التلاعب وظيفي من الأم جين المنتجات التي تستخدم<em&gt; في المختبر</em&gt; نضوج البويضة في الزرد

Summary

ويرد بروتوكول الأمثل لنضوج البويضات في المختبر من الزرد تستخدم للتلاعب من المنتجات الجينات الأمهات هنا.

Abstract

هي التي تحرك الأحداث الخلوية التي تحدث أثناء المراحل الأولى من التطور الجنيني الحيوانية من المنتجات الجينات المستمدة أمهات المودعة في البويضة النامية. لأن هذه الأحداث تعتمد على المنتجات الأمهات التي تعمل عادة في وقت قريب جدا بعد الإخصاب التي preexist داخل البيضة، نهجا موحدة للتعبير والحد من ظيفية تنطوي على حقن الكواشف داخل البويضة المخصبة غير فعالة عادة. بدلا من ذلك، يجب إجراء هذه المناورات خلال مراحل تكوين البويضات، قبل أو أثناء تراكم المنتجات الأمهات. توضح هذه المقالة بالتفصيل بروتوكول لنضوج البويضات في المختبر من الزرد غير ناضجة والتسميد في وقت لاحق في المختبر، مما أسفر عن أجنة قابلة للحياة التي تعيش إلى سن البلوغ. هذا الأسلوب يسمح للتلاعب وظيفي للمنتجات الأمهات أثناء مراحل تكوين البويضات، مثل التعبير من المنتجات لإنقاذ المظهرية والمعلمة والتصور بناء، وكذلك لق الحد من وظيفة الجين من خلال وكلاء عكس علم الوراثة.

Introduction

خلال تنمية الحيوانية، والودائع الأم منتجات الجين (على سبيل المثال، الرنا والبروتينات والجزيئات الحيوية الأخرى) داخل البويضة. هذه المنتجات هي مهمة للعمليات الخلوية الأولى مباشرة بعد الإخصاب ^{1 و 2.} التلاعب في التعبير وظيفة من المنتجات الأمهات عادة غير فعالة عند استخدام نهج موحد لحقن الكواشف في بويضات المخصبة ^3. وذلك لأن يتم إنتاج معظم الرنا والبروتينات التي البويضة خلال مراحل تكوين البويضات، من المنتجات للأمهات قبل تحميلها موجودة في بويضة ناضجة بالفعل. هذه المنتجات الموجودة مسبقا هي منيع لضربة قاضية وظيفية مع الجينات التي تستهدف وكلاء، مثل oligos Morpholino العقاقير (موس)، لأن المنظمات الأعضاء استهداف مرنا، وليس البروتين موجودة مسبقا موجودة بالفعل في البيضة عند التلقيح. وبالإضافة إلى ذلك، تحدث العديد من العمليات الجنيني المبكر في وقت قريب جدا بعد الإخصاب إلى أن influenدائرة الهندسة المدنية من منتجات البروتين مشتقة من RNA حقنها في البويضة المخصبة، كما RNA قد لا يتم إنتاجها بسرعة كافية للتأثير على الأحداث الأولى من التطور الجنيني. لنفس السبب، الموسومة اندماج بروتين وأعرب عن طريق حقن مرنا في البويضة المخصبة قد لا يتم إنتاجها في الوقت المناسب لالتصور خلال دورها الفاعل في الجنين في وقت مبكر. حقن البويضات الناضجة مقذوف قبل تفعيل البيض ممكن ولكنه يترافق مع القضايا الفنية مماثلة: بالفعل هذه البيض نضجا محملة مسبقا مع البروتين الأمهات، وأنها لن تصبح نشطة translationally (أي إنتاج بروتين من محاضر الخارجية) حتى بعد البيض التنشيط. لهذه الأسباب، والتلاعب في المنتجات الجين الأم تعمل في مرحلة التطور الجنيني المبكر يحتاج عادة إلى القيام بها أثناء مراحل تكوين البويضات في البويضة تنضج.

مع اقتراب موعد واحد للتغلب على هذه العقبات، في أساليب نضوج في المختبر، والتي تسمح للنضوج شركة النفط العمانيةytes من المرحلة الرابعة لتشكيل البيض، وقد تم تأسيسها في الزرد. طرق مبكرة سمحت في نضوج في المختبر، ولكن كانت البيض نضجا مما أدى يست مختصة للإخصاب ^4. وفي وقت لاحق، والتلاعب في ظروف التربية من محايدة إلى درجة الحموضة 9.0، محاكاة درجة الحموضة القلوية من السائل المبيض وجدت في أنواع الأسماك ^{5، 6،} سمح لموثوق التخصيب في المختبر (IVF) في المختبر بعد نضوج ^{7 و 8.} في الواقع، يمكن في المختبر البويضات -matured تسفر الأجنة قابلة للحياة التي تعيش إلى مرحلة البلوغ والتي هي خصبة ^{3 و 8.} وقد تم تكييف هذه الطريقة تحسن أبعد لتشمل التلاعب الوظيفي للجينات الأم، والتعبير عن البروتينات الموسومة خلال مراحل تكوين البويضات الزرد من خلال التعبير خارجي، وMO بوساطة ظيفية نهدم في حصيرةمرحلة أورينغ IV البويضات ³ (الشكل 1).

مراحل تكوين البويضات الزرد يعرض عدد من المراحل المميزة التي أدت إلى تشكيل البويضات الناضجة ⁹ (انظر الجدول رقم 1 لدليل سريع إلى مراحل مختلفة في مراحل تكوين البويضات). لفترة وجيزة، وبدأ تطور البويضة بواسطة البويضات المرحلة الأولى ويتم إلقاء القبض عليه في مرحلة طور التضعف من الطور الأول من الانقسام الاختزالي. هذه البويضات تخضع النمو من خلال النسخ النشط (بدأت خلال مراحل IA وIB)، وتشكيل الحويصلات القشرية (المعروف أيضا باسم حبيبات القشرية، التي بدأت خلال المرحلة الثانية)، وتكون المح (بدأت خلال المرحلة الثالثة). اكتمال نمو البويضة خلال المرحلة الرابعة، عندما الانقسام الاختزالي يستأنف الأول، مما أدى إلى تفكك نواة بويضة، ويشار إلى الحويصلة الجرثومية (GV). وفي وقت لاحق، تم إلقاء القبض الانقسام الاختزالي مرة أخرى في الطورية II. الانتهاء من نمو البويضة واعتقال الانتصافي خلال المرحلة الرابعة يؤدي إلى مرحلة ناضجة V على سبيل المثالز ^9. تحدث إزالة غشاء مسامي خلال الافراج عن البويضة في تجويف المبيض ¹⁰ و ضرورية للإخصاب وتفعيل البيض السليم. مرة واحدة تنبثق البيض من الأم أثناء التزاوج الطبيعي، فإنها تصبح تفعيلها. في الزرد، والتعرض للمياه كافية لتفعيل البيض الكامل، بغض النظر عن وجود الحيوانات المنوية ^11.

في ظروف المختبر يسمح حاليا للنضوج البويضات من المرحلة المبكرة IV-التي يمكن التعرف عليه بواسطة حجمها (690-730 ميكرون)، وجود GV كبير في وضع غير المتماثلة، ومظهر معتم تماما بسبب تراكم بروتينات صفار (الشكل 2B) -to ناضجة مرحلة V البيض، وتتميز GV تفكيكها تماما ومظهر شفاف المقرر أن صفار معالجة بروتين ¹² (الشكل 2C). في هذا النهج، المبايض كلها تابعتتم إزالة aining البويضات في مراحل مختلفة من التنمية من الإناث. يسمح البويضات لتطوير في 17α-20β-dihydroxy-4 pregnen-3-واحد (DHP)، فعال يحفز نضوج هرمون ^8. خلال هذه الفترة، البويضات النضج يمكن التلاعب بها من خلال حقن التعبير (على سبيل المثال، توج، في المختبر -transcribed من mRNAs) أو عكس علم الوراثة وكلاء (على سبيل المثال، موس). طبقة الجريبي لا يلقي عفويا في نهاية فترة النضج، لذلك يجب إزالتها يدويا. بعد defolliculation، ويتحقق التخصيب في المختبر عن طريق إحداث تنشيط البويضة من خلال التعرض للالبيض في الماء (موجودا في الجنين المتوسطة (E3)) ^13، وإيجاد حل الحيوانات المنوية. وبيضات ملقحة الناتجة تخضع التطور الجنيني وتسمح لتقييم قدرة العلاجات التلاعب وظيفة الجين الأم ولتصور وتحليل المنتجات الأمهات الموسومة ( الشكل 3).

Protocol

تم التعامل مع جميع الزرد بما يتفق تماما مع الممارسة الحيوانية جيدة، على النحو المحدد من قبل هيئات الرفق بالحيوان وطنية و / أو المحلية ذات الصلة، وتمت الموافقة على جميع الأعمال الحيوان من قبل اللجنة المختصة (جامعة ويسكونسن ماديسون ضمان عدد A3368-01). واستمرت الحيوانات تحت ظروف قياسية في 26.5 درجة مئوية.

1. ما قبل مختارة من الإناث

ملاحظة: البويضات في الإناث البالغات تمتد عادة مجموعة من مراحل النمو، من المرحلة الأولى لV (الشكل 2). تطهير الإناث من البويضات الموجودة مسبقا من خلال التزاوج الطبيعي ناجحة يزيد تزامن انطلاق البويضة، كما تظهر البويضات النامية حديثا كما فوج ^{3، 14.} في غضون نحو 8 أيام بعد تطهير معظم البويضات في المرحلة الرابعة في وقت مبكر، وهو الأمثل لبدء في المختبر النضج. هذا التزامن يزيد من العائد من ثا البويضاتتي يمكن أن تذهب من خلال عملية كاملة في المختبر النضج، وتسهيل التلاعب التجريبية. يرجى مراجعة الأوصاف السابقة ¹³ للحصول على تفاصيل حول إعداد الأسماك في التزاوج تقرن وعلى تكوين أسماك المياه (هنا، 14 غراما من الملح البحري و 150 غرام من NaHCO ₃ في 1000 لتر من الماء التناضح العكسي، ودرجة الحموضة 6،5-8،5 (المدى فضل: 6.8 -7،5) والتوصيل من 180-360 ميكرو ثانية). رؤية العلامة التجارية وآخرون. ¹³ وصفات إضافية.

1. ثمانية إلى عشرة أيام قبل في المختبر التلاعب الثقافة، واستخدام شبكة السمك لنقل رجل واحد وامرأة واحدة الأسماك من سلالة المطلوب إلى خزان التزاوج. الزوج مجموعات متعددة. تركها في ليلة وضحاها خزان التزاوج. السماح لهم للتزاوج خلال المساء وخلال فترة ما بعد الظهر من اليوم التالي.
2. استخدام شبكة السمك لفصل الإناث التي تسفر عن البيض خلال التزاوج ووضعها في خزان منفصل. إطعام هؤلاء النساء مرتين يوميا مع خليط الغذاء containiنانوغرام حوالي مبلغ مساو من الأرتيميا ورقائق الأسماك. يجب أن يكون مقدار ما يكفي من الغذاء لتوفير ما يقرب من 20 دقيقة، ولكن ليس أكثر من ذلك، من الساعة التغذية.

2. إعداد نضوج متوسط

ملاحظة: إعداد المتوسطة النضج يوم في المختبر نضوج التجربة، في حدود 1 ساعة لإزالة البويضات من الإناث (انظر القسم 3).

1. إضافة 20 مل من المتوسط ​​ليبوفيتش L-15 مع L-الجلوتامين، ودرجة الحموضة 7.0 إلى أنبوب مخروطي 50 مل تحت ظروف معقمة. وصول بها إلى درجة الحموضة 9.0 مع 10 N هيدروكسيد الصوديوم.
2. إضافة 9 مل من المتوسط ​​L-15 ليبوفيتش، ودرجة الحموضة 9.0 إلى 2 منفصلة أنابيب مخروطية 50 مل. التسمية 1 أنبوب "+ DHP" والآخر "-DHP".
3. في أنبوب + DHP، إضافة 10 ميكرولتر من 17α-20β-dihydroxy-4 pregnen-3-واحد (DHP)، 490 ميكرولتر من درهم ₂ O، و 500 ميكرولتر من 10٪ الزلال المصل البقري (BSA).
4. في أنبوب -DHP، إضافة 100 ميكرولتر من 10 ملغ / مل الجنتاميسين، 40081؛ L من درهم ₂ O، و 500 ميكرولتر من 10٪ BSA.

3. تشريح البويضات وبدء في المختبر الثقافة

ملاحظة: ويتم في المختبر تجربة الثقافة خارجا مع الإناث محددة مسبقا بعد 8-10 أيام من الإفراج البيض من خلال التزاوج الطبيعي. استخدام المتوسطة النضج وجهت نفس اليوم (انظر القسم 2). البويضات الناضجة بشكل مناسب إذا بدأت تشريح قرب نهاية دورة نهاري الأسماك (تحدد في المختبر عن طريق الإضاءة الصناعية المحددة مسبقا في منشأة الأسماك) ^13، وربما العمليات التي تحدث من خلال التزاوج الطبيعي محاكاة. وهذا يعني أن معظم الخطوات في البروتوكول يجب أن تتم في المساء إذا ويعيش السمك في منشأة مع دورة ضوء معيار (على سبيل المثال، بدءا خطوة 3.2 في 06:00 في منشأة مع فترة الخفيفة 8:00 حتي 10:00)، على الرغم من أن العمل بدوام الفترات أخرى ممكنة مع دورة الضوء بشكل مناسب الوقت تحولت.

1. يعد حل الأسهم تريكين 0.2٪ في DH ₂ O، مخزنة لدرجة الحموضة 7.0 مع 1 M تريس، ودرجة الحموضة 9.0، والحفاظ على هذا الحل في 4 درجات مئوية. وهذا يمكن أن يكون مستعدا في وقت مبكر.
2. بدء التجربة 0-4 ساعة قبل نهاية دورة الخفيفة اليومية في المرفق. في كوب 250 مل، إضافة 20 مل من 0.2٪ محلول المخزون تريكين، ودرجة الحموضة 7.0 إلى 80 مل من الماء الأسماك والمزيج.
3. نقل الإناث محددة مسبقا إلى حل تريكين والموت ببطء لهم عن طريق التعرض المفرط. ترك الإناث في حل تريكين لمدة 15 دقيقة بعد توقف حركة الخيشومية.
4. باستخدام ملعقة، وجمع الأسماك الموت الرحيم من الحل تريكين وشطف لهم لفترة وجيزة في الماء الأسماك. ضع السمك على منشفة ورقية لامتصاص الماء الزائد.
5. استخدام شفرة حلاقة نظيفة لقطع رأس السمكة الموت الرحيم على مستوى الزعنفة الصدرية. باستخدام مقص تشريح، وجعل شق طولي على الجانب البطني من الأسماك، وتمتد من نهاية الأمامي لمنطقة الشرج.
6. ضع السمك في طبق بتري تحت المجهر تشريح مع الضوء الساقط. باستخدام زوج من ملقط تشريح، ونقل أجزاء المبيض إلى طبق الثقافة ملم 35 × 10 تحتوي على 4 مل من يبوفيتش L-15 متوسطة + DHP.
   ملاحظة: سوف المبايض، والتي تحتوي على البويضات النامية، تبدو وكأنها هياكل مبهمة وملتف داخل تجويف الجسم الداخلي.
7. باستخدام ملقط تشريح، فصل بلطف البويضات من الجماهير مسامي. ترتيب مرحلة مبكرة IV البويضات (الشكل 2B، قبل انهيار GV، في حجم شبه القصوى وتتميز الظلام، السيتوبلازم مبهمة وGV اضحة وضوح الشمس تقع غير متماثلة داخل البويضة). تجاهل البويضات في مراحل سابقة (الشكل 2A)، وشفافة، ناضجة البيض مرحلة V (مماثلة لتلك التي في الشكل 2C ولكن موجودة في المبيض قبل العلاج DHP).
   ويتم اختيار البويضات لنضج في المرحلة الرابعة في وقت مبكر، مرحلة مبكرة أن يؤدي ناضجة، مرحلة V oocyt: ملاحظةوفاق بعد الظروف ثقافة في المختبر (الشكل 2C وD) ^3. لأن البويضات المرحلة الرابعة تنتج بنشاط المنتجات، والتلاعب في هذه المرحلة يسمح للتعبير عن المنتجات الخارجية من خلال حقن RNA أو للحد من وظيفة الجين عبر المنظمات الأعضاء عرضه.
8. استخدام الماصة الزجاج باستور لنقل أوائل البويضات المرحلة الرابعة إلى الثانية 35 × 10 مم طبق ثقافة بلاستيكية تحتوي على 4 مل من يبوفيتش L-15 متوسطة + DHP. نقل كميات ضئيلة من -DHP المتوسطة إلى الطبق الذي يحتوي على حل + DHP.

4. إبر دقيقة جدا سيت

ملاحظة: عزل المرحلة الرابعة البويضات تمر في نضوج في المختبر يمكن microinjected لتقديم الكواشف للتلاعب وظيفي أو تعبير البروتين الموسومة. وMicroinjection من الكواشف، مثل مرنا والمنظمات الأعضاء (انظر القسم 4)، ويتم عادة خارجا عندما البويضات تشهد في المختبر matuالتموينية في + DHP المتوسطة، قبل defolliculation. إذا رغبت في ذلك، من أجل إتاحة المزيد من الوقت لإجراء التلاعب قبل نضوج البويضة، ويمكن أيضا أن يتم الحقن في -DHP المتوسطة، وذلك قبل النضج، لمدة 2 ساعة على الأقل. يمكنهم بعد ذلك يتم تحويلها إلى + DHP المتوسطة.

1. إعداد من mRNAs استخدام عدة التعبير القياسية. الاحتفاظ بها في -80 ° C باعتباره 100-500 خريج الأسهم / ميكرولتر للحقن بتركيز نهائي من 50-500 غ / ميكرولتر (200 غ / ميكرولتر مستحسن) في المياه RNA الصف. إعداد المنظمات الأعضاء في تركيز 4 نانوغرام / ميكرولتر في الماء وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. ضخها في تركيزات النهائي من 2 نانوغرام / ميكرولتر (أو كما تحدد تجريبيا).
   تتم الحقن عادة في + DHP المتوسطة قبل defolliculation (انظر الملاحظة في القسم 5): ملاحظة.
2. إذا حقن مرنا، مباشرة قبل الحقن، وتمييع مرنا باستخدام RNA الصف المياه التناضح العكسي و 0.2 M بوكل لتحقيق الحل النهائي من 0.1 M بوكل.
3. إذا حقن المنظمات الأعضاء، مباشرة قبل الحقن، ويخفف من المنظمات الأعضاء إلى التركيز المطلوب باستخدام المياه التناضح العكسي و 0.2 M بوكل لتحقيق الحل النهائي من 0.1 M بوكل.
4. عقد يدويا البويضات مع ملقط غرامة وحقن ما يقرب من 1 NL إلى البرية من نوع البويضات المرحلة الرابعة باستخدام إبرة مصنوعة مع سحب الزجاج الشعرية ماصة.
   1. إعداد الإبر الزجاج عن طريق سحب ساخنة أنابيب زجاجية الشعرية، وتحميل الحل ليتم حقنه، وكسر رأس الإبرة مع ملقط، كما هو موضح سابقا في بروتوكولات لحقن القياسية في الأجنة المبكرة الزرد ^15.
      ملاحظة: من المفيد أن الإبرة لديها تفتق تدريجي وليس مفاجئ واحد. وهذا يسمح بمزيد من المرونة من حيث مكان وجود كسر في رأس الإبرة وأيضا يساعد على منع تلف الجنين حقن. باستخدام نفس الإبرة والحل بالنسبة للحقن الجنين، وضبط حجم حقن من قبل تحديدضبط ضغط microinjector التي تنتج حجم المطلوب. يمكن تحديد هذه الإعدادات وهمية عن طريق الحقن في قطرة من الزيت المعدني على شريحة المجهر مرحلة المعايرة (0.01 مم) وضبط الإعدادات microinjector للحصول على القطر المطلوب في البلعة من حل حقن، كما هو موضح سابقا ^(15).

5. سيت النضج وDefolliculation

ملاحظة: أثناء نضوج البويضة، فإن البويضات تصبح شفافة تدريجيا، والذي يسمح لتقييم ظروف التربية الناجحة.

1. مواصلة احتضان غير ناضجة (وإذا المناسبة، حقن) البويضات في + DHP المتوسطة في 26.5 درجة مئوية، وفحص دوري (كل 30 دقيقة) للتأكد من أن البويضات لا تزال سليمة وتشهد نضوج الصحيح قبل أن تصبح شفافة تدريجيا (انظر الشكل 2C) .
   1. إزالة أي البويضات الناشر مع ماصة باستور والتخلص منهافي كوب النفايات مختبر للحفاظ على جودة متوسطة. تبادل مستنبت مع ما يقرب من نصف حجم من طازجة + DHP المتوسطة للحفاظ على حل واضح، وهذا يتوقف على مقدار تحلل البويضة.
   2. السماح للفي المختبر النضج والمضي قدما حتى أغلبية البويضات تصبح شفافة ولها GV التي لم تعد واضحة (حوالي 2 ساعة في العلاج DHP، انظر الشكل 2C بالمقارنة مع D). عرضها تحت المجهر تشريح مع البصريات الضوئية المرسلة.
2. إزالة غشاء مسامي الأبعد من كل بويضة ناضجة. استخدام ملقط خارج غرامة لجعل المسيل للدموع في غشاء مسامي في المنطقة مع زيادة المسافة بين البويضة والغشاء. تقشر جزء من الغشاء ولفة البويضة من الغشاء أثناء الضغط باستمرار على جزء مقشر.
   ملاحظة: سوف الغشاء المشيمي الأساسي يبقى عادة في ارتباط وثيق مع البيض خلال هذه العملية؛ بعد عمل البيضivation، فإنه يتمدد لتشكيل طبقة واقية للجنين.
3. نقل البويضات defolliculated في حجم الحد الأدنى من المتوسط ​​(عادة، ونقل حوالي 5-10 البويضات الناضجة في أقل من 20 ميكرولتر) إلى طبق بتري مع بضع قطرات من الثقافة المتوسطة (+ DHP)، والشروع في الإخصاب.

6. تسميد في المختبر مثقف البويضات

ملاحظة: الحل الحيوانات المنوية على الجليد، الذي أعد أدناه، سوف تحافظ على قوتها لمدة 2 ساعة.

1. يعد حل الحيوانات المنوية قرب نهاية الخطوة بويضة النضج وقبل defolliculation باستخدام الخصيتين من خمسة ذكور في 500 ميكرولتر من محلول هانكس "، كما هو موضح سابقا ^{16 و 17.}
2. إضافة 10-50 ميكرولتر من محلول الحيوانات المنوية إلى البويضات defolliculated في مستنبت + DHP. انتظر 10 ثانية.
3. باستخدام ماصة، إضافة بضع قطرات من الجنينية (E3) متوسطة إلى البويضات. انتظر 1 دقيقة ثم إغراق ررأكل مع E3 المتوسطة.
   ملاحظة: تكوين E3 المتوسطة على النحو التالي: 5 مم كلوريد الصوديوم، 0.17 ملي بوكل، 0.33 ملي CaCl _2، 0.33 ملي MgSO _4، و1-5٪ الميثيلين الأزرق ^13.
4. كرر الخطوات من 5.3، 6.2، و 6.3 للحصول على عدد أكبر من الأجنة المخصبة.
5. السماح للأجنة مخصبة لتطوير. استخدام مجهر تشريح مع عدسات الخفيفة التي تنتقل عن طريق لمراقبة تطور عبر مراحل الانقسام لضمان إخصاب ناجحة، كما هو موضح سابقا للإخصاب ¹⁷ و ¹⁸ التدريج.

النتائج

لتحديد ما إذا كان الإجراء هو موضح أعلاه ناجحا، الأجنة يمكن ملاحظتها خلال مراحل الانقسام لتأكيد ظهور النمطية نمط الانقسام المبكر الجنينية ^18، وكذلك في 24 ساعة بعد الإخصاب (HPF) لتأكيد التنمية السليمة خطة الجسم الأساسية. يسمح هذا الإجراء للتلاعب من المنتجات الأمهات للدراسات وظيفية من خلال حقن الكواشف، مثل من mRNAs والمنظمات الأعضاء، خلال تطوير بويضة.

التلاعب في المنتجات الأمهات للدراسات وظيفية:

مرنا الترميز لمن النوع البري ومنتجات تحور يمكن حقن البويضات في المختبر تنضج لاختبار تأثير من التلاعب وظيفة الجين الأمهات أثناء الانقسام الاختزالي والمراحل الجنينية المبكرة. على سبيل المثال، من النوع البري الأجنة يمكن حقنها مع وايدينار من نوع مرنا لاختبار تأثير overexpression المنتج، أو مع RNA متحولة لاختبار المحتملة المهيمنة (على سبيل المثال، والحصول على وظيفة، ومضاد للشكل) الآثار في هذه العمليات. البويضات في المختبر في الثقافة قادرة على إنتاج البروتين من مرنا خارجي طوال تطوير بويضة، كما يتضح من التعبير عن GFP من مرنا حقن، على الرغم فقط البويضات التي تبدأ الظروف والثقافة في المرحلة الرابعة من مراحل تكوين البويضات يمكن أن تتطور إلى البويضات مرحلة V الناضجة (الشكل 2B -2D، وانظر أيضا ناير وآخرون. ^3). التعبير البرية من نوع المنتج من خلال مرنا حقن أيضا دور فعال من أجل إنقاذ الطفرات تأثير الأمهات لتأكيد هوية الجينات خلال استنساخ الموضعية ^{3 و 24.} في هذه الحالة، يتم حقن من النوع البري مرنا في البويضات من الإناث متحولة متماثل لاختبار ما إذا كان من النوع البري المنتجات يمكن انقاذ النمط الظاهري متحولة. ويتضح هذا الإنقاذ الوراثي في ​​<يتم عرض قوي> الشكل 3A-3C، حيث حقن AurB مرنا لإنقاذ آثار المظهري من طفرة في الجين المقابلة لها، جزيرة الخلوية (المبادرة) (الشكل 3A-3C). يسمح للأجنة من مجموعة السيطرة أيضا على تطوير لإظهار النمط الظاهري متحولة الموافق ^3. ويمكن أيضا أن يتم حقن الحمض النووي الريبي متحولة إلى البويضات متحولة لاختبار ما إذا كان المنتج تحور يحتفظ ظيفة جزئية بمقارنة مدى الإنقاذ التي تسببت من قبل المنتج من النوع البري.

يبدو تعبير البروتين من مرنا حقنها في البويضات النامية لتحدث مع تأخير ضئيلة أو معدومة. ويلاحظ التعبير GFP قوي داخل 2 ساعة من حقن مرنا المقابلة، بغض النظر عن المرحلة التنموية للبويضة ³ (الشكل 2B-2D؛ انظر أيضا ناير وآخرون ^3). منتجات مثل mCherry:Sas6 وBirc5b (ثوب المهرج): GFP يمكن ملاحظتها مباشرة بعد التسميد وخلال أول دورة الخلية الجنينية ^{3 و 25.} حقن مرنا أثناء مراحل تكوين البويضات ويؤدي أيضا إلى إنتاج البروتين الذي، بغض النظر عن شاردة الموسومة تنصهر، هو وظيفي على الفور بعد الإخصاب، كما هو مبين في حالة المنتجات الأمهات للجزيرة الخلوية / aurB ^3، دورة عقيمة / lrmp ^24، و متنافرة / bir5b ^25. الترجمة منع المنظمات الأعضاء أيضا أن يكون له تأثير على الفور بعد الإخصاب، كما هو مبين لدورة عقيمة / Lrmp ³ و في مراحل لاحقة من التطور الجنيني، كما في حالة مهمة مستحيلة / dhx16 ^3. لصق حجب المنظمات الأعضاء، عندما تم حقنها في البويضات النضج، قد لا يكون لها تأثير على وظيفة الأمومة، من المحتمل بسبب بالفعل الحالية النصوص الأمهات الناضجة في البويضات المرحلة الرابعة <سوب الطبقة = "XREF"> 3.

جيل من morphants:

عند استخدام MO المقابلة لجين مع الطفرة التي تم تحديدها بالفعل، ومن المتوقع أن تحاكي النمط الظاهري متحولة النمط الظاهري morphant. تتم مقارنة Morphants إلى الأجنة uninjected ولتلك حقن مع مستوى، والسيطرة MO. وحقن morpholino حجب الترجمة يمكن أن نسخة مظهرية بنجاح النمط الظاهري متحولة المعروف ^3، كما هو مبين من قبل حقن Lrmp MO في البويضات، الذي يحاكي النمط الظاهري متحولة من الطفرة المقابلة، دورة عقيمة (الشكل 3D-F). خصوصية المنظمات الأعضاء يمكن تحديد من خلال نفس الأساليب المستخدمة عند حقن المنظمات الأعضاء في الأجنة (مراجعة سابقا) ^{19، 20.}

التعبير عن fluorescently المسمى البروتينات الانصهار:

مرنا الترميز للمنتجات الجين تنصهر البروتينات الفلورية (على سبيل المثال، GFP وmCherry) كما يمكن حقنها إما من النوع البري أو البويضات متحولة إلى تصور المنتجات المناظرة داخل الجنين في وقت مبكر (أي، والتي تعكس نمط توطين التحت خلوية، الشكل الجيل الثالث 3G و3H). من mRNAs الترميز للاندماج مماثلة لكنها تنطوي على أليل متحولة يمكن التعبير على نحو مماثل لاختبار ما إذا كان طفرة تؤثر أي تعريب التحت خلوية المحتملة.

الشكل 1: في المختبر سيت النضج. رسم تخطيطي يبين الخطوات المختلفة التي ينطوي عليها في المختبر بويضة النضج. وقبل اختيار-الإناث البالغات لقبل 8 أيام لهذا الإجراء، لتطهير لهم من البيض التي سبق نضجت والمؤيدة للوضع البيضقذى تطوير بويضة جديدة. المبايض، التي تحتوي على البويضات النامية، تتم إزالة من الإناث ونقل إلى المتوسط تحتوي على هرمون DHP للحث على بويضة نضوج في المختبر. بعد إزالة من الإناث ومباشرة قبل أو أثناء نضوج البويضة، البويضات يمكن حقنها مع منتجات RNA والكواشف أخرى للتلاعب وظيفي من العوامل الأمهات. وdefolliculated البويضات الناضجة يدويا وإخصابها في المختبر مع حل الحيوانات المنوية لانتاج مخصبة والأجنة قابلة للحياة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: في المختبر سيت النضج والتعبير من المنتجات من مرنا المصبوبة. (A) البويضات في مراحل I-III، لوحظ في المبيض منالإناث 4 أيام بعد تطهير (النيابة العامة). (B) البويضات في المرحلة الرابعة، التي لوحظت في المبايض من الإناث 8 النيابة العامة. الحويصلة الجرثومية (GV، رأس السهم) واضحة للعيان وتحتل موقعا غريب الأطوار. وIII البويضات مرحلة في (A) أيضا يحمل على GV اضحة وضوح الشمس، ولكن تم العثور على مركزه في البويضة. البويضات المرحلة الرابعة في (B) لديها الحجم الذي هو بالقرب القصوى مقارنة بما كان عليه من البويضات الناضجة في (C). (C و D) البويضات في مرحلة V (تنضج البويضات) بعد 2 ساعة في المختبر في ظروف النضج بدأت في المرحلة الرابعة، كما هو الحال في (B)، وحقن أثناء النضج مع GFP ترميز، كتب في المختبر مرنا (C، الضوء المرئي فقط؛ D، تراكب الضوء المرئي ومضان GFP). وGV لم يعد واضحا في البويضات V المرحلة، التي هي أيضا أقل غموضا من البويضات المرحلة الرابعة. البويضات حقن تعبر عن البروتين GFP (D). Defolliculation ناضجة البويضات المرحلة الرابعة هي ديcribed في قسم البروتوكول. شريط مقياس = 300 ميكرون. استنسخت كل اللوحات، بإذن، من نير آخرون ^3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3): التلاعب والتخيل من المنتجات الأم من خلال في المختبر سيت النضج. (A - C) إنقاذ النمط الظاهري تأثير الأمهات الناجمة عن طفرة في جزيرة الخلوية / الشفق B من خلال حقن من النوع البري aurB مرنا في المرحلة الرابعة المبادرة البويضات / aurB. الصور المدمجة التي تبين وجهات النظر الحيوان من 65 blastodiscs الثابتة MPF، تصور مع أضداد ß-كاتينين لتسليط الضوء على الأغشية (الأخضر)، والأجسام المضادة لمكافحة α-تويولين للإشارة الأنابيب الدقيقة (أحمر)، ودابي لتعيين DNA (الأزرق). (A) تراكم β-كاتينين في البرية من نوع الأجنة، مما يدل على نضوج ثلم العادي. (B) A المبادرة / aurB الجنين من المبادرة / aurB المرحلة الرابعة بويضة uninjected يظهر جزئية، الأخاديد بدائية لا تتراكم بيتا كاتينين. (C) والمبادرة أنقذت / aurB الجنين من المبادرة / aurB بويضة حقن من النوع البري aurB مرنا تظهر قوية تراكم β-كاتينين في الأخاديد. (D - F) نسخة مظهرية للتأثير الأمهات الناجمة عن طفرة في دورة غير مجدية / lrmp من حقن Lrmp morpholino في المرحلة الرابعة البويضات. الصور المدمجة التي تبين وجهات النظر الحيوان من 70 blastodiscs الثابتة MPF، تصور مع أضداد γ-تويولين للإشارة جسيم مركزي (أحمر) ودابي لتعيين DNA (الأزرق). (D) في الأجنة من النوع البري، كل نواة الزميلة مع γ تويولين، علامة للمواد centrosomal. (E) في المسوخ الحويصلة تأثير الأمهات، فشل اندماج pronuclear، مما أدى إلى 2-3 بقع من علامات الحمض النووي المقابلة لغير مدمجة الوالدين المؤيدة للنوى والجسم القطبي لالانقسام الاختزالي الثاني. (F) في morphants Lrmp، حيث تحول دون وظيفة Lrmp الأمهات، ونوى ترفض أيضا تقسيم، وبالإضافة إلى ذلك، تفشل لربط مع γ تويولين. (G و H) تصور المنتجات المنتجة للأمهات في الجنين في وقت مبكر. البروتين Sass6-mCherry من مرنا خارجي حقنه في المرحلة الرابعة البويضات يموضع إلى مريكز. الصور المدمجة التي تبين وجهات النظر الحيوان من 40 blastodiscs الثابتة MPF، تصور مع أضداد γ-تويولين لتسليط الضوء جسيم مركزي (الأخضر)، mCherry مضان تشير إلى Sass6 (الحمراء)، ودابي لتعيين DNA (الأزرق). (G) أعربت عن بروتين Sass6-mCherry يموضع إلى بؤر وصفت من قبل الجسيم المركزي علامة γ تويولين في مواقع المرافقة النواة (السهام). (H ) نفس الصورة، تظهر فقط Sass6-mCherry ودابي لوضوح. يتم إصلاح الأجنة في (G و H)، ولكن مضان من المنتجات أعرب، مثل اندماج mCherry، ويمكن أيضا أن تراعى في الأجنة الحية (لا يظهر). استنسخت شريط مقياس = 100 ميكرون في AF و 10 ميكرون في G وH. جميع الألواح، بإذن، من نير آخرون ^3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

مراحل مراحل تكوين البويضات	قطر البويضة (ميكرون)	معلما رئيسيا (ق)
1A - السابقة للجريبات	7-20	بدء النسخ نشط، وتراكم نويات
1B - جريب	20-140	Decondensation من الكروموسومات
II - سنخ القشرية	140-340	إنتاج الحويصلات الهوائية القشرية
III - تكون المح	340-690	سواد من هيولى البيضة عن تراكم صفار السلائف البروتين والدهون
IV المبكر - نضوج البويضة	690-730 (أقل المدى)	تعريب غير المتماثلة من حويصلة جرثومي
IV المبكر - نضوج البويضة	690-730 (النطاق العلوي)	يختفي حويصلة جرثومي، القبض على الطورية II
V - الناضجة بويضة	750 ~	هيولى البيضة / صفار يصبح شفاف

الجدول 1: معالم التنمية البويضة في زيبراسمك.

Discussion

البروتوكول أعلاه هو للتلاعب من المنتجات الجينات قبل الإخصاب، وبالتالي السماح لدراسة الجينات المنتجات الأمهات في الجنين الزرد في وقت مبكر. وكانت دراسات سابقة قادرة على تنضج البويضات في المختبر ^(4)؛ تم تعديل هذا البروتوكول للسماح للإخصاب في المختبر لاحق نضجت البويضات ^8. وهذا بدوره يسمح لحقن المواد الكيميائية للتلاعب وظيفي والتصور من المنتجات ورثت أمومي في أوائل الجنين ^3. الأجنة الناتجة عن هذه الطريقة يمكن أن تكون قابلة للحياة ويمكن البقاء على قيد الحياة ليصبحوا بالغين خصبة. في التجارب الأولية، كان ما يقرب من نصف الأجنة المخصبة المستمدة من هذا الإجراء قابلا للتطبيق في يوم 5 من التنمية، وفقا لتقييم التضخم المثانة السباحة في تلك المرحلة، نصفها تقريبا أصبح صحية، خصبة البالغين (الملاحظات غير منشورة).

هناك عددخطوات حاسمة للنظر في البروتوكول. البويضات في المرحلة المناسبة لبدء النضج (أوائل المرحلة الرابعة) يمكن التخصيب إذا تم تزاوج الأنثى في الآونة الأخيرة، ولكن ليس قبل 8 النيابة العامة. استخدام الأسماك التي لم تزاوج مؤخرا قد يؤدي إلى تحولها البيض ^14، والتي لن تخضع النضج. سوف الإناث تزاوج خلال أقل من 8 أيام لديهم أغلبية من البيض في المرحلة الثالثة أو أقل، وبالتالي، فإن البيض لا تنضج بشكل صحيح في المختبر. والمبايض في الإناث التي تزاوج قبل 8 أيام يكون لها جزء الأمثل للالبويضات في مرحلة مبكرة IV. ويمكن التعرف على هذه عن طريق التعتيم على وجود GV في موقف غريب الأطوار (الشكل 2B). ويمكن أيضا أن بويضة تقرير المرحلة يتم بمساعدة من قياس حجم، مع البويضات وضعت على شريحة ميكرون تخرج تحت المجهر ومقارنة مع المبادئ التوجيهية انطلاق القياسية (الجدول 1). ومع ذلك، البويضات IV مرحلة مبكرة لها حجم شبه القصوى مقارنة حتى تنضجالبويضات (معترف بها من قبل الشفافية النسبية وعدم وجود GV، الشكل 2C) ويتم التعرف بسهولة، كما هو موضح أعلاه، الذي سيغني عموما الحاجة إلى القياس المباشر حجم البويضة.

في نضوج المختبر يجب أن تبدأ في غضون عدة ساعات من نهاية دورة النهار التي يتم تأقلم المانحين بويضة الأنثى. والبويضات لا تنضج بشكل صحيح، ينعكس في معدلات التسميد الفقيرة، إذا مثقف خلال الفترة الصباحية من دورة الخفيفة. لا يفهم سبب تبعية الساعة البيولوجية للفي المختبر بويضة طريقة النضج ولكن من المرجح يعكس التحيز الساعة البيولوجية الكامنة في الجسم الحي في البيض النضج التي تنطوي على التعبير الجيني ركوب الدراجات أثناء مراحل تكوين البويضات ^21. سبب شائع للالبويضات عدم الخضوع ناجحة في نضوج المختبر على الرغم من انطلاق البويضة الصحيح هو أن DHP قد انتهت. تنتهي DHP الهرمون بشكل عام بعد عام، ولضمان تأثيرنضوج إيف، يجب أن يتم استبدال الدفعة عمل في غضون 9 أشهر من الاستخدام.

حقن البويضات هو خطوة حاسمة أخرى عندما يكون الغرض من هذه الطريقة للتلاعب وظيفي للمنتجات الأمهات. هذا الإجراء ومتطلبات تختلف عن تلك التي لحقن القياسية في البويضة المخصبة في 0-30 MPF. وهناك عامل أساسي في حقن بويضة هو الحاجة إلى إجراء الحقن في ظل الظروف التي لا تؤدي إلى تنشيط البويضة سابقا لأوانه، كما هو الحال في ليبوفيتش L-15 متوسطة ^{22 و 23.} لأنها هي جزء لا يتجزأ في المبايض، البويضات التي تستحق أيضا تحديات خاصة للحقن. بروتوكول فوق يوحي أولا النأي البويضات من المبايض ومن ثم عقد كل فصل على حدة بويضة مع ملقط في حين حقن. وقد عملت هذه التقنية بشكل جيد ويسمح البويضات الفرز قبل في المرحلة المناسبة مع الحد الأدنى من التعامل معها. ويمكن أيضا طرق بديلة يمكن استخدامها، مثلعلى النحو التالي: أ) وضع البويضات في حقن القياسية أحواض الاغاروز ^15، حيث الجدران الرأسية للدعم حوض البويضة خلال حقن (في هذه الطريقة البديلة، تحتاج البويضات على أن يتم تحويلها إلى لوحات حقن حين يوضع في في المختبر نضوج المتوسطة) والثاني ) مما يسمح للبقاء البويضات التي تعلق على كتلة المبيض، والتي يمكن أن تعقد مع ملقط خلال الحقن لتجنب الاتصال مع البويضة حقن (في هذا النهج، ينبغي فصل البويضات بعد الحقن لكلا تسهيل التعرض DHP والسماح defolliculation بهم ، في حد ذاته ضروري لIVF). وعلى الرغم من هذا التحدي معين، البويضات IV مرحلة يمكن اختراقها بسهولة مع إبرة الحقن، على الأرجح لأن الغشاء المشيمي في هذه المرحلة ليست متطورة تماما ^9.

واحد الحد من بروتوكول نضوج الحالي هو أنه في ظروف نضوج المختبر التي تعزز التنمية بويضة سليمةلا يمكن إنشاء عند بدء نضوج البويضة في مراحل مبكرة من المرحلة الرابعة. تصبح البويضات المختصة للرد على DHP التي تمر النضج عند بلوغهم يبلغ قطرها 520 ميكرون، والذي يحدث خلال المرحلة الثالثة (تكون المح الموافق مدى 340 إلى 690 ميكرون) ^9. ومع ذلك، فإن ثقافة المرحلة الثالثة البويضات النتائج في البويضات التي ليست مختصة للإخصاب ^3. البويضات فقط الذي يبدأ في المرحلة الرابعة (الشكل 2B) في المختبر الثقافة يمكن أن تتطور إلى ناضجة، البويضات مرحلة V (الشكل 2C وD). قد تكون متعلقة هذا إلى حقيقة أن المرحلة الثالثة هي ضرورية لتكون المح وبويضة نمو ^9. وهكذا، في المختبر إجراء بويضة نضوج الواردة في هذه المادة ينبغي أن تستخدم فقط مع بدء سكان المرحلة الرابعة البويضات (B)، وليس مع البويضات في مراحل سابقة (مراحل I - III، شملت رقم البريد 2A). لنفس السبب، وهذا الإجراء يقتصر على الجينات التي يتم التعبير عنها في المرحلة الرابعة أو في وقت لاحق. قد يكون تلاعب وظيفي من الجينات التي يتم التعبير عنها في وقت سابق من المنتجات بدلا من الاعتماد على الأساليب الوراثية (انظر أدناه). قد تحسينات على الطرق في المختبر ثقافة النضج في المستقبل تسمح للبدء في زراعة بويضة في المراحل السابقة، وبالتالي توسيع قوة في المختبر نهج النضج.

قيود أخرى في طريقة عرض هو أن defolliculation، وهو أمر ضروري للخطوات اللاحقة التي الإخصاب، ويعمل حاليا الحد من معدل خطوة في الإجراء. غشاء مسامي هو عبارة عن طبقة شفافة المحيطة البويضة النامية، وإزالة يمكن أن تكون مملة. إذا لم تتم إزالة هذا الغشاء تماما، فإن البيض لا تصبح تفعيلها بشكل كامل والمخصبة. يرصد هذا واضح من فشل المشيمه لتوسيع وتطوير وضعها بشكل غير منتظم، ثلم مثل شارعructures (pseudocleavages)، سمة من أجنة غير مخصبة ^11. طرق defolliculation الأنزيمية مثل كولاجيناز، كما تستخدم في القيطم، قد حوكموا. ومع ذلك، في أيدينا، لم يكن هذا الأسلوب ناجح، وبالتالي فإننا نعتمد على defolliculation اليدوي. لأن defolliculation اليدوي كثيفة العمالة وتستغرق وقتا طويلا، فمن الصعب الحصول على دفعات كبيرة من البويضات المخصبة بعد في المختبر بويضة النضج. بسبب القيد الزمني الذي تفرضه defolliculation اليدوي، نحن تسميد حاليا عدد قليل من defolliculated والبيض ناضجة في وقت واحد، على دفعات صغيرة من 5-10 البيض. إن إدماج defolliculation الأنزيمي مع هذا الإجراء يزيد من المرجح بشكل كبير العائد وسهولة الشاملة للاستخدام.

على الرغم من أن الأجنة المنتجة بعد إخصاب البويضات في المختبر -matured يمكن أن تصبح قابلة للحياة البالغين، نلاحظ أن بعد الإخصاب في المختبر، وهي جزء من الأجنة تفعل لا تقسم عادة أو في الوقت المناسب. نحن اختيار حاليا لخطوط التي تشمل جولات من بويضة في المختبر النضج، مما قد يؤدي إلى أنماط أكثر قوة للتنمية في الأجنة من خلال هذا الأسلوب نشر.

وقد سمح هذا الإجراء لإنقاذ واضحة أو تصور توطين البروتين لعدد من الطفرات ^{24 و 25.} ومع ذلك، بالنسبة لبعض الجينات، وتنظيم التعبير المنتج قد يكون حاسما، وبالتالي فإن المنتجات التي أعرب عنها مرنا حقن قد يؤدي إلى نتائج متغيرة ^26. ومن المهم أيضا أن تضع في اعتبارها جميع الضوابط (على سبيل المثال، حقن الأجنة مع الكواشف التي لها خصائص مشابهة لتلك التي استخدمت في التجربة حتى الآن ومن المتوقع أن لا تنتج أثرا، مثل المنظمات الأعضاء السيطرة أو الرنا الترميز لالبروتينات الخاملة فقط، مثل كما GFP)، والتباين الأساسي قد يؤدي إلى استنتاجات غير سليمة.

الإقليم الشمالي "> نهج تنطوي في المختبر التلاعب تليها الإخصاب مفيد بشكل خاص في حالة المنتجات المودعة للأمهات، حيث الطريقة المعيارية لحقن RNA، المنظمات الأعضاء، أو البروتين في البويضة المخصبة قد لا فعالا في الحد منتجات تراكمت بالفعل في البيض. طرق تطويرها مؤخرا الأخرى، مثل الجيل كريسبر متحولة، هي أيضا فعالة في توليد الظروف متحولة عن الجينات وأعرب أمهات ^(26). ومع ذلك، فإن هذا الأسلوب يتطلب نمو عدة أجيال من الأسماك. وفي المختبر تقنية بويضة النضج تسمح للتلاعب وظيفي السريع ل دراسة وظيفة الجينات وأعرب أمهات، بما في ذلك الانقاذ ونسخة مظهرية الطفرات تأثير الأمهات، وكذلك التعبير عن RNA والبروتينات في الجنين في وقت مبكر.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zebrafish mating boxes	Aqua Schwarz	SpawningBox1
NaCl	Sigma	S5886
KCl	Sigma	P5405
Na2HPO4	Sigma	S3264
KH2PO4	Sigma	P9791
CaCl2	Sigma	C7902
MgSO2-7H2O	Sigma	63138
NaHCO2	Sigma	S5761
Tricaine	Western Chemical	Tricaine-D (MS 222)	FDA approved (ANADA 200-226)
Tris base	Sigma	77-86-1	to prepare 1 M Tris pH 9.0
HCl	Sigma	920-1	to prepare 1 M Tris pH 9.0
Fish net (fine mesh) (4 - 5 in)	PennPlax	(ThatFishThatPlace # 212370)	available in ThatFishThatPlace
Plastic spoon			available in most standard stores
Dissecting scissors	Fine Science Tools	14091-09
Dissecting forceps	Dumont	SS	available from Fine Science Tools
Dissecting stereoscope (with transmitted light source)	Nikon	SMZ645	or equivalent
Reflective light source (LED arms)	Fostec	KL1600 LED	or equivalent
Petri plates 10 cm diameter			any maker
Eppendorf tubes 1.5 mL			any maker
Ice bucket			any maker
Narrow spatula	Fisher	14-374
Depression glass plate	Corning Inc	722085 (Fisher cat. No 13-748B)	available from Fisher Scientific
Paper towels			any maker
Kimwipes	Kimberly-Clark	06-666-11	available from Fisher Scientific
Timer stop watch			any maker
Wash bottle	Thermo Scientific	24020500	available from Fisher Scientific
beakers, 250 mL (2)	Corning Inc.	1000250	available from Fisher Scientific
Leibovitz'z L-15 medium	Thermofisher	11415064
NaOH	Sigma	221465	for pH'ing
BSA	Sigma	A2058
17alph-20beta-dihyroxy-4-pregnen-3-one (DHP)	Sigma	P6285
gentamicin	Sigma	G1272
Injection Apparatus	Eppendorf	FemtoJet	or equivalent
Capillary Tubing for injection needles	FHC	30-30-1	or equivalent, Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID with fiber, 100 mm
Needle puller	Sutter Instruments	Model P-87	any maker
Micropipetor (1 - 20 µL range) with tips			any maker
Micropipetor (20 - 200 µL range) with tips			any maker
Micropipetor (100 - 1000 µL range) with tips			any maker
Conical tubes 15 mL			any maker
Conical tubes 50 mL			any maker
plastic pipette 10 mL with bulb			any maker
plastic pipette 20 mL with bulb			any maker
Microscope stage Calibration Slide 0.01 mm	AmScope	MR095	or equivalent
Reagents for fish water:
Instant Ocean Salt	Drs. Foster & Smith	CD-116528
Sodium bicarbonate (cell culture tested)	Sigma	S5761-1KG
Reagents for E3 medium:
NaCl	Sigma	S5886-1KG
KCl	Sigma	P5405-500G
CaCl2, dihydrate	Sigma	C7902-500G
MgSO4, heptahydrate	Sigma	63138-250G
Methylene Blue	Sigma	M9140-25G
Fish Food:
Frozen brine shrimp	Brine Shrimp Direct	FBSFKG50
Tetramin Flakes	Drs. Foster & Smith	16623