تشريح، المسح الضوئي MicroCT والمظهرية تحليلات من جذيل

Summary

العديد من الهياكل البيولوجية تفتقر المعالم التي يمكن تحديدها بسهولة، مما يجعل من الصعب تطبيق أساليب المورفولوجية الحديثة. نحن هنا توضيح أساليب لدراسة جذيل الماوس (عظمة في القضيب)، بما في ذلك تشريح والمسح الضوئي microCT، تليها طرق حسابية لتحديد نصف المعالم التي يتم استخدامها لتحديد حجم وشكل الاختلاف.

Abstract

تقدم morphometrics الحديثة طرق قوية لقياس حجم وشكل الاختلاف. الشرط الأساسي هو قائمة الإحداثيات التي تحدد معالم. ولكن مثل هذه الإحداثيات يجب أن تمثل الهياكل المتجانسة عبر العينات. في حين تتكون العديد من الكائنات البيولوجية من معالم التعرف عليها بسهولة لتلبية افتراض التماثل، الكثير منها يفتقر مثل هذه الهياكل. حل واحد محتمل هو رياضيا مكان شبه المعالم على كائن التي تمثل المنطقة المورفولوجية نفسها عبر العينات. هنا، نحن لتوضيح خط أنابيب وضعت مؤخرا لتحديد رياضيا شبه معالم-من الماوس جذيل (القضيب العظام). وينبغي أن تكون وسائلنا ينطبق على مجموعة واسعة من الكائنات.

Introduction

ويشمل مجال morphometrics مجموعة متنوعة من الطرق لقياس حجم وشكل وشكل البيولوجي، خطوة أساسية في البحث العلمي ^{1، 2، 3، 4، 5، 6.} تقليديا، والتحليل الإحصائي للحجم والشكل يبدأ من خلال تحديد معالم على هيكل البيولوجي، ومن ثم قياس المسافات الخطية والزوايا والنسب، والتي يمكن تحليلها في إطار متعدد المتغيرات. لاندمارك على أساس هندسي Morphometrics هو النهج الذي يحتفظ موقف المكاني للمعالم، والحفاظ على المعلومات الهندسية من جمع البيانات من خلال التحليل والتصور ^5. معمم تحليل بروكرست (GPA) يمكن تطبيقها على إزالة التباين في الموقع، والحجم، والتناوب من معالم لإنتاج المواءمة بين العينات التي مinimizes خلافاتهم المربعة - ما تبقى هو شكل الاختلاف ^7.

مفهوم هام من أي تحليل المورفومترية هو التماثل، أو فكرة يمكن للمرء أن تحديد موثوق المعالم تمثل ميزات ذات مغزى من الناحية البيولوجية والمنفصلة التي تتوافق بين العينات أو الهياكل. على سبيل المثال، والجماجم البشرية لديها عمليات مثلي، الثقب، الغرز، والقنوات التي يمكن أن تتيح التحليلات المورفولوجية. للأسف، وتحديد معالم المقابل من الصعب في العديد من الهياكل البيولوجية، ولا سيما مع الأسطح الملساء أو منحنيات ^{8 و 9 و 10.}

نحن نقترب هذه المشكلة أدناه باستخدام الهندسة الحسابية. سير العمل العام هو توليد مسح ثلاثي الأبعاد للكائن الذي يمكن أن تكون ممثلة مثل سحابة من النقاط، ومن ثم تدوير وتحويل تلك السحابة نقطة بحيث كل شيءموجهة pecimens على تنسيق النظام الموحد. ثم نحدد رياضيا شبه المعالم، من مناطق معينة من الجسم. منفصلة شبه المعالم، وضعت على هذه المناطق هي إجراءات تعسفية بيولوجيا ^11. يمكن إجراء GPA والتحليلات الإحصائية اللاحقة إنتاج الأعمال الفنية غير المرغوب فيها ^{8 و 12} لمعالم وضعها بشكل تعسفي قد لا تكون بيولوجيا مثلي. ولذلك، فإننا نسمح لهذه الدور المعالم لحسابيا "الانزلاق". هذا الإجراء يقلل من فرق الجهد بين الهياكل. كما يقول في مكان آخر خوارزمية انزلاق المستخدمة هنا هي مناسبة لتحديد المناطق التشريحية مماثلة تفتقر التعرف عليها بسهولة معالم ^{3، 6، 8، 10، 11، 12} المقابلة. هذه الطرق لها لى الخاصةmitations ^13، ولكن يجب أن تكون قابلة للتكيف مع كائنات مختلفة الحجم والشكل.

هنا، نحن لتوضيح كيفية تطبيق هذه الطريقة في دراسة حديثة من جذيل الماوس ^14، شوكة في القضيب الذي تم المكتسبة وخسر مرة مستقلة متعددة أثناء تطور الثدييات ^15. نناقش تشريح وإعداد العظام محددة، وجذيل (بروتوكول 1)، وتوليد الصور microCT (بروتوكول 2)، وتحويل هذه الصور إلى تنسيق تمكن جميع الهندسة الحسابية المصب (بروتوكولات 3 و 4). بعد هذه الخطوات، يتم تمثيل كل عينة عن طريق الإحداثيات ~ 100K س ع ص. نحن ثم المشي من خلال سلسلة من التحولات التي تتماشى على نحو فعال جميع العينات الى التوجه المشترك (بروتوكول 5)، ثم تحديد الدور المعالم، من العينات الانحياز (بروتوكول 6). يجب بروتوكولات 1-4 تكون مشابهة بغض النظر عن وجوه يجري تحليلها. بروتوكول 5 و 6 بروتوكول لجمعية مهندسي البترولتصميم cifically لجذيل، ولكن يحدونا الأمل في أنه من خلال تفاصيل هذه الخطوات، محققين أن تتخيل التعديلات التي من شأنها أن تكون ذات صلة لكائن اهتمامهم. على سبيل المثال، تم تطبيق التعديلات من هذه الأساليب لدراسة الحيتان عظام الحوض وعظام الأضلاع ^16.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات والموظفين من قبل معهد جامعة جنوب كاليفورنيا لرعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC)، بروتوكول # 11394.

1. جذيل تشريح والتحضير

1. الموت ببطء الماوس الذكور الناضجة جنسيا عبر ثاني أكسيد الكربون أكثر من التعرض، وفقا لبروتوكولات التي وضعتها اللجنة المعنية المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC).
2. وضع الحيوان في موقف ضعيف، وأطال القضيب عن طريق الضغط مع الإبهام الوحشي على فتح القلفة.
3. بمجرد مطولة القضيب، توسيع الأنسجة من خلال القلفة إلى أقصى حد ممكن.
4. مع مقص، وقطع الداني الجسم القضيب لحشفة القضيب حيث يتواجد جذيل.
5. نقل القضيب تشريح لأنبوب مل 1.7 وإضافة 200 ميكرولتر ماء الصنبور. تأكد من أن القضيب مغمورة تماما في السائل.
6. احتضان النسيج في الماء في ~ 50 درجة مئوية لمدة 3-5 أيام.
7. بعد مرور فترة الحضانة المناسبة، وإزالة الأنسجة المحيطة بها من جذيل، وذلك باستخدام ملقط تشريح تحت المجهر. بخ بلطف 70٪ من الإيثانول لدفع قبالة المتبقية الأنسجة وتنظيف العظام.
8. وضع جذيل تشريح في أنبوب microcentrifuge جديد مع سقف مفتوح. ترك سقف يا فتح / N لتجف العظام.

2. MicroCT الضوئي

1. اضغط على microCT حامل المسح أسطواني إلى لبنة من رغوة بائع الزهور لإنشاء اسطوانة من رغوة بائع الزهور.
2. استخراج الاسطوانة من رغوة بائع الزهور وقطع شرائح ~ 2-5 سم سميكة.
3. دفع bacula المجففة في رغوة بائع الزهور، وحول محيط شريحة الفردية للحد من التدخل أثناء المسح الضوئي. يجب أن يكون لاحظ التوجه الدقيق للعظام السماح لتحديد الصحيح من العينات الفردية في بروتوكول 4.
4. وضع بلطف شريحة من عظام جزءا لا يتجزأ في حامل microCT.
5. الحصول على المسح microCT. في حالة الماوس bacula ¹⁴ كنا ماسح ضوئي uCT50 (Scanco الطبية AG، بروتيزيين، سويسرا) في مركز التصوير USC الجزيئية تحت الإعدادات التالية: 90 KVP، 155 أمبير، 0.5 مم آل مرشح، 750 التوقعات في 180 (360 تغطية)، وقت التعرض لل 500 مللي، وحجم فوكسل 15.5 ملم.

3. تجهيز MicroCT: تحويل .DCM المكدس إلى ملف .xyz واحد

ملاحظة: كل مسح microCT تنتج كومة من .DCM، أو "ديكوم"، والملفات التي تمثل شرائح الصورة التي اتخذت خلال الكائن. يتطلب من جميع الهندسة الحسابية المصب ملفات .xyz مسطحة، الذي هو مجرد ملف نصي يحتوي على أربعة أعمدة - س، ص، ض والإحداثيات لكل بكسل، وكثافة بكسل، بدءا من -5000 (أسود) إلى 5000 (أبيض). عتبة بكسل فوق 3000 يعمل بشكل جيد عموما باعتباره عتبة لتحديد العظام.

1. تثبيت بيثون (www.python.org) وحدات PYTHON الأوامر، DICOM، PYLAB، SYS، وNUMPY.
2. فتح "01_process_dicom.py "{Figshare} مع أي محرر نصوص. وبموجب القسم المتغيرات، مسار التغيير، عتبات بكسل، وأسماء الدليل حسب الضرورة.
3. تشغيل "01_process_dicom.py الثعبان". سيتم طباعة التقدم إلى الشاشة. داخل كل دليل اسمه في الخطوة 3.2، وجعلت اسمه ملف جديد. على سبيل المثال، directory_name.PT3000.xyz، حيث يشير PT3000 عتبة بكسل الإشارة إليها في الخطوة 3.2.

4. معالجة MicroCT: بتجزئة التدريجي الفردية عينة .xyz الملفات

1. تثبيت R (https://www.r-project.org/) مع RGL المكتبة.
2. فتح الملف '02_segment_dicoms.r' {Figshare} مع أي محرر نصوص. تحت هذا الباب المتغيرات، وتغيير اسم المسار للإشارة إلى ملف .xyz إنشاؤها في بروتوكول 3 أعلاه.
3. من داخل R، قم بتشغيل "مصدر ( '02_segment_dicoms.r')" القيادة (بدون علامات التنصيص).
4. بعد صورة ثلاثية الأبعاد لملف .xyz إنشاؤها في بروتوكول 3 يظهر، أدخل العدد. dص العينات في ملف .xyz العام. ثم تسمية وتحديد نقاط من كل عينة باستخدام وظائف التمرير والتكبير.
   ملاحظة: في الخلفية، وستبذل ملفات .xyz منفصلة لكل عينة. هذه تظهر في دليل المسمى، على سبيل المثال، XYZ_FILES_PT3000، حيث يشير PT3000 عتبة بكسل المستخدمة.

5. "محاذاة" عينة .xyz الملفات لالاحداثيات المشتركة.

1. فتح بيثون النصي "03_transform.py" {Figshare}، الأمر الذي يتطلب mattdean_modules.py إضافي وحدة {Figshare}، فضلا عن اثنين من تطبيقات قائمة بذاتها: "rotate_translate_cylindrical" (https://github.com/timydaley/dean_cylindrical_tranform) و"qconvex" (www.qhull.org/html/qconvex.htm) التي يتم استخدامها بواسطة هذا البرنامج النصي.
2. تحت هذا الباب المتغيرات، وتحديد أسماء المسار الكامل إلى mattdean_modules.py، rotate_path وqconvex_dir. وبالإضافة إلى ذلك، تحديد المسار الكامل إلى الدليل الذي يحتوي على .xy فردملفات ض بإنشائه في الخطوة 4.
3. 03_transform.py تشغيل، مما يخلق ملف جديد في العينة مع لاحقة .TRANSFORMED.xyz.

6. "التقطيع" عينة الانحياز .xyz الملفات إلى التعرف، معالم نصف.

1. فتح وتشغيل البرنامج النصي بيثون "04_identify_landmarks.py" {Figshare}. في القسم المتغيرات، وتحديد أسماء المسار الكامل إلى الدليل الذي يحتوي على ملفات .TRANSFORMED.xyz. ويحدد هذا البرنامج النصي 802 شبه المعالم التي يمكن استخدامها لتحديد حجم وشكل هيكل.

النتائج

إحداثيات XYZ من الدور نصف المعالم المنتجة في بروتوكول 6 يمكن استيرادها مباشرة إلى أي تحليل morphometrics هندسية على أساس تاريخي ^17. خط أنابيب الحسابية أعلاه قد تم تطبيقها على دراسة bacula الماوس ^14، وكذلك الحوض الحوت وعظام الأضلاع

Discussion

الخطوات الحاسمة في البروتوكول أعلاه هي 1) تشريح bacula، 2) جمع الصور microCT، 3) تحويل الانتاج microCT إلى ملف مسطح من XYZ إحداثيات، 4) بتجزئة من سحابة نقطة لكل عينة، و5) تحويل كل عينة ل وموحدة نظام الإحداثيات، و6) تحديد الدور المعالم. يتم تعديل هذه الخطوات بسهولة لاستيعاب كائنات مختل...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting scissors	VWR	470106-338	Most sizes should work
Dissecting Forceps, Fine Tip, Curved	VWR	82027-406
1.7 mL microcentrifuge tube	VWR	87003-294
Absolute Ethanol	Fisher Scientific	CAS 64-17-5	To be diluted to 70% for dissections
Floral Foam	Wholesale Floral	6002-48-07
uCT50 scanner	Scanco Medical AG, Bruttisellen, Switzerland