La manipulación de genes maternos funcional de Productos que utilizan<em&gt; In Vitro</em&gt; La maduración de ovocitos en el pez cebra

Resumen

Un protocolo optimizado para la maduración in vitro de ovocitos de pez cebra utilizados para la manipulación de los productos génicos maternos se presenta aquí.

Resumen

eventos celulares que tienen lugar durante las primeras etapas del desarrollo embrionario de los animales son conducidos por los productos de genes derivados de la madre depositados en el oocito en desarrollo. Debido a que estos eventos se basan en productos maternas que normalmente actúan muy poco después de la fertilización, que preexisten en el interior del huevo, los enfoques estándar para la expresión y la reducción funcional que implican la inyección de reactivos en el óvulo fertilizado no suelen ser efectivas. En su lugar, estas manipulaciones deben realizarse durante la ovogénesis, antes o durante la acumulación de productos maternos. Este artículo describe en detalle un protocolo para la maduración in vitro de oocitos inmaduros de pez cebra y su posterior fertilización in vitro, produciendo embriones viables que sobreviven a la edad adulta. Este método permite la manipulación funcional de los productos maternas durante la ovogénesis, tales como la expresión de productos para el rescate fenotípico y visualización constructo etiquetado, así como unaS La reducción de la función de genes a través de agentes de genética inversa.

Introducción

Durante el desarrollo animal, los depósitos madre productos génicos (por ejemplo, ARN, proteínas, y otras biomoléculas) en el huevo; estos productos son importantes para los procesos celulares tempranos inmediatamente después de la fertilización ^{1, 2.} La manipulación de la expresión y función de los productos materna es típicamente ineficaces cuando se utiliza un enfoque estándar para la inyección de los reactivos en huevos fertilizados ^3. Esto es porque la mayoría de los ARN y proteínas son producidas por el ovocito durante la ovogénesis, lo que los productos maternas precargados ya están presentes en el huevo maduro. Tales productos preexistentes son impermeables a la caída funcional, con agentes de genes de orientación, tales como oligos antisentido de morfolino (MOS), porque OMs se dirigen a los ARNm, no la proteína preexistente ya presente en el huevo en la fertilización. Además, muchos procesos embrionarios tempranos ocurren demasiado pronto después de la fertilización que se influenced por los productos de proteínas derivadas de ARN se inyecta en el huevo fertilizado, que el ARN no puede producir suficientemente rápido como para influir en los primeros eventos de la embriogénesis. Por la misma razón, etiquetado fusiones de proteínas expresadas a través de una inyección de ARNm en el óvulo fertilizado no se pueden producir en el tiempo para la visualización durante su papel activo en el embrión temprano. La inyección en ovocitos maduros extruidos antes de la activación del huevo es posible, pero se asocia con problemas técnicos similares: dichos huevos maduros se ya pre-cargado con proteína materna, y no se convertirá en traslación activo (es decir, producir la proteína de las transcripciones exógenos) hasta después de huevo activación. Por estas razones, la manipulación de los productos de los genes maternos que actúan en la embriogénesis temprana por lo general tiene que ser llevado a cabo durante la ovogénesis en el ovocito maduro.

Como un enfoque para superar estos obstáculos, en los métodos de maduración in vitro, que permiten la maduración de OOCytes de la etapa IV a la formación del huevo, se han establecido en el pez cebra. Los primeros métodos permiten la maduración in vitro, pero los huevos maduros resultantes no eran competentes para la fertilización ^4. Posteriormente, la manipulación de las condiciones de cultivo de neutro a pH 9,0, imitando el pH alcalino del fluido de ovario encontrado en especies de peces ^{5, 6,} permitido para la fertilización fiable in vitro (FIV) después de la maduración in vitro ^{7, 8.} De hecho, en vitro ovocitos -matured pueden producir embriones viables que sobreviven a la edad adulta y que son fértiles ^{3, 8.} Este método mejorado se ha adaptado adicionalmente para incluir la manipulación funcional de genes maternos, la expresión de proteínas etiquetadas durante la ovogénesis pez cebra través de la expresión exógena, y MO mediada funcional derribar en esteraetapa urante IV ovocitos ³ (figura 1).

Ovogénesis pez cebra presenta una serie de etapas características que conducen a la formación de ovocitos maduros ⁹ (véase la Tabla 1 para una guía rápida de las diversas etapas en la ovogénesis). En pocas palabras, el desarrollo de los ovocitos se inicia por los ovocitos en estadio I y está detenido en la etapa diplotena de la profase I de la meiosis. Estos ovocitos se someten a crecimiento a través de la transcripción activo (iniciado durante los estadios IA y IB), la formación de alvéolos corticales (también conocido como gránulos corticales, iniciadas durante la etapa II), y la vitelogénesis (iniciado durante la etapa III). crecimiento de los ovocitos se completa durante la etapa IV, cuando meiosis I hojas de vida, lo que resulta en el desmontaje del núcleo de ovocitos, referido como la vesícula germinal (GV). Posteriormente, la meiosis es detenido de nuevo en la metafase II. La finalización de crecimiento de los ovocitos y detención meiótica durante la etapa IV conduce a una etapa de madurez V por ejemplo,g ^9. La eliminación de la membrana folicular se produce durante la liberación del ovocito en el lumen del ovario ¹⁰ y es esencial para la fertilización y la activación del huevo apropiado. Una vez que los huevos son extruidos de la madre durante el apareamiento natural, que se activan. En el pez cebra, la exposición a agua es suficiente para la activación del huevo completo, independientemente de la presencia de espermatozoides ^11.

En condiciones in vitro permiten actualmente para la maduración de ovocitos de etapa temprana IV-que puede ser reconocido por su tamaño (690-730 m), la presencia de un gran GV en una posición asimétrica, y un aspecto totalmente opaco debido a la acumulación de proteínas de la yema (Figura 2B): para el huevo etapa V madura, caracterizado por un GV totalmente desmontada y una apariencia translúcida debido a la yema de procesamiento de la proteína ¹² (Figura 2C). En este enfoque, los ovarios enteros contovocitos aining en diferentes etapas de desarrollo se retiran de las hembras. Los ovocitos se les permite desarrollar en 17α-20β-dihidroxi-4 pregnen-3-ona (DHP), un eficaz hormona maduración inductor de ^8. Durante este período, los ovocitos de maduración se pueden manipular a través de la inyección de expresión (por ejemplo, capsulado, in vitro -transcribed mRNAs) o agentes inversa genética (por ejemplo, MOS). La capa folicular no arroja espontáneamente hacia el final del período de maduración, por lo que se debe retirar manualmente. Después de defolliculation, la fertilización in vitro se consigue mediante la activación de la activación del huevo a través de la exposición de los huevos a agua (presente en medio embrionario (E3)) ¹³ y una solución de esperma. Los zigotos resultantes experimentan un desarrollo embrionario y permiten la evaluación de la capacidad de los tratamientos para manipular la función del gen de la madre y para la visualización y análisis de los productos etiquetados maternas ( Figura 3).

Protocolo

Todos pez cebra fueron manejadas en estricta conformidad con las buenas prácticas de los animales, según lo definido por los órganos de carácter nacional y / o local de los animales pertinentes, y todos los animales de trabajo fue aprobado por el comité correspondiente (Universidad de Wisconsin-Madison número aseguramiento A3368-01). Los animales se mantuvieron en condiciones estándar a 26,5 ° C.

1. Preselección de las hembras

NOTA: Los oocitos en las hembras adultas típicamente abarcan una gama de etapas de desarrollo, a partir de la etapa I a V (Figura 2). Purgar las hembras de ovocitos preexistentes a través de un apareamiento natural con éxito aumenta la sincronización de puesta en escena de los ovocitos, como ovocitos recién en desarrollo aparecen como una cohorte ^{3, 14.} Dentro de unos 8 días post-purga, la mayoría de los oocitos están en etapa IV temprano, lo cual es óptimo para la iniciación de la maduración in vitro. Tal sincronización aumenta el rendimiento de tha ovocitost puede pasar por el proceso completo de la maduración in vitro, lo que facilita la manipulación experimental. Ver descripciones previas ¹³ para más detalles sobre la configuración de los peces en los apareamientos pareados y en la composición del agua de pescado (aquí, 14 g de sal de mar y 150 g de NaHCO ₃ por 1.000 l de agua de ósmosis inversa, pH 6.5 a 8.5 (intervalo preferido: 6,8 -7.5) y una conductividad de 180-360! S). Ver Brand et al. ¹³ para las recetas adicionales.

1. De ocho a diez días antes de la manipulación de cultivo in vitro, utilizan una red de pesca para transferir un solo un solo pez macho y hembra de la cepa deseada a un tanque de apareamiento. Par de varios conjuntos. Dejarlos en la noche a la mañana tanque de apareamiento. Deje que se aparean durante la tarde y por la tarde del día siguiente.
2. Utilice una red de pesca para separar las hembras que producen huevos durante el apareamiento y colocarlos en un tanque separado. Alimentar a estos hembras dos veces al día con una mezcla de alimentos containing aproximadamente una cantidad igual de camarón de salmuera y alimentos en escamas de pescado. La cantidad de comida debería ser suficiente para proporcionar aproximadamente 20 min, pero no más, de tiempo de alimentación.

2. Preparación de la maduración Medium

NOTA: Preparar medio de maduración en el día del experimento la maduración in vitro, dentro de 1 h de la eliminación de los ovocitos de la hembra (véase la sección 3).

1. Añadir 20 ml de medio L-15 de Leibovitz con L-glutamina, pH 7,0, a un tubo cónico de 50 ml en condiciones estériles. Llevar a pH 9,0 con NaOH 10 N.
2. Añadir 9 ml de medio L-15 de Leibovitz, pH 9,0, a 2 tubos cónicos de 50 ml separados. Label 1 tubo "+ DHP" y el otro "-DHP."
3. En el tubo de + DHP, añadir 10 l de 17α-20β-dihidroxi-4 pregnen-3-ona (DHP), 490 l de dH ₂ O, y 500 l de 10% de albúmina de suero bovino (BSA).
4. En el tubo de -DHP, añadir 100 l de 10 mg / ml de gentamicina, 40081; L de dH ₂ O, y 500 l de 10% de BSA.

3. La disección de los ovocitos y la iniciación del cultivo in vitro

NOTA: El experimento de cultivo in vitro se lleva a cabo con hembras preseleccionados 8-10 días después de que se liberan los huevos a través de apareamiento natural. Usar medio de maduración hecho el mismo día (véase la sección 2). Ovocitos maduros apropiadamente si la disección se inicia cerca del final del ciclo diurno de pescado (determinado en el laboratorio mediante iluminación artificial pre-establecido en la instalación de pescado) ^13, posiblemente procesos que ocurren a través de apareamiento natural imitando. Esto implica que la mayoría de los pasos en el protocolo deben llevarse a cabo en la noche si los peces se alojaron en una instalación con un ciclo de luz estándar (por ejemplo, a partir de la etapa 3.2 a 18:00 en una instalación con un período de luz 08 a.m.-10 p.m.), aunque otros trabajo periodos de tiempo son posibles con un ciclo de luz apropiadamente desplazado en el tiempo.

1. Preparar una solución de tricaína de stock 0,2% en dH ₂ O, tamponada a pH 7,0 con 1 M Tris, pH 9,0, y mantener esta solución a 4 ° C. Esto puede ser preparado de antemano.
2. Iniciar la h experimento 0-4 antes del final del ciclo diario de luz en la instalación. En un vaso de precipitados de 250 ml, añadir 20 ml de 0,2% de solución de tricaína Stock, pH 7,0, a 80 ml de agua pescado y mezclar.
3. La transferencia de las hembras pre-seleccionado para la solución tricaína y la eutanasia por la sobreexposición. Deja las hembras en la solución tricaína durante 15 minutos después del cese de movimiento gill.
4. Con una cuchara, recoger los peces sacrificados de la solución tricaína y enjuagar brevemente en agua los peces. Coloque el pescado en una toalla de papel para absorber el exceso de agua.
5. Utilice una hoja de afeitar limpia para decapitar a los peces sacrificados en el plano de la aleta pectoral. Usando tijeras de disección, hacer una incisión longitudinal en el lado ventral de los peces, que se extiende desde el extremo anterior de la zona anal.
6. Colocar el pescado en una placa de Petri con un microscopio de disección con luz incidente. El uso de un par de fórceps de disección, transferir porciones de ovario a una placa de cultivo mm 35 x 10 que contenía 4 ml de medio L-15 de Leibovitz + DHP.
   NOTA: Los ovarios, que contienen los ovocitos en desarrollo, aparecerán como estructuras opacas y clumpy dentro de la cavidad interna del cuerpo.
7. Con unas pinzas de disección, disociar suavemente los ovocitos foliculares de las masas. Ordenar la primera etapa IV ovocitos (Figura 2B; anteriores a la ruptura GV, en tamaño casi máxima y se caracteriza por un citoplasma oscuro, opaco y un fácilmente evidente GV situado asimétricamente dentro del ovocito). Desechar los oocitos en las etapas anteriores (Figura 2A) y, huevos etapa V maduras translúcidos (similares a los de la Figura 2C, pero presente en los ovarios antes del tratamiento DHP).
   NOTA: Los ovocitos se seleccionan para la maduración en la etapa IV temprano, la etapa más temprana que resulta en madura, oocyt etapa Ves después de las condiciones de cultivo in vitro (Figura 2C y D) ^3. Debido a ovocitos en estadio IV están produciendo activamente los productos, la manipulación en esta etapa permite la expresión de productos exógenos a través de la inyección de ARN o para la reducción de la función de genes a través de OMs introducidas.
8. Usar una pipeta Pasteur de vidrio para transferir los ovocitos primeros estadio IV a una segunda placa de cultivo de plástico mm 35 x 10 que contenía 4 ml de medio L-15 de Leibovitz + DHP. Transferencia de cantidades mínimas de medio -DHP al plato que contiene la solución + DHP.

4. La microinyección de ovocitos

NOTA: etapa Aislado IV ovocitos sometidos a la maduración in vitro se pueden microinyectaron para introducir reactivos para la manipulación funcional o expresión de la proteína etiquetada. La microinyección de reactivos, tales como mRNA y Mos (ver sección 4), se lleva a cabo típicamente cuando los oocitos están experimentando in vitro maturación en medio + DHP, antes de defolliculation. Si se desea, con el fin de permitir más tiempo para llevar a cabo las manipulaciones antes de la maduración de ovocitos, las inyecciones pueden también llevarse a cabo en medio -DHP, antes de la maduración, durante al menos 2 h. Posteriormente, pueden ser transferidos a medio + DHP.

1. Preparar los ARNm utilizando un kit de expresión estándar. Mantenerlos a -80 ° C como una 100-500 pg / l de stock para inyección a una concentración final de 50-500 pg / l (200 pg / l se recomienda) en agua RNA-grado. Preparar OMs a una concentración de 4 ng / l en agua de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Inyectarlos a concentraciones finales de 2 ng / l (o según se determina empíricamente).
   NOTA: Las inyecciones se llevan a cabo típicamente en un medio + DHP antes de defolliculation (véase la nota en la sección 5).
2. Si la inyección de ARNm, inmediatamente antes de la inyección, se diluye la ARNm utilizando agua-ósmosis inversa de ARN-grado y 0,2 M KCl para conseguir una solución final de 0,1 M KCl.
3. Si la inyección de MOS, inmediatamente antes de la inyección, se diluye la OMs a la concentración deseada con agua-ósmosis inversa y 0,2 M KCl para conseguir una solución final de 0,1 M KCl.
4. Mantener manualmente ovocitos con unas pinzas finas e inyectar aproximadamente 1 nL en de tipo salvaje ovocitos etapa IV con una aguja hecha con una pipeta capilar de vidrio desmenuzado.
   1. Preparar las agujas de vidrio tirando de tubos capilares de vidrio calentada, la carga de la solución a inyectar, y romper la punta de la aguja con un fórceps, tal como se describe anteriormente en protocolos de inyección estándar en embriones de pez cebra primeros ^15.
      Nota: Es útil si la aguja tiene una conicidad gradual en lugar de un abrupto uno; Esto permite más flexibilidad en términos de la ubicación de la rotura en la punta de la aguja y también ayuda a evitar daños en el embrión inyectado. Usando la misma aguja y la solución como para las inyecciones de embrión, ajustar el volumen inyectado por pre-determinar elajustes de presión microinyector que producen el volumen deseado. Estos ajustes pueden ser determinados por-mock inyectar en una gota de aceite mineral sobre un portaobjetos de calibración platina del microscopio (0,01 mm) y el ajuste de la configuración de micro inyector para obtener el diámetro deseado en el bolo de solución inyectada, como se ha descrito previamente ^15.

5. La maduración de ovocitos y Defolliculation

NOTA: Durante la maduración de ovocitos, los ovocitos serán cada vez más transparente, lo que permite la evaluación de las condiciones de cultivo exitosas.

1. Continuar la incubación de la inmaduro (y, si es apropiado, inyectado) ovocitos en medio + DHP en 26,5 ° C, comprobando periódicamente (cada 30 min) para asegurar que los oocitos permanecen intactas y son sometidos a maduración adecuada al convertirse en progresivamente translúcido (véase la figura 2C) .
   1. Eliminar cualquier ovocitos de lisis con una pipeta Pasteur y desecharlosen un vaso de precipitados de residuos de laboratorio para mantener la calidad del medio. Cambiar el medio de cultivo con aproximadamente una mitad de volumen de fresco + medio DHP para mantener una solución clara, dependiendo de la cantidad de lisis de oocitos.
   2. Dejar que la maduración in vitro de proceder hasta que una mayoría de los ovocitos ser translúcido y tienen un GV que ya no es aparente (aproximadamente 2 h en el tratamiento DHP, ver Figura 2C, en comparación con D). Verlas bajo un microscopio de disección con óptica de luz transmitida.
2. Retire la membrana folicular más exterior de cada ovocito madurado. El uso de fórceps extrafinos para hacer un desgarro en la membrana folicular en una región con un mayor espacio entre el ovocito y la membrana. Despegar una porción de la membrana y rodar el ovocito fuera de la membrana mientras mantiene pulsada la parte pelada.
   NOTA: La membrana coriónica subyacente típicamente se mantendrá en estrecha asociación con el huevo durante este proceso; después de acto de huevoivation, se expande para formar una capa protectora para el embrión.
3. La transferencia de los ovocitos desfolicularon en un volumen mínimo de medio (normalmente, la transferencia de unos 5-10 ovocitos maduros en menos de 20! L) a una placa de Petri con unas pocas gotas de cultivo (+ DHP) medio y proceder a la fertilización.

6. La fertilización in vitro de oocitos cultivados

NOTA: La solución de esperma en hielo, preparado a continuación, mantendrá su potencia durante aproximadamente 2 h.

1. Preparar una solución de esperma cerca del final de la etapa de maduración de ovocitos y antes de defolliculation utilizando testículos de cinco machos en 500 l de solución de Hanks, como se ha descrito previamente ^{16, 17.}
2. Añadir 10-50 l de solución de esperma a los ovocitos desfolicularon en medio de cultivo + DHP. Espere 10 s.
3. Con una pipeta, añadir unas gotas de embriones (E3) medio de los ovocitos. Espere 1 min y luego inundar el plcomió con medio E3.
   NOTA: La composición del medio de E3 es el siguiente: NaCl 5 mM, KCl 0,17 mM, 0,33 mM de _CaCl2, 0,33 mM _MgSO4, y 1-5% de azul de metileno ^13.
4. Repetir los pasos 5.3, 6.2, y 6.3 para obtener un mayor número de embriones fertilizados.
5. Permita que los embriones fertilizados se desarrollen. Utilice un microscopio de disección con óptica de luz transmitida para observar la progresión a través de las etapas de escisión para garantizar la fertilización con éxito, como se describe anteriormente para la fertilización ¹⁷ y puesta en escena ^18.

Resultados

Para determinar si el procedimiento descrito anteriormente tiene éxito, los embriones pueden ser observados durante las etapas de escisión para confirmar la aparición del patrón de escisión temprana-embrionario estereotipada ^18, así como a las 24 h después de la fertilización (hpf) para confirmar el correcto desarrollo del plan básico del cuerpo. Este procedimiento permite la manipulación de productos maternos para estudios funcionales a través de la inyección de los reactivos, tales como ARNm y Mos, durante el desarrollo de ovocitos.

La manipulación de productos maternos para estudios funcionales:

codificación de ARNm para de tipo salvaje y productos mutados se puede inyectar en oocitos madurados in vitro para probar el efecto de la manipulación de la función de genes materna durante la meiosis y las primeras etapas embrionarias. Por ejemplo, los embriones de tipo salvaje pueden ser inyectados con wimRNA de tipo ld para poner a prueba el efecto de la sobreexpresión del producto, o con el ARN mutante a prueba para potenciales (por ejemplo, de ganancia de función y antimorphic) efectos dominantes en estos procesos. Los ovocitos en cultivo in vitro son capaces de producir la proteína a partir de ARNm exógeno en todo el desarrollo de oocitos, como se muestra por la expresión de GFP a partir del ARNm inyectado, aunque sólo ovocitos que inician condiciones de cultivo en la etapa IV de la ovogénesis pueden desarrollar en oocitos de fase V maduros (Figura 2B -2D, consulta Nair et al. ^3). La expresión del producto de tipo salvaje a través de mRNA inyectado también es instrumental para el rescate de mutaciones materno-efecto para confirmar la identidad de genes durante la clonación posicional ^{3, 24.} En este caso, el ARNm de tipo salvaje se inyecta en ovocitos de hembras mutantes homocigotos para probar si los productos de tipo salvaje pueden rescatar el fenotipo mutante. Este rescate genético se ilustra en Figura 3A-3C, la inyección AurB mRNA se muestra para rescatar a los efectos fenotípicos de una mutación en su correspondiente gen, isla celular (CEI) (Figura 3A-3C). Los embriones de un grupo de control también se les permite desarrollar para mostrar el fenotipo mutante correspondiente ^3. ARN mutantes también se puede inyectar en oocitos de mutantes para probar si el producto mutado retiene la función parcial mediante la comparación de la medida de rescate a la causada por el producto de tipo salvaje.

La expresión de proteína a partir del ARNm inyectado en oocitos en desarrollo parece ocurrir con poca o ninguna demora. Expresión de GFP fuerte se observa dentro de 2 h de la inyección del ARNm correspondiente, independientemente de la etapa de desarrollo del oocito ³ (Figura 2B-2D; ver también Nair et al. ^3). Los productos tales como: mCherrySAS6 y Birc5b (Motley): GFP se puede observar inmediatamente después de la fecundación y durante el primer ciclo celular embrionario ^{3, 25.} La inyección de ARNm durante la ovogénesis también conduce a la producción de la proteína que, independientemente de la fracción de etiquetado fusionado, es funcional inmediatamente después de la fertilización, como se muestra en el caso de productos maternos para la isla celular / aurB ^3, ciclo fútil / LRMP ^24, y Motley / bir5b ^25. Traducción de bloqueo de OM también tienen un efecto inmediato después de la fecundación, como se muestra por ciclo fútil / LRMP ³ y en etapas posteriores de la embriogénesis, como en el caso de la misión imposible / dhx16 ^3. Splice de bloqueo de MOS, cuando se inyectan en oocitos de maduración, no puede tener un efecto sobre la función materna, probablemente ya presentes transcripciones maternas maduras debido en ovocitos en estadio IV ^3.

Generación de morphants:

Cuando se utiliza un MO correspondiente a un gen con una mutación ya identificados-, se espera que el fenotipo morphant para imitar el fenotipo mutante. Morphants se comparan con los embriones no inyectados y para los inyectados con un estándar, control MO. La inyección de un morfolino traducción de bloqueo puede phenocopy éxito el conocido fenotipo mutante ^3, como se muestra por la inyección de LRMP MO en oocitos, que imita el fenotipo mutante de la mutación correspondiente, inútil ciclo (Figura 3D-F). La especificidad de OMs se puede determinar a través de los mismos métodos utilizados al inyectar OMs en embriones (revisado anteriormente) ^{19, 20.}

Expresión de proteínas de fusión marcadas con fluorescencia:

ARNm que codifica productos génicos de interés fusionada a las proteínas fluorescentes (por ejemplo, GFP y mCherry) también se puede inyectar en ya sea de tipo salvaje o ovocitos mutantes para visualizar los productos correspondientes en el embrión temprano (es decir, lo que refleja un patrón de localización subcelular; Figura 3G y 3H). los ARNm que codifican las fusiones similares, pero que implican el alelo mutante pueden expresarse de manera similar para probar si la mutación afecta a cualquier potenciales localizaciones subcelulares.

Figura 1: In Vitro maduración de ovocitos. Diagrama esquemático que muestra las diversas etapas implicadas en la maduración in vitro de ovocitos en. Las hembras adultas son pre-seleccionados para la puesta de huevos 8 días antes del procedimiento, a depurarlos de huevos que ya han madurado y a ProMote desarrollo de nuevos ovocitos. Los ovarios, que contiene los ovocitos en desarrollo, se retiran de las hembras y se transfieren a un medio que contiene el DHP hormona para inducir la maduración de ovocitos in vitro. Después de la eliminación de las hembras e inmediatamente antes de o durante la maduración de ovocitos, los ovocitos pueden ser inyectados con productos de ARN y otros reactivos para la manipulación funcional de factores maternos. Ovocitos maduros se desfolicularon manualmente y fertilizados in vitro con una solución de esperma para producir, embriones viables fertilizados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: In Vitro maduración de ovocitos y expresión de productos a partir del ARNm inyectado. (A) Los oocitos en las etapas I-III, observados en los ovarios dehembras 4 días post-purga (dpp). (B) los ovocitos en la etapa IV, se observa en los ovarios de las hembras 8 dpp. La vesícula germinal (GV, punta de flecha) es claramente visible y ocupa una posición excéntrica. La etapa III ovocitos en (A) también presentan una GV fácilmente evidente, pero se encuentra centrado en el ovocito. Ovocitos en estadio IV en (B) tienen un tamaño que es casi máxima en comparación con la de oocitos maduros en (C). (C y D) los ovocitos en la etapa V (madurar los ovocitos) después de 2 h en condiciones de maduración in vitro iniciadas en la etapa IV, como en (B), e inyectados durante la maduración con GFP-codificación, in vitro ARNm transcrito (C, la luz visible solamente; D, superposición de la luz visible y de fluorescencia GFP). El GV ya no es aparente en ovocitos V de la etapa, que también son menos opaco de ovocitos en estadio IV. Los oocitos inyectados expresan la proteína GFP (D). Defolliculation de ovocitos en estadio IV maduros es described en la sección de protocolo. Barra de escala = 300 m. Todos los paneles se reprodujeron, con autorización, de Nair et al ^3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: manipulación y visualización de los productos maternos a través de In Vitro maduración de ovocitos. (A - C) Rescate del fenotipo materno-efecto causado por una mutación en isla celular / Aurora B a través de la inyección de tipo salvaje aurB ARNm en estadio IV CEI ovocitos / aurB. imágenes fusionadas que muestran vistas animales de 65 blastodiscs fijos MPF, visualizados con anticuerpos anti-ß-catenina para resaltar las membranas (verde), anticuerpos anti-alfa-tubulina para indicar los microtúbulos (rojo), y DAPI para designar ADN (azul). (A) la acumulación de β-catenina en embriones de tipo salvaje, indicativa de maduración surco normal. (B) A cei / aurB embrión de un CEI / aurB etapa IV ovocitos sin inyectar muestra surcos parciales, rudimentarios que no acumulan β-catenina. (C) A cei rescatado / aurB embrión a partir de un oocito cei / aurB inyectado con el tipo salvaje aurB mRNA que muestra robusto acumulación β-catenina en los surcos. (D - F) fenocopia de la materno-efecto causado por una mutación en ciclo fútil / LRMP de la inyección de LRMP morfolino en etapa IV ovocitos. imágenes fusionadas que muestran vistas animales de 70 blastodiscs fijos MPF, visualizados con anticuerpos anti-gamma-tubulina para indicar centrosomas (rojo) y DAPI para designar ADN (azul). (D) En los embriones de tipo salvaje, cada uno asociados núcleo con γ-tubulina, un marcador para el material centrosomal. (E) En materno-efecto mutantes FUE, la fusión pronuclear falla, lo que resulta en dos a tres parches de etiquetas de ADN correspondientes a no fusionadas pro-núcleos de los padres y el cuerpo polar para meiosis II. (F) En morphants LRMP, donde se inhibe la función LRMP materna, los núcleos de manera similar fallan para dividir y, además, fallan en la unión con γ-tubulina. (G y H) Visualización de producto producido por vía materna en el embrión temprano. proteína Sass6-mCherry partir de ARNm exógeno inyecta en etapa IV ovocitos se localiza en los centriolos. imágenes fusionadas que muestran vistas animales de 40 blastodiscs fijos MPF, visualizados con anticuerpos anti-gamma-tubulina para resaltar centrosomas (verde), fluorescencia mCherry para indicar Sass6 (rojo), y DAPI para designar ADN (azul). (G) proteína expresada Sass6-mCherry localiza a focos etiquetado por el centrosoma marcadores γ-tubulina en los sitios que flanquean el núcleo (flechas). (H ) La misma imagen, mostrando sólo Sass6-mCherry y DAPI para mayor claridad. Los embriones en (G y H) son fijos, pero la fluorescencia de los productos expresados, tales como fusiones mCherry, también pueden ser observados en embriones vivos (no mostrados). Barra de escala = 100 m de AF y 10 micras en G y H. Todos los paneles se reprodujeron, con autorización, de Nair et al ^3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Etapas de Ovogénesis	Diámetro de ovocitos (m)	Hito clave (s)
1A - Prefollicle	7 a 20	Iniciación de la transcripción activa, la acumulación de nucleolos
1B - Folículo	20 a 140	Descondensación de los cromosomas
II - alveolo cortical	140-340	la producción de alvéolos corticales
III - La vitelogénesis	340-690	Oscurecimiento de ooplasma por la acumulación de yema de la proteína precursora y lípidos
Early IV - maduración de ovocitos	690-730 (rango inferior)	localización asimétrica de vesícula germinal
Early IV - maduración de ovocitos	690-730 (rango superior)	vesícula germinal desaparece, la detención en metafase II
V - ovocito maduro	~ 750	Ooplasma / yema se hace translúcida

Tabla 1: Señales de desarrollo de los ovocitos en Zebrapescado.

Discusión

El protocolo anterior es para la manipulación de productos génicos antes de la fertilización, lo que permite el estudio de los productos génicos maternos en el embrión de pez cebra temprano. Estudios anteriores han sido capaces de madurar los ovocitos in vitro ^4; este protocolo se modificó para permitir la fertilización subsiguiente in vitro de ovocitos ⁸ madurado. Esto a su vez permite la inyección de reactivos para la manipulación funcional y visualización de los productos de herencia materna en el embrión temprano ^3. Los embriones resultantes de este método pueden ser viables y pueden sobrevivir a convertirse en adultos fértiles. En experimentos preliminares, aproximadamente la mitad de los embriones fertilizados derivados de este procedimiento eran viables en el día 5 de desarrollo, tal como se evaluó por la inflación vejiga natatoria en esa etapa, alrededor de la mitad de los cuales se convirtió, adultos fértiles (observaciones no publicadas) sanos.

Hay un numeropasos de críticos a considerar en el protocolo. Los ovocitos en la etapa apropiada para iniciar la maduración (a principios de la etapa IV) puede ser enriquecido si la hembra se ha acoplado recientemente, pero no antes de 8 dpp. El uso de pescado que no se han apareado recientemente podría resultar en la degeneración huevos ^14, que no serán sometidos a maduración. Hembras apareadas en menos de 8 días tendrán una mayoría de los huevos en la etapa III o menos, y por lo tanto, los huevos no maduran correctamente in vitro. Ovarios en las hembras que se aparearon 8 días antes tendrán una fracción óptima de los ovocitos a principios de la etapa IV. Estos pueden ser reconocidos por su opacidad y la presencia de la GV en una posición excéntrica (Figura 2B). Determinación etapa de ovocitos también puede ser ayudado por la medida del tamaño, con los ovocitos colocan en un portaobjetos de micrómetro graduado bajo un microscopio y se compararon con las directrices de estadificación estándar (Tabla 1). Sin embargo, los oocitos IV etapa temprana tienen un tamaño casi máxima en comparación con madurarovocitos (reconocidos por su relativa transparencia y la ausencia de una GV; Figura 2C) y se reconocen fácilmente, como se describió anteriormente, que evita generalmente la necesidad de una medición directa del tamaño de los ovocitos.

La maduración in vitro debe comenzar dentro de varias horas de la final del ciclo de la luz del día a la que se aclimataron los donantes de ovocitos femeninos. Ovocitos no maduran correctamente, se refleja en las tasas de fertilización pobres, si se cultivan durante el período de la mañana del ciclo de luz. La razón de la dependencia circadiano del método de la maduración de ovocitos in vitro no se entiende pero probablemente refleja sesgos circadianos subyacentes en in vivo la maduración del óvulo que implican ciclismo la expresión génica durante la ovogénesis ^21. Una causa común de ovocitos que fallan a someterse éxito en la maduración in vitro, a pesar de estadificación ovocito adecuado es que el DHP ha expirado. la hormona DHP expira generalmente después de un año, y para asegurar el efectoive la maduración, el lote de trabajo debe ser sustituido dentro de 9 meses de uso.

La inyección de ovocitos es otro paso crítico cuando el propósito del método es la manipulación funcional de los productos maternas. Este procedimiento tiene requisitos que difieren de aquellos para las inyecciones estándar en el huevo fertilizado en 0-30 MPF. Un factor clave en la inyección de ovocitos es la necesidad de llevar a cabo las inyecciones en condiciones que no conducen a la activación prematura de huevo, como en medio L-15 de Leibovitz ^{22, 23.} Porque están incrustadas en los ovarios, oocitos con vencimiento también plantean retos particulares a la inyección. El protocolo anterior sugiere primera disociar ovocitos de los ovarios y manteniendo cada disociado ovocito por separado con fórceps mientras se inyecta. Esta técnica ha funcionado bien y permite ovocitos de preclasificación en la fase adecuada con una manipulación mínima. Los métodos alternativos también pueden ser utilizados, talescomo: i) la colocación de los ovocitos en la inyección estándar artesas de agarosa ^15, donde las paredes verticales del soporte de la cubeta el ovocito durante la inyección (en este método alternativo, los oocitos necesitan ser transferida a placas de inyección mientras mantienen en medio de maduración in vitro) y ii ) permitiendo que los ovocitos a permanecer unidos a la masa ovárica, que puede ser sostenido con el fórceps durante la inyección para evitar el contacto con el ovocito inyectado (en este enfoque, los oocitos deben ser disociados después de la inyección tanto para facilitar la exposición DHP y para permitir su defolliculation , sí esencial para la fertilización in vitro). A pesar de este desafío específico, los ovocitos en etapa IV puede ser penetrado fácilmente con una aguja de inyección, probablemente porque la membrana coriónica en esta etapa no está completamente desarrollado ^9.

Una limitación del protocolo de maduración actual es que en condiciones de maduración in vitro que promueven el desarrollo adecuado de ovocitosno puede ser creada cuando la maduración de ovocitos se inicia en las primeras etapas de la etapa IV. Los ovocitos se convierten en competentes para responder a DHP por sometidos a maduración cuando alcanzan un diámetro de 520 micras, que se produce durante la etapa III (vitelogénesis, que corresponde a la gama de 340 a 690-m) ^9. Sin embargo, el cultivo de la etapa III ovocitos resultados en oocitos que no son competentes para la fecundación ^3. Sólo ovocitos cuyo cultivo in vitro se inicia en la etapa IV (Figura 2B) puede convertirse en, ovocitos etapa V maduros (Figura 2C y D). Esto puede estar relacionado con el hecho de que la etapa III es esencial para la vitelogénesis y ovocito crecimiento ^9. Por lo tanto, el procedimiento de maduración de ovocitos in vitro en presentado en este artículo sólo se debe utilizar con una población de partida de la etapa IV ovocitos (B), y no con los oocitos en las etapas anteriores (etapas I - III; Figur e 2A). Por la misma razón, este procedimiento está limitado a genes que se expresan en la etapa IV o posterior. La manipulación funcional de genes cuyos productos están expresadas anteriormente puede en lugar de tener que depender de métodos genéticos (véase más adelante). Las mejoras a los métodos de cultivo in vitro de maduración pueden en el futuro permitir la iniciación de cultivo de ovocitos en etapas anteriores, ampliando así el poder del enfoque de la maduración in vitro.

Otra limitación en el método presentado es que defolliculation, que es esencial para las etapas ulteriores que implican la fertilización, es actualmente un paso limitante de la velocidad en el procedimiento. La membrana folicular es una capa transparente que rodea el ovocito en desarrollo, y la eliminación puede ser tedioso. Si esta membrana no se elimina por completo, el huevo no será plenamente activado y fertilizado. Esto se hace evidente por el hecho de que el corion para expandir y el desarrollo de irregularmente colocado, surco-como structures (pseudocleavages), típico de los embriones fertilizados ^11. Métodos defolliculation enzimáticos tales como colagenasa, como se usa en Xenopus, se han intentado. Sin embargo, en nuestras manos, esta técnica no ha tenido éxito, y por lo tanto depender de defolliculation manual. Debido defolliculation manual es laborioso y consume mucho tiempo, es difícil obtener grandes lotes de huevos fertilizados después de la maduración in vitro de ovocitos. Debido a la limitación temporal impuesta por defolliculation manual, que actualmente fertilizamos unos pocos, los huevos maduros desfolicularon a la vez, en lotes pequeños de 5-10 huevos. La incorporación de defolliculation enzimática con este procedimiento aumentaría probablemente de manera significativa su rendimiento y la facilidad de uso general.

Aunque los embriones producidos después de la fertilización de ovocitos -matured in vitro pueden convertirse en adultos viables, observamos que después de la fertilización in vitro, una fracción de los embriones hacer No dividir normalmente o en el momento oportuno. Actualmente estamos seleccionando para líneas cuya propagación incluye rondas de maduración in vitro de ovocitos en, que pueden resultar en patrones más robustas de desarrollo en embriones derivados a través de este método.

El procedimiento ha permitido para el rescate claro o visualización de la localización de proteínas para un número de mutaciones ^{24, 25.} Sin embargo, para algunos genes, la regulación de la expresión del producto puede ser crucial, por lo que los productos expresados por el ARNm inyectado puede conducir a resultados variables ^26. También es importante ser consciente de todos los controles (por ejemplo, embriones inyectados con reactivos que tienen propiedades similares a los utilizados en el experimento sin embargo se prevé que no producir un efecto, como OMs de control o ARN que codifican para las proteínas inertes solamente, tales como GFP), como la variabilidad subyacente puede llevar a conclusiones incorrectas.

nt "> Un enfoque implica manipulación in vitro, seguido de la fertilización es particularmente útil en el caso de productos maternalmente depositados, donde el método estándar de la inyección de ARN, OMs, o proteína en el huevo fertilizado puede no reducir efectivamente productos ya acumulados en el huevo. otros métodos desarrollados recientemente, tales como la generación de CRISPR-mutante, también son eficaces en la generación de condiciones de mutantes de los genes expresados por vía materna ^26. Sin embargo, este método requiere el crecimiento de varias generaciones de pescado. la técnica de la maduración de ovocitos in vitro permite la manipulación funcional rápida a estudiar la función de los genes expresados ​​por vía materna, incluyendo el rescate y phenocopy de mutaciones materno-efecto, así como la expresión de ARN y proteínas en el embrión temprano.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zebrafish mating boxes	Aqua Schwarz	SpawningBox1
NaCl	Sigma	S5886
KCl	Sigma	P5405
Na2HPO4	Sigma	S3264
KH2PO4	Sigma	P9791
CaCl2	Sigma	C7902
MgSO2-7H2O	Sigma	63138
NaHCO2	Sigma	S5761
Tricaine	Western Chemical	Tricaine-D (MS 222)	FDA approved (ANADA 200-226)
Tris base	Sigma	77-86-1	to prepare 1 M Tris pH 9.0
HCl	Sigma	920-1	to prepare 1 M Tris pH 9.0
Fish net (fine mesh) (4 - 5 in)	PennPlax	(ThatFishThatPlace # 212370)	available in ThatFishThatPlace
Plastic spoon			available in most standard stores
Dissecting scissors	Fine Science Tools	14091-09
Dissecting forceps	Dumont	SS	available from Fine Science Tools
Dissecting stereoscope (with transmitted light source)	Nikon	SMZ645	or equivalent
Reflective light source (LED arms)	Fostec	KL1600 LED	or equivalent
Petri plates 10 cm diameter			any maker
Eppendorf tubes 1.5 mL			any maker
Ice bucket			any maker
Narrow spatula	Fisher	14-374
Depression glass plate	Corning Inc	722085 (Fisher cat. No 13-748B)	available from Fisher Scientific
Paper towels			any maker
Kimwipes	Kimberly-Clark	06-666-11	available from Fisher Scientific
Timer stop watch			any maker
Wash bottle	Thermo Scientific	24020500	available from Fisher Scientific
beakers, 250 mL (2)	Corning Inc.	1000250	available from Fisher Scientific
Leibovitz'z L-15 medium	Thermofisher	11415064
NaOH	Sigma	221465	for pH'ing
BSA	Sigma	A2058
17alph-20beta-dihyroxy-4-pregnen-3-one (DHP)	Sigma	P6285
gentamicin	Sigma	G1272
Injection Apparatus	Eppendorf	FemtoJet	or equivalent
Capillary Tubing for injection needles	FHC	30-30-1	or equivalent, Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID with fiber, 100 mm
Needle puller	Sutter Instruments	Model P-87	any maker
Micropipetor (1 - 20 µL range) with tips			any maker
Micropipetor (20 - 200 µL range) with tips			any maker
Micropipetor (100 - 1000 µL range) with tips			any maker
Conical tubes 15 mL			any maker
Conical tubes 50 mL			any maker
plastic pipette 10 mL with bulb			any maker
plastic pipette 20 mL with bulb			any maker
Microscope stage Calibration Slide 0.01 mm	AmScope	MR095	or equivalent
Reagents for fish water:
Instant Ocean Salt	Drs. Foster & Smith	CD-116528
Sodium bicarbonate (cell culture tested)	Sigma	S5761-1KG
Reagents for E3 medium:
NaCl	Sigma	S5886-1KG
KCl	Sigma	P5405-500G
CaCl2, dihydrate	Sigma	C7902-500G
MgSO4, heptahydrate	Sigma	63138-250G
Methylene Blue	Sigma	M9140-25G
Fish Food:
Frozen brine shrimp	Brine Shrimp Direct	FBSFKG50
Tetramin Flakes	Drs. Foster & Smith	16623