bright-Line Counting ChamberFisher Scientific02-671-51B
EasySep MagnetStem Cell Technologies18000
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with CapFisher Scientific14-959-1A
EasySep Mouse B cell Isolation KitStem Cell Tech19854
BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box BD Biosciences 305199
PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) AntibodyBioLegend 142513 (25 ug)
PE-Cy7 B220 antibodyBioLegend103222
7-AAD (1 mg)Sigma AldrichA9400-1MG
APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibodyBiolegend103212
Mouse APC-IgG1 200 µgBiolegend406610
FITC anti-mouse IgM AntibodyBiolegend406506
FITC anti-mouse/human CD45R/B220 AntibodyBiolegend103206
PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2)Biolegend103208
HBSS 1XFisher ScientificMT-21-022-CM
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated Fisher ScientificBP1600-100
LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5)Sigma AldrichL2880-25MG
Recombinant mouse IL-4 (carrier-free)BioLegend574302 (size: 10 ug)
Valproic acid sodium saltSigma AldrichP4543
SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety CabinetThe Baker CompanySG404
Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator Thermo Scientific3950
Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205Fisher Scientific15-462-5Q
5mL Round Bottom Polystyrene Test TubeFisher Scientific 14-959-5
Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes Fisher Scientific 05-538-59A
1.7 mL Microtube, clearGenesee22-282
Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50mlFisher Scientific06-443-18
ELMI SkySpin CM-6MTELMICM-6MT
Rotor 6MELMI6M
Rotor 6M.06ELMI6M.06
Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet ControllerDrummond Scientific4-000-101
25 mL serological pipette tipsFisher Scientific89130-900
10 mL serological pipette tipsFisher Scientific89130-898
5 mL serological pipette tipsFisher Scientific898130-896
48-well platesFisher Scientific07-200-86
Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-RefrigeratedBeckman Coulter366802
GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart BalanceBeckman Coulter366650
Allegra 25R Benchtop Centrifuge, RefrigeratedBeckman Coulter369434
TA-15-1.5 Rotor, Fixed AngleBeckman Coulter368298
Fisher Scientific AccuSpin Micro 17Fisher Scientific13-100-675
Fisher Scientific Analog Vortex Mixer Fisher Scientific02-215-365
miRNeasy Mini Kit (50)Qiagen217004
Direct-zol RNA MiniPrep kitZymo ResearchR2050
Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology)Fisher ScientificBP1145-1
Rnase-Free Dnase set (50)QIAGEN79254
NanoDrop 2000 SpectrophotometersThermo ScientificND-2000
Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCRInvitrogen175013897
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-rad 172-5121
Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25Fisher14-230-244
Microseal 'B' Adhesive SealsBio-RadMSB-1001
MyiQ Optics ModuleBio-Rad170-9744
iCycler ChassisBio-Rad170-8701
Optical KitBio-Rad170-9752
BD LSR II Flow Cytometry AnalyzerBD Biosciences
FACSDiva softwareBD Biosciences
FlowJo 10BD Biosciences
2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2943CA
S200 Focused-ultrasonicatorCovarisS200
SPRIworks Fragment Library System I for IlluminaBeckman CoulterA288267
cBot Cluster Generation StationilluminaSY-312-2001
HiSeq 2000 Genome SequencerIlluminaSY-401-1001
TruSeq RNA Library Prep Kit v2IlluminaRS-122-2001
TruSeq Small RNA Library Prep KitIlluminaRS-200-0012
NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3Bioo Scientific5132-05
2200 TapeStationAgilentG2964AA

Referanslar

  1. Allis, C. D., Jenuwein, T. The molecular hallmarks of epigenetic control. Nat Rev Genet. 17, 487-500 (2016).
  2. Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends Immunol. 34, 460-470 (2013).
  3. Zan, H., Casali, P. Epigenetics of Peripheral B-Cell Differentiation and the Antibody Response. Front Immunol. 6, 631 (2015).
  4. Xu, Z., Zan, H., Pone, E. J., Mai, T., Casali, P. Immunoglobulin class-switch DNA recombination: induction, targeting and beyond. Nat. Rev. Immunol. 12, 517-531 (2012).
  5. Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nat. Rev. Immunol. 15, 160-171 (2015).
  6. Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
  7. Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs. Annu. Rev. Biochem. 79, 351-379 (2010).
  8. White, C. A., et al. Histone deacetylase inhibitors upregulate B cell microRNAs that silence AID and Blimp-1 expression for epigenetic modulation of antibody and autoantibody responses. J Immunol. 193, 5933-5950 (2014).
  9. Farh, K. K., et al. Genetic and epigenetic fine mapping of causal autoimmune disease variants. Nature. 518, 337-343 (2015).
  10. Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr Protoc Mol Biol. , 11-13 (2010).
  11. Martin, J. A., Wang, Z. Next-generation transcriptome assembly. Nat Rev Genet. 12, 671-682 (2011).
  12. Luo, S. MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform. Methods Mol. Biol. 822, 183-188 (2012).
  13. Shen, T., Sanchez, H. N., Zan, H., Casali, P. Genome-wide analysis reveals selective modulation of microRNAs and mRNAs by histone deacetylase inhibitor in B cells induced to uUndergo class-switch DNA recombination and plasma cell differentiation. Front. Immunol. 6, 627 (2015).
  14. Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. 7, 562-578 (2012).
  15. Kin, T., et al. fRNAdb: a platform for mining/annotating functional RNA candidates from non-coding RNA sequences. Nucleic Acids Res. 35, D145-D148 (2007).
  16. Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J. W., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. Elife. 4, (2015).
  17. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).
  18. Anders, G., et al. doRiNA: a database of RNA interactions in post-transcriptional regulation. Nucleic Acids Res. 40, D180-D186 (2012).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm nolojisay 127B h cresis n f anahtar DNA RekombinasyonAk SitometresiHiston deacetylase HDAC inhibit rleri HDIsmRNAmikroRNAmRNA seqmiRNA seqPlazma h cre farkl la mas

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır