음경 골의 해부, MicroCT 스캔 및 형태 학적 분석

요약

많은 생물학적 구조 어려운 현대 형태 계측 학적 방법을 적용 할 수있어 쉽게 정의 최적 부족하다. 여기에서 우리는 크기를 정량화하고 변화를 형성하는 데 사용되는 세미 랜드 마크를 정의하는 계산 방법 다음 해부 및 microCT 스캔을 포함하여 마우스 음경 골 (음경의 뼈), 공부하는 방법을 설명한다.

초록

현대 morphometrics는 크기와 모양 변화를 정량화하는 강력한 방법을 제공합니다. 기본 요구 사항은 랜드 마크를 정의하는 좌표의 목록입니다; 그러나 이러한 좌표는 표본에서 상동 구조를 표현해야합니다. 많은 생물학적 개체 동성의 가정을 만족시키기 쉽게 식별 최적 구성되어 있지만, 많은 그러한 구조물이 없다. 하나의 잠재적 인 솔루션은 표본에서 동일한 형태 학적 영역을 나타내는 개체에서 발생하는 세미 랜드 마크를 수학적으로하는 것입니다. 여기, 우리는 수학적으로 마우스 음경 골 (음경 뼈) 세미 랜드 마크를 정의하기 위해 최근에 개발 된 파이프 라인을 보여줍니다. 우리의 방법은 개체의 넓은 범위에 적용될 수 있어야한다.

서문

morphometrics의 필드 크기 및 생물 형태의 모양, 과학 탐구 ^{1, 2, 3, 4, 5, 6에} 기초하는 단계를 정량화하는 방법의 다양성을 포함한다. 전통적으로, 크기 및 형태의 통계적 분석은 생물학적 최적 구조를 식별하고 다변량 분석 워크 수 직선 거리, 각도 및 비율을 측정함으로써 시작된다. 랜드 마크 기반의 기하학적 Morphometrics 분석 및 시각화 ^(5)를 통해 데이터 수집에서 기하학적 정보를 보존, 랜드 마크의 공간 위치를 유지 접근 방식이다. 일반화 된 프로크루스테스 분석 (GPA)이 있어요 표본 사이의 정렬을 생산하기 위해 위치, 규모 및 랜드 마크의 회전에 변화를 제거하기 위해 적용 할 수 있습니다자신의 제곱의 차이를 inimizes - 무엇을 유지하는 형상 유사성 ^(7)이다.

어떤 형태 계측 학적 분석의 중요한 개념은 동성, 또는 하나가 안정적으로 표본 또는 구조 사이에 해당하는 생물학적 의미 및 이산 기능을 대표하는 랜드 마크를 식별 할 수있는 생각이다. 예를 들어, 인간의 두개골 형태 계측 학적 분석을 활성화 할 수 있습니다 상동 프로세스, foramina, 봉합 및 덕트가 있습니다. 불행히도, 대응하는 최적의 식별은 평활 표면 또는 곡선 ^{8, 9, 10,} 특히 많은 생물학적 구조 걸쳐 어렵다.

우리는 계산 기하학을 사용하여 아래이 문제를 접근. 일반적인 워크 플로는 모든이야 있도록 그 점 구름을 점 구름으로 표현 될 수있는 물체의 3 차원 스캔을 생성 한 다음 회전 변환하는 것입니다pecimens는 공통 좌표계의 방향. 그 다음 우리는 수학적 개체의 특정 지역에서 세미 랜드 마크를 정의합니다. 같은 지역에 배치 이산 세미 랜드 마크 ⁽¹¹⁾ 생물학적으로 임의의 수 있습니다. 임의로 배치 랜드 마크가 생물학적으로 상동하지 않을 수 있기 때문에 GPA 이후의 통계 분석을 실시하는 것은 바람직하지 않은 유물 ^{8, 12을} 생성 할 수 있습니다. 따라서 우리는 이러한 반 랜드 마크가 수학적으로 "슬라이드"에 있습니다. 이 절차는 구조물과의 전위차를 최소화한다. 다른 곳에서 논의 된 바와 같이 여기에 사용되는 알고리즘 슬라이딩 부족 유사한 해부학 적 영역을 정량화하는 것이 적절하다 쉽게 최적 ^{3, 6, 8, 10, 11, 12에 대응하는} 식별. 이 방법은 리튬이mitations ^{(13),하지만} 서로 다른 크기와 모양의 객체에 적용 할 수 있어야합니다.

여기, 우리가이 방법은 마우스 음경 골 ^(14)의 최근 연구에 적용된 방법을 설명, 얻고 포유 동물의 진화 ^15시에 여러 개의 독립적 번 손실 된 음경의 뼈. 우리는 절개 특정 뼈의 제조 상기 음경 골 (프로토콜 1) microCT 이미지의 생성 (프로토콜 2) 모든 다운 스트림 계산 기하학을 가능하게하는 형식으로 이러한 이미지 변환 논의 (프로토콜 3, 4). ~ 100K의 XYZ 좌표에 의해 다음 단계 후, 각 시편 표시됩니다. 우리는 다음을 효과적으로 공통의 방향에 모든 검체 (프로토콜 5) 정렬 변환의 시리즈를 통해 도보로, 다음 정렬 표본 세미 랜드 마크 (프로토콜 6)를 정의합니다. 프로토콜 1-4에 관계없이 객체가 분석되는 유사해야합니다. 프로토콜 5 및 의정서 6 SPE 있습니다cifically 음경 골을 위해 설계,하지만이 단계를 자세히 설명하여 연구자가 관심을 자신의 객체에 대한 중요한 것 수정을 상상할 수있는 우리의 희망입니다. 예를 들면, 이러한 방법의 변형은 고래 골반 뼈와 뼈 리브 ^(16)를 연구하기 위해 적용 하였다.

프로토콜

모든 절차와 인원은 동물 관리 및 사용위원회 남부 캘리포니아 대학의 대학 (IACUC), 프로토콜 # 11394에 의해 승인되었다.

1. 음경 골 해부 및 준비

1. 관련 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에서 정한 프로토콜에 따라, 과다 노출 이산화탄소를 통해 성적으로 성숙한 수컷 마우스를 안락사.
2. 앙와위에서 동물을 배치하고, 엄지 손가락은 포피 개방 측 방향으로 압력을 적용하여 음경을 뻗치다.
3. 음경이 길어지면, 가능한 한 포피 통해 조직을 확장한다.
4. 가위로, 음경 골이있는 귀두의 음경 몸 인접를 잘라.
5. 1.7 ML의 튜브에 해부 성기를 전송하고 200 μL의 수돗물을 추가합니다. 음경이 완전히 액체에 잠긴 않았는지 확인합니다.
6. 3~5일 위해 ~ 50 ° C의 물에서의 조직을 인큐베이션.
7. 적절한 배양 후, 해부 현미경으로 집게를 사용하여 음경 골에서 주변 조직을 제거합니다. 부드럽게 조직을 밀어 나머지 뼈를 청소하는 70 % 에탄올을 분출.
8. 열린 모자와 새로운 microcentrifuge 관에 해부 음경 골을 넣습니다. 열린 O 캡 남기기 / N 뼈를 건조합니다.

2. MicroCT 스캐닝

1. 꽃집 거품의 실린더를 만드는 꽃집 거품의 벽돌로 microCT 스캔 원통형 홀더를 누르십시오.
2. 꽃집 거품의 실린더를 추출하고 2-5cm 두께 ~ 조각을 잘라.
3. 스캔하는 동안 간섭을 최소화하기 위해 개별 조각의 주위에, 꽃집 폼에 건조 bacula을 누릅니다. 뼈의 정확한 방향은 프로토콜 4 각 시편의 적절한 식별을 가능하게 주목해야한다.
4. 조심스럽게 microCT 홀더에 삽입 된 뼈 조각을 배치합니다.
5. microCT 스캔을 획득. 마우스 bacula ^(14)의 경우, , 우리는 다음과 같은 설정 아래에있는 USC 분자 이미징 센터에서 uCT50 스캐너 (Scanco 의료 AG, Bruttisellen, 스위스) 사용 500 밀리, 15.5 mm의 복셀 크기입니다.

3. MicroCT 처리 : 단일가 .xyz 파일에 .DCM 스택 변환

참고 : 각 microCT 스캔이 .DCM의 스택, 또는 "DICOM"개체를 통해 촬영 한 이미지 조각을 나타내는 파일을 생성합니다. x, y 및 각 화소의 Z 좌표와 -5,000 (검은 색)에서 5000의 범위의 화소의 강도 - 모든 다운 스트림 계산 기하학 네 개의 컬럼을 포함하는 텍스트 파일이 단순히 인 평면 .xyz 인 파일이 필요 (화이트). 3,000 위의 픽셀 임계 값은 일반적으로 뼈를 정의하기위한 임계 값으로 잘 작동합니다.

1. 설치 파이썬 (www.python.org)와 파이썬 모듈 명령, DICOM, PYLAB, SYS, 그리고 NumPy와.
2. 열기 "01_process_dicom.py "텍스트 편집기와 {Figshare}. 필요에 따라 변수 섹션, 변경 경로, 픽셀 임계 값 및 디렉토리 이름에서.
3. "파이썬 01_process_dicom.py"를 실행합니다. 진행 화면이 출력됩니다. 단계 3.2에 지정된 각 디렉토리 내에서 새 파일의 이름은 만든되며, 예 PT3000 화소 임계치를 나타내는 directory_name.PT3000.xyz는 단계 3.2에 나타내었다.

4. MicroCT 처리 : 분단 아웃 개별 표본을 파일가 .xyz

1. 라이브러리 RGL와 R을 (https://www.r-project.org/)를 설치합니다.
2. 텍스트 편집기를 사용하여 파일 '02_segment_dicoms.r'{Figshare}을 엽니 다. 변수 섹션에서 위의 프로토콜 3에서 만든 .xyz 인 파일을 가리 키도록 경로 이름을 변경합니다.
3. R 내에서 (따옴표없이) 명령 "소스 ( '02_segment_dicoms.r')를"실행합니다.
4. 프로토콜 3에서 만든 .xyz 인 파일의 세 가지 차원 이미지 후에 나타나면 한 접점을 입력전체가 .xyz 파일에서 표본의 연구. 그런 다음 레이블과 스크롤 및 줌 기능을 사용하여 각 시편의 점을 선택합니다.
   참고 : 배경에서 분리가 .xyz 파일은 각각의 시료에 대하여 설명한다. 이들은 PT3000 사용 된 픽셀 임계 값을 나타냅니다 예를 들어, XYZ_FILES_PT3000에 대해,라는 이름의 디렉토리에 나타납니다.

"정렬"5. 표본은 일반 좌표로 파일이 .xyz.

1. 추가 모듈 mattdean_modules.py {Figshare}뿐만 아니라이 자립 응용 프로그램을 필요로하는 파이썬 스크립트 "03_transform.py"{Figshare}을 열고 "rotate_translate_cylindrical"(https://github.com/timydaley/dean_cylindrical_tranform) 와 "qconvex"(www.qhull.org/html/qconvex.htm)이 스크립트에 의해 사용되는.
2. 변수 섹션에서, rotate_path 및 qconvex_dir을 mattdean_modules.py의 전체 경로 이름을 식별합니다. 또한, 개별 xy를 들어있는 디렉토리의 전체 경로를 확인4 단계에서 만든 Z 파일.
3. 접미사 .TRANSFORMED.xyz와 시편마다 새 파일을 만들어 실행 03_transform.py.

파일가 .xyz 6. "슬라이스"정렬 된 표본은 세미 랜드 마크를 확인합니다.

1. 열기와 파이썬 스크립트 "04_identify_landmarks.py"를 실행 {Figshare}. 변수 섹션에서 .TRANSFORMED.xyz 파일이있는 디렉토리에 전체 경로 이름을 식별합니다. 이 스크립트는 구조의 크기 및 형상을 정량화하는데 사용될 수있다 (802) 준 최적를 식별한다.

결과

프로토콜 (6)에서 생성 된 세미 랜드 마크의 XYZ 좌표는 직접 랜드 마크 기반의 기하학적 morphometrics 분석 ^(17)로 가져올 수 있습니다. 연산 파이프 라인은 상기 마우스 bacula ^(14)뿐만 아니라 고래 골반 뼈와 리브 ^(16)를 연구하기 위해 적용되었다. 세미 랜드 마크의 계산 정의에 대한 자세한 내용은 연구자들이 관심을 자신?...

토론

위의 프로토콜의 중요한 단계는 1) bacula를 해부하고, 2) microCT 이미지를 수집, 3) XYZ의 플랫 파일에 microCT 출력을 변환, 4) 각 시편의 점 구름을 분할 좌표, 5)에 각각의 시료를 변환 표준화 좌표계, 6) 반 랜드를 형성 할 수있다. 이러한 단계는 용이하게 다른 물체를 수용하도록 수정된다.

이러한 방법은 가능성도 곡선 적어도 본질적으로 "막 대형", 또는 임의의 객체에 적?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting scissors	VWR	470106-338	Most sizes should work
Dissecting Forceps, Fine Tip, Curved	VWR	82027-406
1.7 mL microcentrifuge tube	VWR	87003-294
Absolute Ethanol	Fisher Scientific	CAS 64-17-5	To be diluted to 70% for dissections
Floral Foam	Wholesale Floral	6002-48-07
uCT50 scanner	Scanco Medical AG, Bruttisellen, Switzerland