Dissection, microCT Numérisation et morphométriques Analyses du Baculum

Résumé

De nombreuses structures biologiques manquent des repères facilement définissables, ce qui rend difficile l'application de méthodes morphométriques modernes. Ici, nous illustrons les méthodes pour étudier la baculum de la souris (un os dans le pénis), y compris la dissection et le balayage microCT, suivie par des méthodes de calcul pour définir les demi-points de repère qui sont utilisées pour quantifier la taille et la forme de la variation.

Résumé

morphométriques modernes fournit de puissantes méthodes pour quantifier la taille et la forme variation. Une exigence de base est une liste de coordonnées qui définissent des repères; cependant ces coordonnées doivent représenter des structures homologues à travers des spécimens. Alors que de nombreux objets biologiques consistent en des repères facilement identifiables pour satisfaire l'hypothèse d'homologie, beaucoup manquent de telles structures. Une solution potentielle est mathématiquement place des demi-points de repère sur un objet qui représente la même région morphologique à travers des spécimens. Ici, nous illustrons un pipeline récemment mis au point pour définir mathématiquement semi-repères de la baculum de la souris (l'os du pénis). Nos méthodes devraient être applicables à un large éventail d'objets.

Introduction

Le domaine de la morphométrie comprend une diversité de méthodes pour quantifier la taille et la forme de la forme biologique, une étape fondamentale dans la recherche scientifique ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Traditionnellement, l'analyse statistique de la taille et la forme commence par l'identification des repères sur une structure biologique, puis en mesurant les distances linéaires, les angles et les rapports qui pourraient être analysés dans un cadre multivarié. Géométrique Morphométrie basée Landmark est une approche qui conserve la position spatiale des points de repère, préservation de l' information géométrique de la collecte de données par l' analyse et la visualisation ^5. Généralisée Analyse Procuste (GPA) peut être appliqué pour éliminer la variation de l'emplacement, l'échelle et la rotation des points de repère pour produire un alignement entre les spécimens qui minimizes leurs différences au carré - ce qui reste est la forme dissemblance ^7.

Un concept important de toute analyse morphométrique est homologie, ou l'idée que l'on peut identifier de manière fiable des repères représentant des caractéristiques biologiquement significatives et discrètes qui correspondent entre les spécimens ou structures. Par exemple, des crânes humains ont des processus homologues, foramen, sutures, et des conduits qui peuvent permettre des analyses morphométriques. Malheureusement, l'identification de repères correspondants est difficile à travers de nombreuses structures biologiques, en particulier celles avec des surfaces lisses ou des courbes ^{8, 9, 10.}

Nous abordons ce problème ci-dessous en utilisant la géométrie algorithmique. Le flux de travail général est de générer un balayage en trois dimensions de l'objet qui peut être représenté comme un nuage de points, puis faire pivoter et transformer ce nuage de points de telle sorte que tout specimens sont orientés sur un système de coordonnées commun. Ensuite, nous définissons mathématiquement semi-repères des régions spécifiques de l'objet. Semi-repères discrets placés sur ces régions sont biologiquement arbitraire ^11. Mener GPA et les analyses statistiques ultérieures peut produire des artefacts indésirables ^{8, 12} parce que des repères arbitrairement placés peuvent ne pas être biologiquement homologue. Par conséquent, nous permettons à ces demi-points de repère pour mathématique "slide". Cette procédure minimise la différence de potentiel entre les structures. Comme dit ailleurs l'algorithme de glissement utilisé ici est appropriée pour quantifier les régions anatomiques similaires manquant facilement identifié des repères ^{3, 6, 8, 10, 11, 12} correspondant. Ces méthodes ont leur limitations ^13, mais devrait être adaptable à des objets de taille et de forme différentes.

Ici, nous illustrons comment cette méthode a été appliquée dans une étude récente de la baculum de la souris ^14, un os dans le pénis qui a été gagné et perdu plusieurs fois indépendants lors de l' évolution des mammifères ^15. Nous discutons de la dissection et la préparation d'un os spécifique, le baculum (Protocole 1), la génération d'images microCT (protocole n ° 2), et la conversion de ces images à un format qui permet à tous la géométrie algorithmique aval (Protocoles 3 et 4). Après ces étapes, chaque échantillon est représenté par les coordonnées ~ 100K xyz. Nous marchons ensuite à travers une série de transformations qui alignent efficacement tous les spécimens dans une orientation commune (protocole 5), puis de définir les demi-points de repère à partir d'échantillons alignés (Protocole 6). Protocoles 1-4 devraient être similaires quel que soit l'objet en cours d'analyse. Protocole 5 et protocole n ° 6 sont spefiquement conçu pour un baculum, mais nous espérons que, en détaillant ces étapes, les enquêteurs peuvent imaginer des modifications qui seraient pertinentes pour leur objet d'intérêt. Par exemple, des modifications de ces méthodes ont été appliquées pour étudier les baleines os du bassin et os des côtes ^16.

Protocole

Toutes les procédures et le personnel ont été approuvés par l'Institut universitaire de Californie du Sud pour les soins aux animaux et l'utilisation Commission (IACUC), protocole # 11394.

1. Baculum Dissection et préparation

1. Euthanasier une souris mâle sexuellement matures par le dioxyde de carbone sur-exposition, selon les protocoles établis par la commission compétente institutionnelle animale soin et l'utilisation (IACUC).
2. Couchez l'animal en position couchée, et prolonger le pénis en appliquant une pression avec le pouce latéral à l'ouverture du prépuce.
3. Une fois que le pénis se prolonge, étendre le tissu à travers le prépuce, autant que possible.
4. Avec des ciseaux, couper le corps proximal du pénis pour le gland où le baculum réside.
5. Transférez le pénis disséqués à un tube de 1,7 ml et ajouter de l'eau du robinet de 200 pi. Assurez-vous que le pénis est complètement immergée dans le liquide.
6. Laisser incuber le tissu dans l'eau à environ 50 ° C pendant 3-5 jours.
7. Après une incubation appropriée, retirer le tissu environnant de la baculum, en utilisant une pince sous un microscope de dissection. gicler doucement 70% d'éthanol pour pousser le tissu restant et nettoyer l'os.
8. Placez le baculum disséquée dans un nouveau tube avec le bouchon ouvert. Laissez plafonner ouvert O / N pour sécher l'os.

2. microCT Numérisation

1. Appuyez sur un support de balayage cylindrique microCT dans une brique de mousse fleuriste pour créer un cylindre de mousse fleuriste.
2. Extraire le cylindre de mousse fleuriste et couper des tranches ~ 2-5 cm d'épaisseur.
3. Poussez bacula séché dans la mousse de fleuriste, autour de la périphérie d'une tranche individuelle pour minimiser les interférences lors de la numérisation. L'orientation précise des os faut remarquer permettant l'identification correcte des échantillons individuels dans le protocole 4.
4. Placez délicatement la tranche avec les os incorporés dans le porte-microCT.
5. Acquérir scans microCT. Dans le cas de bacula de souris ¹⁴ , Nous avons utilisé un scanner uCT50 (Scanco Medical AG, Bruttisellen, Suisse) à l'USC Centre d'imagerie moléculaire sous les paramètres suivants: 90 kVp, 155 pA, 0,5 filtre mm Al, 750 projections par 180 (360 couverture), temps d'exposition de 500 ms, et la taille de voxel de 15,5 mm.

3. Traitement de microCT: Conversion d'une pile .dcm dans un fichier unique .xyz

NOTE: Chaque scan microCT produit une pile de .dcm, ou «DICOM», les fichiers qui représentent des tranches d'image prises à travers l'objet. Toute la géométrie computationnelle aval nécessite des fichiers .xyz plats, qui est tout simplement un fichier texte qui contient quatre colonnes - les x, y et z les coordonnées de chaque pixel, et l'intensité du pixel, allant de -5000 (noir) à 5,000 (blanc). Un seuil de pixel au-dessus de 3000 fonctionne généralement bien comme un seuil pour définir les os.

1. Installez Python (www.python.org) et les modules de PYTHON COMMANDEMENTS, DICOM, PYLAB, SYS et numpy.
2. Ouvrir 01_pr "ocess_dicom.py "{Figshare} avec un éditeur de texte. Dans la section Variables, changement chemin, les seuils de pixels, et les noms de répertoire si nécessaire.
3. Exécuter "01_process_dicom.py python". Progress sera imprimé à l'écran. Au sein de chaque répertoire nommé à l'étape 3.2, un nouveau fichier est nommé; par exemple, directory_name.PT3000.xyz, où PT3000 indique le seuil de pixel indiqué à l'étape 3.2.

4. Traitement de microCT: Segmentation-out individuel Specimen .xyz Fichiers

1. Installez R (https://www.r-project.org/) avec la bibliothèque RGL.
2. Ouvrez le fichier '02_segment_dicoms.r' {Figshare} avec un éditeur de texte. Dans la section Variables, changer le nom de chemin pour pointer vers le fichier .xyz créé dans le protocole 3 ci-dessus.
3. De l'intérieur R, exécutez la «source ( '02_segment_dicoms.r')" de commande (sans les guillemets).
4. Une fois l'image en trois dimensions du fichier .xyz créé dans le protocole 3 apparaît, entrez le number de spécimens dans le fichier global de .xyz. Ensuite, étiqueter et sélectionner les points de chaque échantillon en utilisant les fonctions de défilement et de zoom.
   NOTE: Dans le fond, les fichiers .xyz distincts seront effectués pour chaque échantillon. Ceux-ci apparaissent dans un répertoire nommé, par exemple, XYZ_FILES_PT3000, où PT3000 indique le seuil de pixel utilisé.

5. "Alignement" Specimen .xyz Files to Coordonnées commune.

1. Ouvrez le script Python "03_transform.py" {Figshare}, ce qui nécessite le module supplémentaire mattdean_modules.py {Figshare}, ainsi que deux applications autoportants: "rotate_translate_cylindrical" (https://github.com/timydaley/dean_cylindrical_tranform) et "qconvex" (www.qhull.org/html/qconvex.htm) qui sont utilisés par ce script.
2. Dans la section Variables, identifier les noms de chemin complet à mattdean_modules.py, rotate_path et qconvex_dir. En outre, identifier le chemin complet vers le répertoire contenant le .xy individuelz les fichiers créés à l'étape 4.
3. 03_transform.py Run, ce qui crée un nouveau fichier par spécimen avec le suffixe .TRANSFORMED.xyz.

6. "Slicing" Specimen alignés .xyz Fichiers pour identifier Demi-repères.

1. Ouvrez et exécutez le script Python "04_identify_landmarks.py" {Figshare}. Dans la section Variables, identifier les noms de chemin complet vers le répertoire contenant les fichiers .TRANSFORMED.xyz. Ce script identifie 802 demi-points de repère qui peuvent être utilisés pour quantifier la taille et la forme de la structure.

Résultats

Les coordonnées xyz des demi-repères produites dans le protocole 6 peuvent être importés directement dans une base historique-morphométrie géométrique analyse ^17. Le pipeline de calcul ci - dessus a été appliquée à l' étude de la souris bacula ^14, ainsi que du bassin de baleine et os des côtes ^16. Plus de détails sur la définition de calcul des semi-repères sont présentés ici, dans une tentative...

Discussion

Les étapes critiques dans le protocole ci-dessus sont 1) disséquant le bacula, 2) regroupant les images microCT, 3) convertir la sortie de microCT à un fichier plat de coordonnées XYZ, 4) segmentant sur le point nuage de chaque échantillon, 5) la transformation de chaque échantillon à un système de coordonnées normalisé, et 6) définissant semi-repères. Ces étapes sont facilement modifiés pour accueillir des objets différents.

Ces méthodes peuvent probablement être appliquée...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting scissors	VWR	470106-338	Most sizes should work
Dissecting Forceps, Fine Tip, Curved	VWR	82027-406
1.7 mL microcentrifuge tube	VWR	87003-294
Absolute Ethanol	Fisher Scientific	CAS 64-17-5	To be diluted to 70% for dissections
Floral Foam	Wholesale Floral	6002-48-07
uCT50 scanner	Scanco Medical AG, Bruttisellen, Switzerland