Genoma-largo mediada por análise de inibidor HDAC modulação de microRNAs e mRNAs em B células induzidas a recombinação de DNA de classe-interruptor sofrem e diferenciação de células plasmáticas

Resumo

Fatores epigenéticos podem interagir com programas genéticos para modular a expressão gênica e regulam a função de células B. Combinando a estimulação de vitro em células B, qRT-PCR e elevado-throughput do microRNA-sequência e abordagens de RNAm-sequência, podemos analisar a epigenética modulação da expressão de gene e miRNA em células B.

Resumo

Respostas de anticorpos são realizadas através de vários processos, células B crítico-intrínseca, incluindo somática (SHM), recombinação de DNA de classe-switch (RSE) e diferenciação de células plasmáticas. Nos últimos anos, modificações epigenéticas ou fatores, tais como deacetilação de histona e microRNAs (miRNAs), têm sido mostrados para interagir com os programas genéticos de células B a respostas de anticorpos de forma, enquanto a disfunção dos fatores epigenéticos foi encontrada para conduzir a respostas de auto-anticorpos. Analisando a expressão de miRNA e mRNA de todo o genoma em células B em resposta a epigenéticas moduladores é importante para compreender a regulação epigenética da célula B função e anticorpo resposta. Aqui, demonstramos um protocolo para indução de células B submeter-se a diferenciação de RSE e células plasmáticas, tratando estas células B com inibidores de histona deacetilase (HDAC) (IDHs) e analisando a expressão do mRNA e microRNA. Neste protocolo, analisamos diretamente complementares sequências de DNA (cDNA) usando sequenciamento de mRNA de próxima geração (seq-mRNA) e tecnologias de miRNA-seq, mapeamento do sequenciamento lê ao genoma e quantitativa (qRT) a transcrição reversa-PCR. Com estas abordagens, definimos que, em células B induzidas a se submeter a RSE e diferenciação de células plasmáticas, HDI, um regulador epigenético, seletivamente modula a expressão miRNA e mRNA e altera a diferenciação de RSE e células plasmáticas.

Introdução

Marcas epigenéticas ou fatores, como a metilação do DNA e RNA não-codificante (incluindo microRNAs), posttranslational modificações do histone modulam a função celular, alterando a expressão de gene¹. Modificações epigenéticas regulam a função de linfócitos B, tais como recombinação de DNA de classe-interruptor de imunoglobulina (RSE), somática (SHM) e diferenciação de células B de memória ou pilhas de plasma, desse modo, modulando o anticorpo e auto-anticorpos respostas de^2,3. RSE e SHM criticamente exigem deaminase citidina induzida por ativação (auxílio, codificado como Aicda), que é altamente induzida em células B em resposta ao T-dependentes e T-independentes antígenos⁴. As células B classe-comutado/hypermutated mais se diferenciar em plasmócitos, que secretam grandes quantidades de anticorpos de forma criticamente dependente da proteína de maturação de linfócitos B-induzido 1 (Blimp1, codificado como Prdm1)⁵. Mudanças epigenéticas anormais nas células B podem resultar em respostas de anticorpo/auto-anticorpos aberrante, que podem levar à resposta alérgica ou auto-imunidade^1,4. Compreendendo fatores como epigenéticas, tais como os miRNAs, modulam célula B-intrínseca expressão gênica não é apenas importante para o desenvolvimento de vacina, mas também é essencial para revelar os mecanismos de respostas potenciais de anticorpo/auto-anticorpos anormais.

Deacetilação e acetilação da histona são modificações dos resíduos de lisina em proteínas histonas normalmente catalisadas por histona acetiltransferase (chapéu) e histona deacetilase (HDAC). Estas modificações levam à acessibilidade crescente ou decrescente da cromatina e, ainda mais, permitam ou impedem a ligação de fatores de transcrição ou proteínas ao DNA e a alteração do gene expressão^{5,6, 7 , 8}. inibidores HDAC (IDH) são uma classe de compostos que interferem com a função das HDACs. Aqui, usamos HDI (VPA) para abordar o Regulamento de HDAC sobre o perfil de expressão de gene intrínseca das células B e seu mecanismo.

os miRNAs são pequenos, não-codificantes RNAs aproximadamente de 18 a 22 nucleotídeos de comprimento que são gerados por vários estágios. miRNA anfitrião genes são transcritos e formam o grampo principal microRNAs (miRNAs-pri). São exportados para o citoplasma, onde pri-miRNAs são subsequentemente transformados em miRNAs precursor (pre-miRNAs). Finalmente, formam-se através da segmentação dos pre-miRNAs miRNAs maduros. os miRNAs reconhecer as sequências complementares dentro da região 3' untranslated do seu alvo mRNAs^6,7. Através do silenciamento pós-transcricional, miRNAs regular a atividade celular, tais como a proliferação, diferenciação e apoptose^10,11. Já vários miRNAs podem direcionar o mesmo mRNA, e um único miRNA potencialmente pode direcionar vários mRNAs, é importante ter uma visão do contexto do perfil de expressão de miRNA para compreender o valor do indivíduo e o efeito conjugado dos miRNAs. os miRNAs foram mostrados para ser envolvido no desenvolvimento de células B e diferenciação periférica, bem como diferenciação de estágio específico de células B, resposta imunitária e auto-imunidade^1,4,9. Na 3' UTR de Aicda e Prdm1, existem vários validados ou previsível evolutivamente conservadas sites que podem ser direcionados por miRNAs⁸.

Modulação epigenética, incluindo modificação pós-transcrição de histona e miRNAs, exibir um tipo de célula e célula padrão de regulamento de estágio específico do gene expressão⁹. Aqui, descrevemos os métodos para definir a modulação mediada por HDI de miRNA e expressão do mRNA, CSR e diferenciação de células plasmáticas. Estes incluem protocolos para indução de células B submeter-se a RSE e diferenciação de células plasmáticas; para tratar as células B com IDH; e para analisar a expressão miRNA e mRNA por qRT-PCR, miRNA-seq e mRNA-seq^{10,11,12,8,13}.

Protocolo

o protocolo segue as diretrizes de cuidados com animais de The cuidados institucionais do Animal e uso de comitês da University of Texas Health Science Center em San Antonio.

1. estimulação de pilhas do rato de B para a RSE, diferenciação de células plasmáticas e HDI tratamento

1. preparação de suspensões celulares de baço
   Nota: executar todas as etapas em uma capa de fluxo laminar, com exceção do mouse eutanásia e dissecção.
   1. Euthanize a isentos de agentes patogénicos específicos C57BL/6J mouse (8-12 semanas de idade) por inalação de CO ₂.
   2. Colocar o mouse na placa de dissecação com o abdome virado para cima. Colocar todos os quatro pés do mouse com agulha de calibre 18, 1.5 - na.
   3. Esterilizar a pele usando toalhetes de encharcada de etanol 70%.
   4. Usar um conjunto de instrumentos cirúrgicos esterilizados em autoclave (pinças e tesouras dissecação) para cortar a pele logo abaixo da caixa torácica para visualizar o baço (no lado esquerdo do abdômen, logo abaixo do fígado).
   5. Usar outra pinça estéril e tesouras tesouras para extrair o baço, que se encontra abaixo da curvatura maior do estômago, por aperto o baço suavemente com fórceps e cortando todo o tecido de conexão com a dissecação. Certifique-se de remover todo o tecido conexão.
   6. Colocar o baço em um tubo de 1,5 mL microcentrifuga contendo 1.000 µ l de meio RPMI1640 completo (RPMI 1640 meio suplementado com soro 10% inactivadas pelo calor fetal bezerro (FBS), 2 mM L-glutamina, a penicilina 100 µ g/mL, 100 mg/mL estreptomicina, anfotericina B de 0,25 µ g/mL e 50 µM β-Mercaptoetanol).
   7. Coloque um coador de célula de 70 µm em um tubo de centrifuga conico polipropileno de 50 mL e despeje o baço do tubo microcentrifuga no filtro da célula. Use a ponta de um tubo de centrifuga conico polipropileno de 15 mL para amasse delicadamente o baço através do filtro. Lave o filtro de célula com 15 a 20 mL de meio completo.
   8. Spin-down as células a 350 x g, durante 5 min e descartar o sobrenadante.
   9. Remover os glóbulos vermelhos de suspensões de células do baço. Ressuspender as células em tampão de Lise ACK (5 mL por baço). Incubar durante 4 min em temperatura ambiente com agitação ocasional e depois saciar com 25 mL de meio completo.
   10. Spin para baixo as células a 350 x g por 5 min e descartar o sobrenadante. Ressuspender as células em 1 ou 10 mL de meio completo. Contar as células viáveis usando um hemocytometer.
2. Célula B isolamento
   Nota: as células B isolar pela seleção negativa, seguindo o fabricante ' instruções s. Non-B células são direcionadas para remoção com biotinilado anticorpos dirigidos contra células não-B (CD4, CD8, CD11b, CD43, CD49b, CD90.2, Ly-6C/G (Gr-1) e TER119) e partículas magnéticas streptavidin-revestido. Tubo de fundo redondo de
   1. Prepare uma suspensão de células de 0,25 a 2 mL de 1 x 10 ⁸ células/mL em meio completo em um poliestireno estéril 5 mL (12 x 75 mm). Adicionar soro rato normal (50 µ l/mL) para a amostra.
   2. Isolamento de adicionar 50 µ l/mL cocktail à amostra. Misture as células pipetando suavemente para cima e para baixo 2 - 3 vezes e incubar a temperatura ambiente por 10 min.
   3. Adicionar 75 µ l/mL streptavidin-revestido partículas magnéticas para a amostra. Misture a mistura suavemente pipetando acima e para baixo 2 - 3 vezes e incube por 2,5 min à temperatura ambiente.
   4. Adicionar meio RPMI 1640 completo. Misture as células pipetando delicadamente acima e abaixo de 2 - 3 vezes.
   5. Colocar o ímã do tubo (sem a tampa) e incubar a temperatura ambiente por 2,5 min. deite fora o sobrenadante contendo intocadas células B em um novo tubo cônico de 15 mL.
   6. Contar as células viáveis usando um hemocytometer e mancha azul Trypan. Avaliar a pureza das células B por análise de citometria de fluxo de marcadores de superfície de células B, como B220 e CD19.
3. Estimulação de células B e tratamento HDI
   1. Ressuspender as células B purificadas em meio RPMI 1640 completo em uma concentração final de 0,3 x 10 ⁶ células/mL.
   2. Usar uma placa de cultura de células de 48-bem para cultura de células. Para cada poço, adicionar 1 mL de suspensão de células B purificado (0,3 x 10 ⁶ células/mL), LPS (concentração final de 3 µ g/mL) de Escherichia coli, IL-4 (concentração final de 5 ng/mL) e 0 ou 500 µM HDI (ácido valproico; VPA).
   3. Incube as celulas em 37 ° C e 5% CO ₂ para 60h por qRT-PCR e análise do elevado-throughput do mRNA - e miRNA-sequenciamento, ou 96 h para análise de citometria de fluxo.
4. Flow cytometry análise de RSE e diferenciação de células plasmáticas
   1. após 96 h de cultura, separar as células de cada poço pipetando as células acima e para baixo várias vezes. Transferi a suspensão de células para um tubo de 1,5 mL microcentrifuge. Gire para baixo as células a 350 x g por 5 min utilizando uma centrífuga de bancada e descartar o sobrenadante.
   2. Ressuspender as células com 100 µ l de tampão HBSS contendo 1% de BSA e 0,5 ng/mL fluoresceína (FITC) cabra conjugada anti anticorpos de IgM de rato de – (Ab) , 0,2 ng/mL allophycocyanin (APC)-anti-rato conjugados rato IgG1 Ab monoclonal (mAb), 0,2 ficoeritrina ng/mL (PE)-conjugados rato anti-rato B220 mAb, 0,2 ng/mL PE-Cy7-conjugados rato anti-rato CD138 mAb e 2 ng/mL 7-aminoactinomycin D (7-AAD).
   3. Incubar as células com anticorpos conjugados de fluorescência (etapa 1.4.2) no escuro à temperatura ambiente por 30 min.
   4. Lavar as células com 1 mL de HBSS com 1% de BSA.
   5. Spin-down as células a 1.500 x g por 5 min utilizando uma centrífuga de bancada e descartar o sobrenadante.
   6. Ressuspender as células em 300 µ l de HBSS com 1% de BSA e transfira a suspensão de células para um tubo de poliestireno de fundo redondo. Cobrir o tubo com papel alumínio para evitar a exposição à luz.
   7. Executar análise de citometria de fluxo em uma suspensão de célula única. Colete 50.000 eventos para cada amostra de compensação e 250.000 eventos para as outras amostras. Analisar os dados usando o software do equipamento.
   8. Eliminar os detritos e parelhas usando um portão de geometria de pulso (FSC-H x FSC-A e SSC-H x SSC-A). Portão apropriadamente o lote 7-AAD para excluir as células mortas.

2. Elevado-Throughput do mRNA-Seq

h

1. após 60 da cultura, extrair o RNA total de 2-4 × 10 ⁶ células usando um kit de isolamento de RNA total que pode recuperar o pequeno RNA seguindo o fabricante ' instruções s. Incluem uma DNase eu passo tratamento.
2. Verificar a integridade do RNA usando um bioanalyzer, seguindo o fabricante ' instruções de s.
3. Usar 500-1.000 ng do RNA total de alta qualidade (número de integridade do RNA RIN > 8.0) para o RNA-seq preparação de biblioteca com uma RNA comercial amostra pkit de rep seguindo o fabricante ' instruções de s.
4. As bibliotecas de mRNA-seq individuais com base em suas parcelas respectivas 6-bp índice dos adaptadores do pool e as bibliotecas em 50 bp/sequência de sequências. Usar um sistema de DNA de alto rendimento de acordo com o fabricante ' protocolos de s.
5. Após a execução de sequenciamento, demultiplex com CASAVA para gerar o arquivo fastq para cada amostra. Realizar leituras de mapeamento e análise de bioinformática, como anteriormente descrito ¹¹.
6. Alinhar todas as leituras de sequenciamento com seus genomas de referência (UCSC rato genoma compilação mm9) usando TopHat2 padrão configurações ¹⁴. Processar os arquivos de bam de alinhamento usando a contagem de HTSeq para obter as contagens por gene em todas as amostras.

3. Elevado-Throughput miRNA-Seq

1. uso 100 ng-1 µ g de RNA total de alta qualidade, como preparado no passo 2.1, para a preparação de biblioteca de RNA-seq pequena usando um pequeno kit de RNA-seq comercial.
2. Ligam a 3 degenerado ' adaptador sobre o 5 ′ extremidades das partida pequenas moléculas de RNA com um kit de ligadura comercial. Ligam o degenerado 5 ' adaptador sobre o 3 ′ extremidades das partida pequenas moléculas de RNA com um kit de ligadura comercial. Converter o RNA em cDNA por transcrição reversa e amplificar a pequena biblioteca de RNA-seq por amplificação por PCR com jogos comerciais.
3. Usar um gel de PAGE 6% nativo TBE para isolar a final pequena biblioteca de RNA-seq. Funcione o gel com 1 buffer de X TBE a 200 V, até a banda de bromofenol tintura de controle se aproxima da parte inferior do gel (0,5 - 1 cm).
4. Retire o gel as chapas de vidro e manchar com brometo de etídio (0,5 µ g/mL na água) em um recipiente limpo para 2-3 min.. Visualize o gel bandas em um transiluminador UV ou outro instrumento de documentação de gel de.
5. Cortar fora a banda ~ 150-bp usando uma lâmina limpa e coloque-o em um tubo de 1,7 mL.
6. Extrair o DNA usando um kit de extração do gel de acordo com as instruções do fabricante.
7. Verificar a distribuição de tamanho da biblioteca final com um teste de DNA de alta sensibilidade comercial e a concentração com um ensaio comercial dsDNA por fabricantes de ' instruções.
8. As bibliotecas da piscina por amplificação e um posterior sequenciamento executados com um sistema de sequenciamento de DNA da elevado-produção comercial pelo fabricante ' protocolos de s.
9. Demultiplex com CASAVA para gerar o arquivo fastq para cada amostra pelo fabricante ' protocolos de s.
10. Para análise de RNA-seq pequena de cada amostra, use Flicker para alinhamento de RNA pequeno pelo fabricante ' protocolos s.
    1. Remover leituras que são alinhadas a contaminantes, tais como mitocôndrias, rRNA, cartilhas, etc.
    2. Alinhar os dados para amadurecer miRNA sequências.
    3. Alinhar os dados de sequências de laço do gancho de cabelo (precursor miRNA).
    4. Alinhar os dados a outros pequenos RNA sequências (usando banco de dados fRNA) ¹⁵.
11. Depois que todas as amostras são quantificadas, definir os miRNAs expressados diferenciais entre diferentes grupos/amostras. Prever os miRNAs que destino selecionados mRNAs ou mRNAs que pode ser alvo de uma miRNA seletiva usando ferramentas de previsão de alvo de miRNA on-line, como TargetScan ¹⁶, microcosmo ¹⁷ e PicTar ¹⁸ .
12. Se houver necessidade de análise funcional de anotação ou caminho, submeter os genes previstos para análise via engenho (IPA) ou DAVID.

4. RT-PCR quantitativo (qRT-PCR) de mRNAs e miRNAs

1. análise de qRT-PCR de RNAm
   1. extrair o RNA de 0,2-5 × 10 ⁶ células usando um comercial total RNA isolamento kit que pode recuperar o pequeno RNA, seguindo o fabricante ' instruções s. Incluem uma DNase eu passo tratamento.
   2. Sintetizar o cDNA de RNA total com um sistema de síntese de primeiro-costa usando primer oligo-dT.
   3. Quantificar cDNA por qRT-PCR com primers adequados, usando 2 x mistura mestre de PCR em tempo real com o seguinte protocolo: 95 ° C por 15 s, 40 ciclos de 94 ° C por 10 s, 60 ° C por 30 s e 72 ° C por 30 s.
   4. Realizar a aquisição de dados durante a etapa de extensão de 72 ° C e realizar análise de curva de fusão de 72 para 95 ° C.
2. análise de qRT-PCR de miRNA
   1. alíquota RNA das amostras preparadas na etapa 4.1.1.
   2. Reversa-transcrever o RNA em cDNA. Usar um kit de transcrição reversa do microRNA comercial, seguindo o fabricante ' instruções de s.
   3. Realizar PCR em tempo real de microRNA utilizando uma mistura mestre SYBR Green em tempo real do PCR com 250 nM miRNA madura frente primers em conjunto com um primer universal reverso. Cartilha de
      1. degelo 2 x PCR Master Mix, miRNA específicos para a frente da primeira demão e universal reversa à temperatura ambiente. Misturar as soluções individuais.
      2. Preparar uma mistura de reação da seguinte maneira para um volume de 25 µ l-por-bem reação (usado em placas de PCR de 96 poços):
         2 x PCR Master Mix 12,5 µ l
         miRNA encaminhar as primeiras demão (2,5 μM) 2,5 µ l
         Universal reversa de primer (2,5 μM) 2,5 µ l
         RN µ l ase-free water5
      3. Adicionar 22.5 μL da mistura de reação a uma placa PCR de 96 poços. Adicionar 2,5 μL de cDNA de modelo (50 pg-3 ng) nos poços de placa individual.
      4. Firmemente selar o filme de placa. A placa por 1 min em 1.000 x g e temperatura de centrifugação.
      5. Colocar a placa no cycler em tempo real e iniciar o seguinte programa de ciclismo: 95 ° C por 5 min, 40 ciclos de 94 ° C por 15 s, 55 ° C por 30 s e 72 ° C por 30 s.
   4. Usar o ΔΔCt método para análise de dados qRT-PCR com uma folha de cálculo. Normalizar a expressão dos miRNAs relevantes para a expressão de pequena nuclear/nucleolar RNAs Rnu6/RNU61/2, Snord61/SNORD61, Snord68/SNORD68 e Snord70/SNORD70.
3. Análise estatística
   1. realizar análise estatística para determinar os valores de p por emparelhado e desirmanadam estudante ' s t - teste usando uma folha de cálculo e considerar os valores de p < 0,05 como significativa.

Resultados

Usando nosso protocolo, purificado de células B colocadas com LPS (3 µ g/mL) e IL-4 (5 ng/mL) para 96 h pode induzir a 30-40% da RSE para IgG1 e ~ 10% de diferenciação de células plasmáticas. Após o tratamento com HDI (500µM VPA), a RSE para IgG1 diminuiu para 10-20%, enquanto a diferenciação de células plasmáticas diminuíram de ~ 2% (Figura 1). Inibição mediada por HDI de RSE foi confirmada por uma diminuição da quantidade de pós-recombinação Iμ-Cγ1...

Discussão

Este protocolo fornece abordagens globais para induzir a comutação de classe B célula e diferenciação de células plasmáticas; para analisar o seu impacto por moduladores epigenéticos, ou seja, IDH; e para detectar o efeito de IDH na expressão do mRNA e miRNA nestas células. A maioria dessas abordagens também pode ser usada para analisar o impacto do factor epigenética na expressão de função e mRNA/miRNA B-célula humana. O qRT-PCR e mRNA-seq/miRNA-seq abordagens também podem ser usadas para analisar as c?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 mice	Jackson Labs	664
Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine)	Fisher Scientific	MT 10-040-CV
FBS	Hyclone	SH300
HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL	Fisher Scientific - Hyclone	SV3007901
β-Mercaptoethanol	Fisher Scientific	44-420-3250ML
Falcon Cell Strainers	Fisher Scientific	21008-952
Trypan Blue Stain 0.04%	GIBCO/Life Technologies/Inv	15250
ACK Lysis Buffer	Fisher Scientific	BW10-548E
Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber	Fisher Scientific	02-671-51B
EasySep Magnet	Stem Cell Technologies	18000
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap	Fisher Scientific	14-959-1A
EasySep Mouse B cell Isolation Kit	Stem Cell Tech	19854
BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box	BD Biosciences	305199
PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody	BioLegend	142513 (25 ug)
PE-Cy7 B220 antibody	BioLegend	103222
7-AAD (1 mg)	Sigma Aldrich	A9400-1MG
APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody	Biolegend	103212
Mouse APC-IgG1 200 µg	Biolegend	406610
FITC anti-mouse IgM Antibody	Biolegend	406506
FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody	Biolegend	103206
PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2)	Biolegend	103208
HBSS 1X	Fisher Scientific	MT-21-022-CM
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated	Fisher Scientific	BP1600-100
LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5)	Sigma Aldrich	L2880-25MG
Recombinant mouse IL-4 (carrier-free)	BioLegend	574302 (size: 10 ug)
Valproic acid sodium salt	Sigma Aldrich	P4543
SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet	The Baker Company	SG404
Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator	Thermo Scientific	3950
Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205	Fisher Scientific	15-462-5Q
5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube	Fisher Scientific	14-959-5
Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	05-538-59A
1.7 mL Microtube, clear	Genesee	22-282
Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml	Fisher Scientific	06-443-18
ELMI SkySpin CM-6MT	ELMI	CM-6MT
Rotor 6M	ELMI	6M
Rotor 6M.06	ELMI	6M.06
Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller	Drummond Scientific	4-000-101
25 mL serological pipette tips	Fisher Scientific	89130-900
10 mL serological pipette tips	Fisher Scientific	89130-898
5 mL serological pipette tips	Fisher Scientific	898130-896
48-well plates	Fisher Scientific	07-200-86
Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated	Beckman Coulter	366802
GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance	Beckman Coulter	366650
Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated	Beckman Coulter	369434
TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle	Beckman Coulter	368298
Fisher Scientific AccuSpin Micro 17	Fisher Scientific	13-100-675
Fisher Scientific Analog Vortex Mixer	Fisher Scientific	02-215-365
miRNeasy Mini Kit (50)	Qiagen	217004
Direct-zol RNA MiniPrep kit	Zymo Research	R2050
Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology)	Fisher Scientific	BP1145-1
Rnase-Free Dnase set (50)	QIAGEN	79254
NanoDrop 2000 Spectrophotometers	Thermo Scientific	ND-2000
Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR	Invitrogen	175013897
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-rad	172-5121
Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25	Fisher	14-230-244
Microseal 'B' Adhesive Seals	Bio-Rad	MSB-1001
MyiQ Optics Module	Bio-Rad	170-9744
iCycler Chassis	Bio-Rad	170-8701
Optical Kit	Bio-Rad	170-9752
BD LSR II Flow Cytometry Analyzer	BD Biosciences
FACSDiva software	BD Biosciences
FlowJo 10	BD Biosciences
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2943CA
S200 Focused-ultrasonicator	Covaris	S200
SPRIworks Fragment Library System I for Illumina	Beckman Coulter	A288267
cBot Cluster Generation Station	illumina	SY-312-2001
HiSeq 2000 Genome Sequencer	Illumina	SY-401-1001
TruSeq RNA Library Prep Kit v2	Illumina	RS-122-2001
TruSeq Small RNA Library Prep Kit	Illumina	RS-200-0012
NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3	Bioo Scientific	5132-05
2200 TapeStation	Agilent	G2964AA