Modulation de génome induite par l’analyse des HDAC inhibiteur des microARN et ARNm dans B cellules amenées à soumises classe-commutateur de recombinaison de l’ADN et la différenciation des cellules de Plasma

Résumé

Des facteurs épigénétiques peuvent interagir avec les programmes génétiques de moduler l’expression des gènes et de réguler la fonction des cellules B. En combinant la stimulation in vitro de cellules B, qRT-PCR et haut débit micro-ARN-séquence et ordre d’ADN messagère approches, nous pouvons analyser la modulation épigénétique de miRNA et l’expression génique dans les cellules de B.

Résumé

Production d’anticorps est effectuées par plusieurs processus intrinsèques critique les lymphocytes B, dont le hypermutation somatique (SHM), classe-commutateur de recombinaison de l’ADN (RSE) et la différenciation des cellules de plasma. Ces dernières années, les modifications épigénétiques ou des facteurs tels que la désacétylation des histones et microARN (miARN), ont démontré d’interagir avec les programmes génétiques de cellules B pour la production d’anticorps forme, tandis que le dysfonctionnement des facteurs épigénétiques a été trouvé pour conduire à réponses d’auto-anticorps. Analysant le génome-large ARNm et miRNA expression dans les lymphocytes B en réponse aux modulateurs épigénétiques est importante pour comprendre la régulation épigénétique de la réponse anticorps et la fonction des lymphocytes B. Ici, nous démontrons un protocole pour induire des cellules B subissent une différenciation RSE et plasmocyte, traitant ces cellules B avec inhibiteurs d’histone désacétylase (HDAC) (IDH) et analyser l’expression d’ARNm et de micro-ARN. Dans ce protocole, nous analysons directement des séquences d’ADN (cDNA) complémentaires à l’aide de séquençage d’ADN messagère nouvelle génération (ARNm-seq) et technologies de miRNA-seq, cartographie du séquençage lit au génome et transcriptase inverse quantitative (qRT)-PCR. Avec ces approches, nous avons défini que, dans les cellules de B amenées à subir la RSE et la différenciation des cellules de plasma, HDI, un régulateur de l’épigénétique, sélectivement module l’expression de l’ARNm et miRNA et altère la différenciation RSE et plasmocyte.

Introduction

Marques épigénétiques ou facteurs tels que la méthylation de l’ADN et ARN non codants (y compris les microARN), modifications post-traductionnelles histone modulent la fonction des cellules en modifiant l' expression de gène¹. Modifications épigénétiques régulent la fonction des lymphocytes B, tels que la recombinaison de l’ADN-l’interrupteur de la classe immunoglobuline (RSE), hypermutation somatique (SHM) et la différenciation de cellules B mémoire ou plasmocytes, modulant ainsi les anticorps et les auto-anticorps réponses^2,3. RSE et SHM critique nécessitent déaminase cytidine induite par l’activation (aide, codé comme Aicda), qui est fortement induite dans les cellules en réponse à T-dépendante et d’antigènes T-indépendants⁴B. Cellules de B classe-commuté/hypermutated encore différencient en plasmocytes, qui sécrètent de grandes quantités d’anticorps de façon critique dépendante de la protéine induite par le lymphocyte B maturation 1 (Blimp1, codé comme Prdm1)⁵. Les changements épigénétiques anormaux dans les cellules de B peuvent entraîner des réponses anticorps/auto-anticorps aberrants, qui peuvent conduire à une réaction allergique ou d’auto-immunité^1,4. Comprendre comment épigénétiques facteurs, tels que les miARN, moduler intrinsèques cellules B l’expression des gènes n’est pas seulement importante pour le développement de vaccins, mais il est également essentielle de révéler les mécanismes de réactions anticorps anormaux/auto-anticorps potentielles.

Désacétylation et l’acétylation des histones sont des modifications des résidus lysine sur histones généralement catalysées par acétyltransférase d’histone (HAT) et histone désacétylase (HDAC). Ces modifications conduisent à l’accessibilité croissante ou décroissante de la chromatine et encore autoriser ou empêchent la fixation de facteurs de transcription ou des protéines à l’ADN et l’altération du gène expression^{5,6, 7 , 8}. inhibiteurs d’HDAC (HDI) sont une classe de composés qui interfèrent avec la fonction de HDACs. Ici, nous avons utilisé le HDI (APV) d’aborder la réglementation des HDAC sur le profil d’expression génique intrinsèque des cellules B et sur son mécanisme.

miARN est petites, non codantes RNAs environ 18 à 22 nucléotides de longueur qui sont générés par plusieurs étapes. miRNA hôte gènes sont transcrits et forment en épingle à cheveux microARN primaire (pri-miARN). Ils sont exportés vers le cytoplasme, où les pri-miARN est transformés en précurseur miARN (pré-miARN). Enfin, les miARN matures est formés par le clivage de la pré-miARN. miARN reconnaître les séquences complémentaires dans la région 3' non traduite de leurs cibles ARNm^6,7. Par le biais de silence post-transcriptionnelle, miRNAs réguler l’activité cellulaire, tels que la prolifération, la différenciation et l’apoptose^10,11. Étant donné que plusieurs miARN peut cibler le même ARNm, et un seul miRNA peut potentiellement cibler plusieurs ARNm, il est important d’avoir une vue dans le contexte du profil de l’expression de miRNA pour comprendre la valeur de l’individu et l’effet combiné des miARN. miARN ont été démontré d’être impliqués dans le développement des cellules B et différenciation des périphérique, ainsi que différenciation des lymphocytes B spécifiques au stade, réaction immunitaire et auto-immunité^1,4,9. Dans la région 3' UTR de Aicda et Prdm1, il y a plusieurs sites évolutivement conservés validés ou prévisible pouvant être ciblées par les miARN⁸.

Modulation épigénétique, y compris la modification post-transcriptionnelle d’histone et miARN, afficher un modèle de règlement spécifique au stade de type cellulaire et cellules de gene expression⁹. Nous décrivons ici les méthodes pour définir la modulation induite par l’IDH de miRNA et expression ARNm, la RSE et la différenciation des cellules de plasma. Il s’agit de protocoles permettant d’induire des cellules B à subir la RSE et la différenciation des cellules de plasma ; pour traiter les cellules B avec HDI ; et pour analyser l’expression de l’ARNm et miRNA par qRT-PCR, miRNA-seq et ARNm-seq^{10,11,12,8,13}.

Protocole

le protocole suit les directives de protection des animaux de l’Institutional Animal soins et utilisation des comités de l’Université du Texas Health Science Center à San Antonio.

1. stimulation de cellules B de souris pour la RSE, la différenciation des cellules de Plasma et le traitement de HDI

1. préparation des suspensions de cellules de rate
   Remarque : Exécutez toutes les étapes dans une hotte à flux laminaire à l’exception de la souris l’euthanasie et la dissection.
   1. Euthanasier le spécifiques exempts de micro-organismes pathogènes C57BL/6J de souris (8-12 semaines d’âge) par inhalation de CO ₂.
   2. Poser la souris sur dissection Conseil avec l’abdomen vers le haut. Épingler les quatre pattes de la souris avec aiguilles hypodermiques de calibre 18, 1,5 po.
   3. Stériliser la peau à l’aide de lingettes imbibées d’éthanol de 70 %.
   4. Utiliser un ensemble des outils chirurgicaux stérilisés à l’autoclave (pinces et ciseaux de dissection) pour couper à travers la peau juste en dessous de la cage thoracique pour visualiser la rate (sur le côté gauche de l’abdomen, juste en dessous du foie).
   5. Utiliser un autre pince stérile et ciseaux ciseaux pour extraire la rate, qui se trouve sous la grande courbure de l’estomac, de la rate de serrage doucement avec une pince et en coupant tout le tissu social avec dissection. N’oubliez pas d’enlever tout le tissu social.
   6. Placer la rate dans un tube de microtubes de 1,5 mL contenant 1 000 µL de milieu RPMI1640 complet (milieu RPMI 1640 additionné de sérum de veau foetal inactivés par la chaleur de 10 % (SVF), 2 mM de L-glutamine, 100 µg/mL de pénicilline, 100 µg/mL streptomycine, 0,25 µg/mL d’amphotéricine B et 50 µM β-mercaptoéthanol).
   7. Placer une crépine de cellule de 70 µm dans un tube à centrifuger coniques en polypropylène 50 mL et versez la rate du tube microcentrifuge sur la crépine de la cellule. Utilisez la pointe d’un tube à centrifuger conique polypropylène 15 mL à écraser doucement la rate à travers la passoire. Rincer la crépine de la cellule avec 15 à 20 mL de milieu complet.
   8. Spin down les cellules à 350 x g pendant 5 min et jeter le surnageant.
   9. Enlever les globules rouges et les suspensions de cellules de rate. Resuspendre le culot dans tampon de lyse ACK (5 mL / rate). Incuber pendant 4 min à température ambiante en agitant occasionnellement et puis étancher avec 25 mL de milieu complet.
   10. Spin bas les cellules à 350 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant. Resuspendre le culot dans 1 ou 10 mL de milieu complet. Compter les cellules viables utilisant un hémocytomètre.
2. Isolement de cellules B
   Remarque : cellules B isoler par sélection négative suivant le fabricant ' instructions de s. Cellules non-B sont destinés à un enlèvement avec anticorps biotinylé dirigés contre les cellules non B (CD4, CD8, CD11b, CD43, CD49b, CD90.2, Ly-6C/G (Gr-1) et TER119) et des particules magnétiques streptavidine. Tube fond rond de
   1. préparer une suspension de cellules de 0,25 à 2 mL de 1 x 10 ⁸ cellules/mL dans le milieu complet dans un polystyrène stériles 5 mL (12 x 75 mm). Ajoute l’échantillon de sérum de rat normal (50 µL/mL).
   2. Isolation de µL/mL ajouter 50 cocktail à l’échantillon. Les cellules de la composition de pipetage doucement vers le haut et vers le bas de 2 - 3 fois et incuber à température ambiante pendant 10 min.
   3. Ajouter 75 µL/mL streptavidine particules magnétiques à l’échantillon. Mélanger le mélange de pipetage doucement haut et en bas 2 - 3 fois et laisser incuber pendant 2,5 min à température ambiante.
   4. Ajouter le milieu RPMI 1640 complet. Les cellules de la composition de pipetage doucement et descendre de 2 - 3 fois.
   5. Placer le tube (sans le couvercle) dans l’aimant et incuber à température ambiante pendant 2,5 min. Pour désactiver le surnageant contenant des cellules de B intactes dans un nouveau tube conique de 15 mL.
   6. Compter les cellules viables utilisant un hémocytomètre et une tache bleu Trypan. Évaluer la pureté des cellules B par analyse en cytométrie en flux de marqueurs de surface de cellules B, tels que B220 et CD19.
3. Stimulation des lymphocytes B et traitement HDI
   1. remettre en suspension les cellules B purifiées en milieu RPMI 1640 complet à une concentration finale de 0,3 x 10 ⁶ cellules/mL.
   2. Utiliser une plaque de culture de cellules de 48 puits de culture cellulaire. Pour chaque puits, ajouter 1 mL de suspension de cellules B purifiée (0,3 x 10 ⁶ cellules/mL), LPS (concentration finale de 3 µg/mL) d’Escherichia coli, IL-4 (concentration finale de 5 ng/mL) et 0 ou 500 µM HDI (acide valproïque ; APV).
   3. Incuber les cellules à 37 ° C et 5 % de CO ₂ pendant 60 h pour qRT-PCR et l’analyse de haut débit ARNm et miRNA-séquençage, ou 96 h pour analyse en cytométrie en flux.
4. Analyse d’écoulement cytometry de RSE et de la différenciation des cellules de plasma
   1. après 96 h de culture, détacher les cellules de chaque puits en pipettant également, les cellules de haut en bas plusieurs fois. Transférer la suspension de cellules dans un tube de microtubes de 1,5 mL. Tournez en bas les cellules à 350 x g pendant 5 min à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse et éliminer le surnageant.
   2. Remettre en suspension les cellules avec 100 µL de tampon HBSS contenant 1 % de BSA et 0,5 ng/mL (FITC) fluorescéine - chèvre conjugué anti anticorps d’IgM à la souris – (Ab) , 0,2 ng/mL allophycocyanin (APC)-anti-souris conjugués rat IgG1 anticorps monoclonal Ab (mAb), 0,2 phycoérythrine ng/mL (PE)-conjugué rat anti-souris B220 mAb, 0,2 ng/mL PE-Cy7-conjugué rat anti-souris CD138 mAb et 2 ng/mL 7-Aminoactinomycine D (7-AAD).
   3. Incuber les cellules avec l’anticorps conjugué à fluorescence (étape 1.4.2) dans l’obscurité à température ambiante pendant 30 min.
   4. Laver les cellules avec 1 mL de HBSS avec 1 % de BSA.
   5. Spin down les cellules à 1 500 g pendant 5 min à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse et jeter le surnageant.
   6. Remettre en suspension les cellules dans 300 µL d’HBSS avec 1 % de BSA et transférer la suspension cellulaire dans un tube à fond rond en polystyrène. Couvrir le tube d’aluminium pour éviter l’exposition à la lumière.
   7. Perform analyse en cytométrie en flux sur une suspension de cellules individuelles. Recueillir 50 000 manifestations pour chaque échantillon de compensation et 250 000 pour les autres échantillons. Analyser les données à l’aide de matériel logiciels.
   8. Éliminer les débris et les doublets en utilisant une grille de géométrie de pouls (FSC-H x FSC-a et SSC-H x SSC-A). Gate convenablement l’intrigue sur 7-AAD pour exclure les cellules mortes.

2. High-Throughput ARNm-Seq

1. après 60 h de culture, extraire l’ARN total de 2 à 4 × 10 ⁶ cellules à l’aide d’un kit d’isolement total d’ARN qui peut récupérer les petits ARN suivant le fabricant ' instructions de s. Inclure une DNase I étape traitement.
2. Vérifier l’intégrité de RNA à l’aide d’un bioanalyzer, suivant le fabricant ' instructions de s.
3. Utiliser 500-1 000 ng d’ARN total de haute qualité (nombre de RNA intégrité RIN > 8.0) pour RNA-seq, préparation de la bibliothèque avec un ARN commercial échantillon pkit REP suivant le fabricant ' instructions de s.
4. Mettre en commun les bibliothèques individuelles ARNm-seq issus de leurs portions respectives 6-bp index des cartes et les bibliothèques à 50 bp/séquence de séquences. Utiliser un système d’ADN de haut débit selon le fabricant ' protocoles de s.
5. Après la manche de séquençage, démultiplexer avec CASAVA pour générer le fichier fastq pour chaque échantillon. Effectuer des lectures de cartographie et l’analyse bio-informatique, comme précédemment indiqué ¹¹.
6. Aligner toutes les lectures de séquençage avec leurs génomes de référence (UCSC souris génome build mm9) à l’aide de paramètres par défaut TopHat2 ¹⁴. Traiter les fichiers de bam d’alignement à l’aide de HTSeq-comte d’obtenir les coups par gène dans tous les échantillons.

3. High-Throughput miRNA-Seq

1. utilisation 100 ng-1 µg d’ARN total de haute qualité, tel qu’établi dans l’étape 2.1, pour petite fabrication de bibliothèque RNA-seq au moyen d’une petite trousse commerciale de RNA-seq.
2. Ligate le dégénéré 3 ' adaptateur sur 5 ′ extrémités des petites molécules d’ARN départ avec un kit de ligature commerciales. Ligaturer le dégénéré 5 ' adaptateur sur les 3 ′ extrémités des petites molécules d’ARN départ avec un kit de ligature commerciales. Convertir l’ARN en ADNc par transcription inverse et amplifier la petite bibliothèque de RNA-seq par amplification PCR avec les kits commerciaux.
3. Utilisez un gel des PAGE natif de 6 % TBE pour isoler la petite bibliothèque de RNA-seq finale. Exécutez le gel avec 1 tampon X TBE à 200 V, jusqu'à ce que le groupe de suivi de colorant bleu de bromophénol rapproche de l’extrémité du gel (0,5 - 1 cm).
4. Retirer le gel sur les plaques de verre et coloration au bromure d’éthidium (0,5 µg/mL dans l’eau) dans un récipient propre pour 2-3 min. visualiser le gel des bandes sur un Transilluminateur UV ou un autre instrument de documentation gel.
5. Coupe hors de la bande de ~ 150-bp à l’aide d’un rasoir propre et la placer dans un tube de 1,7 mL.
6. Extraire l’ADN à l’aide d’un gel extraction kit selon les instructions du fabricant.
7. Vérifier la granulométrie de la bibliothèque finale avec un test d’ADN de haute sensibilité commerciale et de la concentration avec un test d’ADN double brin commercial par les fabricants ' instructions.
8. Mettre en commun les bibliothèques par amplification et un séquençage ultérieur exécutés avec un système commercial de séquençage de l’ADN de haut-débit par le fabricant ' protocoles de s.
9. Démultiplexer avec CASAVA pour générer le fichier fastq pour chaque échantillon par le fabricant ' protocoles de s.
10. Pour petite analyse de RNA-seq de chaque échantillon, utilisez scintillement pour petit alignement de RNA par le fabricant ' protocoles de s.
    1. Enlever les lectures qui sont alignées sur les contaminants, tels que les mitochondries, ARNr, apprêts, etc..
    2. Aligner les données pour mûrir des séquences de miRNA.
    3. Aligner les données à des séquences de boucle en épingle à cheveux (précurseur miRNA).
    4. Aligner les données à d’autres petits RNA séquences (en utilisant la base de données fRNA) ¹⁵.
11. Une fois que tous les échantillons sont quantifiés, définir les miARN différentielle exprimée entre différents groupes/échantillons. Prévoir des miARN qui ciblent certains ARNm ou ARNm peut être ciblées par une miRNA sélectif à l’aide des outils de prédiction de cible en ligne miRNA, comme PicTar TargetScan ¹⁶ et microcosme ^{17 18} .
12. Si l’annotation ou la voie de l’analyse fonctionnelle est nécessaire, soumettre les gènes prédits à l’analyse Ingenuity Pathway (IPA) ou DAVID.

4. RT-PCR quantitative (qRT-PCR) de l’ARNm et miRNAs

1. qRT-PCR analyse d’ADN messagère
   1. ARN extrait de 0,2 à 5 × 10 ⁶ cellules à l’aide d’un commercial kit d’isolement total d’ARN qui peut récupérer les petits ARN, suite à la Référence du fabricant ' instructions de s. Inclure une DNase I étape traitement.
   2. Faire la synthèse de cDNA de l’ARN total avec un système de synthèse de cDNA de premier-brin à l’aide d’amorces oligo-dT.
   3. Chiffrer cDNA par qRT-PCR avec des amorces appropriées, à l’aide de 2 x en temps réel mélange maître PCR avec le protocole suivant : 95 ° C pendant 15 s, 40 cycles de 94 ° C pendant 10 s, 60 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 30 s.
   4. D’acquisition de données pendant l’étape de 72 ° C extension et effectuer l’analyse des courbes de fusion de 72 à 95 ° C.
2. qRT-PCR analyse de miRNA
   1. RNA aliquote de l’échantillon préparé à l’étape 4.1.1.
   2. Reverse-transcrire l’ARN en ADNc. Utiliser un kit de transcription inverse commerciale microARN, suivant le fabricant ' instructions de s.
   3. Effectuer la PCR en temps réel pour les micro-ARN, à l’aide d’un mélange maître de SYBR Green sur PCR en temps réel avec 250 nM miARN matures avant des amorces en conjonction avec une amorce universelle inverse. Apprêt
      1. dégel 2 x PCR Master Mix, miRNA spécifiques apprêt avant et arrière universel à température ambiante. Mélanger les solutions individuelles.
      2. Préparer un mélange de réaction comme suit pour un volume de 25 µL par puits réaction (utilisé en plaques PCR 96 puits) :
         2 x PCR Master Mix 12,5 µL
         miRNA transmettre amorces (2,5 μM) 2,5 µL
         Universal reverse primer (2,5 μM) 2,5 µL
         RN exempte d’ASE water5 µL
      3. Ajouter 22,5 μl du mélange réactionnel à une plaque PCR 96 puits. Ajouter 2,5 µL de modèle cDNA (50 pg-3 ng) dans les puits individuels plaque.
      4. Sceller hermétiquement le film de la plaque. Centrifuger la plaque pendant 1 min à 1 000 x g et la température de la pièce.
      5. Placer la plaque dans le cycler en temps réel et démarrer le programme de cyclisme suivant : 95 ° C pendant 5 min, 40 cycles de 94 ° C pendant 15 s, 55 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 30 s.
   4. Utiliser la méthode ΔΔCt pour l’analyse de données qRT-PCR avec une feuille de calcul. Normaliser l’expression de la miARN pertinentes à l’expression des petit nucléaire/nucléolaire RNAs Rnu6/RNU61/2, Snord61/SNORD61, Snord68/SNORD68 et Snord70/SNORD70.
3. Analyse statistique
   1. effectuer une analyse statistique pour déterminer les valeurs de p par appariés et non appariés étudiant ' s t - test à l’aide d’un tableur et prendre en considération les valeurs p < 0,05 comme significative.

Résultats

En utilisant notre protocole, purifié des cellules B placés au LPS (3 µg/mL) et IL-4 (5 ng/mL) pour 96 h peut induire des 30 à 40 % de la RSE à IgG1 et environ 10 % de la différenciation des cellules de plasma. Après le traitement avec l’IDH (500µM APV), la RSE à IgG1 a diminué de 10 à 20 %, tandis que la différenciation des cellules de plasma a diminué à environ 2 % (Figure 1). Inhibition de la RSE par HDI a été confirmée par une diminution après reco...

Discussion

Ce protocole prévoit des approches globales pour induire la commutation de classe B cellulaire et la différenciation des cellules de plasma ; d’analyser leur impact par des modulateurs épigénétiques, nommément HDI ; et pour détecter l’effet du HDI sur l’expression de l’ARNm et miRNA dans ces cellules. La plupart de ces approches permet également d’analyser l’impact des facteurs épigénétiques sur expression humaine de B-cellule fonction et ARNm/miRNA. Les qRT-PCR et les approches de l’ARNm-seq/m...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 mice	Jackson Labs	664
Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine)	Fisher Scientific	MT 10-040-CV
FBS	Hyclone	SH300
HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL	Fisher Scientific - Hyclone	SV3007901
β-Mercaptoethanol	Fisher Scientific	44-420-3250ML
Falcon Cell Strainers	Fisher Scientific	21008-952
Trypan Blue Stain 0.04%	GIBCO/Life Technologies/Inv	15250
ACK Lysis Buffer	Fisher Scientific	BW10-548E
Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber	Fisher Scientific	02-671-51B
EasySep Magnet	Stem Cell Technologies	18000
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap	Fisher Scientific	14-959-1A
EasySep Mouse B cell Isolation Kit	Stem Cell Tech	19854
BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box	BD Biosciences	305199
PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody	BioLegend	142513 (25 ug)
PE-Cy7 B220 antibody	BioLegend	103222
7-AAD (1 mg)	Sigma Aldrich	A9400-1MG
APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody	Biolegend	103212
Mouse APC-IgG1 200 µg	Biolegend	406610
FITC anti-mouse IgM Antibody	Biolegend	406506
FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody	Biolegend	103206
PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2)	Biolegend	103208
HBSS 1X	Fisher Scientific	MT-21-022-CM
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated	Fisher Scientific	BP1600-100
LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5)	Sigma Aldrich	L2880-25MG
Recombinant mouse IL-4 (carrier-free)	BioLegend	574302 (size: 10 ug)
Valproic acid sodium salt	Sigma Aldrich	P4543
SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet	The Baker Company	SG404
Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator	Thermo Scientific	3950
Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205	Fisher Scientific	15-462-5Q
5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube	Fisher Scientific	14-959-5
Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	05-538-59A
1.7 mL Microtube, clear	Genesee	22-282
Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml	Fisher Scientific	06-443-18
ELMI SkySpin CM-6MT	ELMI	CM-6MT
Rotor 6M	ELMI	6M
Rotor 6M.06	ELMI	6M.06
Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller	Drummond Scientific	4-000-101
25 mL serological pipette tips	Fisher Scientific	89130-900
10 mL serological pipette tips	Fisher Scientific	89130-898
5 mL serological pipette tips	Fisher Scientific	898130-896
48-well plates	Fisher Scientific	07-200-86
Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated	Beckman Coulter	366802
GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance	Beckman Coulter	366650
Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated	Beckman Coulter	369434
TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle	Beckman Coulter	368298
Fisher Scientific AccuSpin Micro 17	Fisher Scientific	13-100-675
Fisher Scientific Analog Vortex Mixer	Fisher Scientific	02-215-365
miRNeasy Mini Kit (50)	Qiagen	217004
Direct-zol RNA MiniPrep kit	Zymo Research	R2050
Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology)	Fisher Scientific	BP1145-1
Rnase-Free Dnase set (50)	QIAGEN	79254
NanoDrop 2000 Spectrophotometers	Thermo Scientific	ND-2000
Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR	Invitrogen	175013897
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-rad	172-5121
Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25	Fisher	14-230-244
Microseal 'B' Adhesive Seals	Bio-Rad	MSB-1001
MyiQ Optics Module	Bio-Rad	170-9744
iCycler Chassis	Bio-Rad	170-8701
Optical Kit	Bio-Rad	170-9752
BD LSR II Flow Cytometry Analyzer	BD Biosciences
FACSDiva software	BD Biosciences
FlowJo 10	BD Biosciences
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2943CA
S200 Focused-ultrasonicator	Covaris	S200
SPRIworks Fragment Library System I for Illumina	Beckman Coulter	A288267
cBot Cluster Generation Station	illumina	SY-312-2001
HiSeq 2000 Genome Sequencer	Illumina	SY-401-1001
TruSeq RNA Library Prep Kit v2	Illumina	RS-122-2001
TruSeq Small RNA Library Prep Kit	Illumina	RS-200-0012
NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3	Bioo Scientific	5132-05
2200 TapeStation	Agilent	G2964AA