Disección, de exploración y morfométricos microTC Los análisis de la Baculum

Resumen

Muchas estructuras biológicas carecen de puntos de referencia fácilmente definibles, por lo que es difícil aplicar métodos morfométricos modernas. Aquí se ilustran métodos para estudiar la baculum ratón (un hueso en el pene), incluyendo la disección y el escaneo microCT, seguido de métodos computacionales para definir semirremolques puntos de referencia que se utilizan para cuantificar el tamaño y la forma de la variación.

Resumen

morfometría moderna proporciona potentes métodos para cuantificar la variación del tamaño y forma. Un requisito básico es una lista de coordenadas que definen puntos de referencia; Sin embargo, tales coordenadas deben representar estructuras homólogas en todos los especímenes. Mientras que muchos objetos biológicos consisten en puntos de referencia de fácil identificación para satisfacer la hipótesis de homología, muchos carecen de este tipo de estructuras. Una posible solución es matemáticamente lugar semi-hitos en un objeto que representa la misma región morfológica a través de muestras. A continuación, se expone una tubería recientemente desarrollado para definir matemáticamente semi-hitos del báculo del ratón (hueso del pene). Nuestros métodos deberían ser aplicables a una amplia gama de objetos.

Introducción

El campo de la morfometría incluye una diversidad de métodos para cuantificar el tamaño y la forma de la forma biológica, un paso fundamental en la investigación científica ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Tradicionalmente, el análisis estadístico de tamaño y forma comienza con la identificación de puntos de referencia en una estructura biológica, y luego la medición de distancias lineales, ángulos y proporciones, que podrían ser analizados en un marco multivariado. Morfometría geométrica basada en el punto de referencia es un enfoque que mantiene la posición espacial de los puntos de referencia, la preservación de la información geométrica de la colección de datos a través de análisis y visualización ^5. Análisis de Procrustes Generalizado (GPA) se puede aplicar para eliminar la variación en la localización, escala y rotación de las señales para producir una alineación entre los especímenes que Minimizes sus diferencias al cuadrado - lo que queda es la forma disimilitud ^7.

Un concepto importante de cualquier análisis morfométricos es homología, o la idea de que uno puede identificar con fiabilidad puntos de referencia que representan características biológicamente significativas y discretos que se corresponden entre muestras o estructuras. Por ejemplo, cráneos humanos tienen procesos homólogos, agujeros, suturas y conductos que pueden permitir a los análisis morfométricos. Desafortunadamente, la identificación de puntos de referencia correspondientes es difícil a través de muchas estructuras biológicas, especialmente aquellos con superficies lisas o curvas ^{8, 9, 10.}

Nos acercamos a este problema a continuación, utilizando la geometría computacional. El flujo de trabajo general es generar una exploración de tres dimensiones del objeto que se puede representar como una nube de puntos, y luego girar y transformar ese punto de turbidez para que todo specimens están orientadas en un sistema de coordenadas común. Luego definimos matemáticamente semi-hitos de regiones específicas del objeto. Discretas semi-hitos colocados en dichas regiones son biológicamente arbitraria ^11. La realización de GPA y los análisis estadísticos posteriores puede producir efectos indeseables ^{8, 12} porque hitos colocados de manera arbitraria pueden no ser biológicamente homóloga. Por lo tanto, permitimos que estos puntos de referencia para semirremolques matemáticamente "slide". Este procedimiento minimiza la diferencia de potencial entre las estructuras. Como se ha argumentado en otras partes del algoritmo de deslizamiento se utiliza aquí es apropiada para cuantificar regiones anatómicas similares que carecen de puntos de referencia de fácil identificación ^{3, 6, 8, 10, 11, 12} correspondiente. Estos métodos tienen su limitations ^13, sino que debe ser adaptable a los objetos de diferente tamaño y forma.

A continuación, se expone cómo se aplicó este método en un estudio reciente del báculo del ratón ^14, un hueso en el pene que se ha perdido y ganado varias veces durante la evolución de los mamíferos independientes ^15. Se discute la disección y preparación de un hueso específico, el báculo (Protocolo 1), la generación de imágenes microCT (Protocolo 2), y la conversión de estas imágenes a un formato que permite a toda la geometría computacional aguas abajo (Protocolos 3 y 4). Después de estos pasos, cada muestra está representada por ~ 100K coordenadas xyz. luego caminamos a través de una serie de transformaciones que se alinean de manera efectiva todos los especímenes en una orientación común (Protocolo 5), para definir puntos de referencia semirremolques de especímenes alineados (Protocolo 6). Protocolos 1-4 deben ser similares independientemente de que se está analizando el objeto. Protocolo 5 y 6 son spe Protocoloficamente diseñado para un báculo, pero es nuestra esperanza de que al detallar estos pasos, los investigadores pueden imaginar modificaciones que serían relevantes para su objeto de interés. Por ejemplo, se aplicaron modificaciones de estos métodos para estudiar las ballenas huesos de la pelvis y los huesos de las costillas ^16.

Protocolo

Todos los procedimientos y el personal fueron aprobados por la Universidad de Instituto del Sur de California para el Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC), protocolo # 11394.

1. La disección y preparación Baculum

1. La eutanasia a un ratón macho sexualmente maduros a través de dióxido de carbono durante la exposición, de acuerdo con los protocolos establecidos por el Comité Institucional Animal relevante Cuidado y Uso (IACUC).
2. Colocar el animal en posición supina, y prolongar el pene mediante la aplicación de presión con los pulgares lateral a la apertura del prepucio.
3. Una vez que se prolonga el pene, extender el tejido a través del prepucio medida de lo posible.
4. Con unas tijeras, cortar los extremos proximal del cuerpo del pene para el glande del pene donde reside el báculo.
5. Transferir el pene disecados a un tubo de 1,7 ml y añadir agua del grifo 200 l. Asegúrese de que el pene está completamente sumergido en el líquido.
6. Incubar el tejido en agua a ~ 50 ° C durante 3-5 días.
7. Después de la incubación adecuada, retire el tejido circundante desde el báculo, el uso de fórceps bajo un microscopio de disección. chorro suavemente 70% de etanol para empujar tejido restante y limpiar el hueso.
8. Coloque el báculo diseccionado en un nuevo tubo de microcentrífuga con la tapa abierta. Deje la tapa abierta O / N se seque hueso.

Escaneo 2. microTC

1. Presione un soporte de escaneado cilíndrica microCT en un ladrillo de espuma de floristería para crear un cilindro de espuma de floristería.
2. Extraer el cilindro de espuma de floristería y cortar rodajas ~ 2-5 cm de espesor.
3. Empuje Bacula seca en la espuma de floristería, alrededor de la periferia de una división individual para minimizar la interferencia durante el escaneado. La orientación precisa de los huesos debe hacer notar que permite la correcta identificación de las muestras individuales en el Protocolo 4.
4. Con cuidado, coloque la rebanada con los huesos incrustados en el soporte microCT.
5. Adquirir las exploraciones microCT. En el caso de bacula ratón ¹⁴ , Se utilizó un escáner uCT50 (Scanco Medical AG, Bruttisellen, Suiza) en el Centro de Imagen USC molecular bajo los siguientes parámetros: 90 kVp, 155 mu, 0,5 mm de Al filtro, 750 proyecciones por 180 (360 de cobertura), tiempo de exposición de 500 ms, y el tamaño del voxel de 15,5 mm.

3. Procesamiento microTC: Conversión de una pila .dcm a un archivo individual .xyz

NOTA: Cada escaneo microCT produce una pila de .dcm, o "DICOM", archivos que representan finas imágenes tomadas a través del objeto. Toda la geometría computacional aguas abajo requiere archivos .XYZ planas, que es simplemente un archivo de texto que contiene cuatro columnas - los ejes X, Y, y Z coordenadas de cada píxel, y la intensidad del píxel, que van desde -5000 (negro) a 5000 (blanco). Un umbral de píxeles por encima de 3000 generalmente funciona bien como un umbral para definir huesos.

1. Instalar Python (www.python.org) y los módulos de Python COMANDOS, DICOM, PYLAB, SYS, y NumPy.
2. Abrir "01_process_dicom.py "{} Figshare con cualquier editor de texto. En la sección Variables, camino de cambio, los umbrales de pixel, y de directorios según sea necesario.
3. Ejecutar "01_process_dicom.py pitón". El progreso se imprimen en la pantalla. Dentro de cada directorio llamado en el paso 3.2, un nuevo archivo se hace nombrado; por ejemplo, directory_name.PT3000.xyz, donde PT3000 indica el umbral de pixel indica en el paso 3.2.

4. procesamiento microTC: La segmentación de salida de muestra individual .xyz Archivos

1. Instalar R (https://www.r-project.org/) con el RGL biblioteca.
2. Abra el archivo '02_segment_dicoms.r' {} Figshare con cualquier editor de texto. En la sección Variables, cambiar el nombre de la ruta para que apunte al archivo creado en el Protocolo .xyz 3 anterior.
3. Desde dentro de R, ejecute la "fuente ( '02_segment_dicoms.r')" comando (sin las comillas).
4. Después de que la imagen tridimensional del archivo .xyz creado en el Protocolo 3 aparece, introduzca la number de los especímenes en el archivo general .xyz. A continuación, etiquetar y seleccionar los puntos de cada muestra utilizando las funciones de desplazamiento y zoom.
   NOTA: En el fondo, se harán archivos .XYZ separados para cada muestra. Estos aparecen en un directorio llamado, por ejemplo, XYZ_FILES_PT3000, donde PT3000 indica el umbral de píxeles utilizado.

5. "Alineación" Espécimen .xyz Archivos para Común Coordenadas.

1. Abra la secuencia de comandos "03_transform.py" Python {} Figshare, lo que requiere el módulo adicional mattdean_modules.py {} Figshare, así como dos aplicaciones autónomas: "rotate_translate_cylindrical" (https://github.com/timydaley/dean_cylindrical_tranform) y "qconvex" (www.qhull.org/html/qconvex.htm) que son utilizados por esta secuencia de comandos.
2. En la sección Variables, identificar los nombres completos de las rutas de mattdean_modules.py, rotate_path y qconvex_dir. Además, identificar la ruta completa al directorio que contiene el individuo .xyz archivos creados en el paso 4.
3. 03_transform.py correr, lo que crea un nuevo archivo por espécimen con el sufijo .TRANSFORMED.xyz.

6. "rebana" Espécimen Alineados .XYZ archivos para identificar Semi-hitos.

1. Abrir y ejecutar la secuencia de comandos de Python "04_identify_landmarks.py" {} Figshare. En la sección Variables, identificar los nombres de ruta completa al directorio que contiene los archivos .TRANSFORMED.xyz. Este script identifica 802 semirremolques de puntos de referencia que pueden utilizarse para cuantificar el tamaño y la forma de la estructura.

Resultados

Las coordenadas XYZ de los semi-hitos producidos en el Protocolo nº 6 se pueden importar directamente en cualquier análisis de morfometría geométrica basada en el hito ^17. El cálculo de tuberías anteriormente se ha aplicado para estudiar bacula ratón ^14, así como de la pelvis y huesos de las costillas de ballenas ^16. Más detalles sobre la definición de cálculo de semi-hitos se presentan aquí, en un intent...

Discusión

Los pasos críticos en el protocolo anterior son: 1) la disección de la Bacula, 2) la recopilación de las imágenes microCT, 3) convertir la salida microCT en un archivo plano de coordenadas XYZ, 4) la segmentación de salir del punto de enturbiamiento de cada espécimen, 5) la transformación de cada muestra a un normalizado sistema de coordenadas, y 6) la definición de semi-hitos. Estos pasos se modifican fácilmente para adaptarse a diferentes objetos.

Estos métodos probable se pueden...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting scissors	VWR	470106-338	Most sizes should work
Dissecting Forceps, Fine Tip, Curved	VWR	82027-406
1.7 mL microcentrifuge tube	VWR	87003-294
Absolute Ethanol	Fisher Scientific	CAS 64-17-5	To be diluted to 70% for dissections
Floral Foam	Wholesale Floral	6002-48-07
uCT50 scanner	Scanco Medical AG, Bruttisellen, Switzerland