استخدام أجهزة ميكروفلويديك لقياس عمر والخلوية الظواهر في خلايا الخميرة في مهدها واحدة

Summary

تقدم هذه المقالة بروتوكول الأمثل لإنتاج رقائق ميكروفلويديك وإعداد التجارب الموائع الدقيقة لقياس عمر والظواهر الخلوية من خلايا الخميرة واحدة.

Abstract

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

Introduction

في مهدها الخميرة يعد مصدرا قويا لنموذج حي في الشيخوخة البحوث. ومع ذلك، فحص عمر التقليدية في الخميرة يعتمد على تسليخ مجهري، وهو عمل ليس فقط المكثف ولكن أيضا انخفاض الإنتاجية ^{1 و 2.} وبالإضافة إلى ذلك، فإن النهج التقليدي تسليخ مجهري لا يقدم على عرض تفصيلي لمختلف الخصائص الخلوية والجزيئية في الخلايا الأم واحدة مع تقدمهم في السن. وقد مكن تطوير أجهزة ميكروفلويديك إجراء الآلي لقياس الخميرة عمر وكذلك لمتابعة الواسمات الجزيئية ومختلف الظواهر الخلوية في مختلف مراحل العمر من الخلايا الأم ^{3، 4، 5، 6، 7، 8.} بعد تحميل خلايا الخميرة في جهاز ميكروفلويديك، فإنها يمكن تتبع تحت المجهر باستخدام التلقائي الوقت فاتالبريد التصوير. مع مساعدة من التصوير تجهيز الأدوات، ومختلف الظواهر الخلوية والجزيئية يمكن استخراج ^{3، 6، 8،} بما في ذلك عمر، حجم، مراسل فلوري، مورفولوجيا الخلايا، وديناميات دورة الخلية، وما إلى ذلك، وكثير منها يصعب أو يستحيل الحصول باستخدام طريقة تسليخ مجهري التقليدي. اكتسبت أجهزة ميكروفلويديك مكانة بارزة في البحوث الخميرة الشيخوخة منذ التطوير الناجح من قبل بضع سنوات ^{3 و 4 و 6 و 7.} وقد نشرت عدة مجموعات في وقت لاحق على أشكال مختلفة من التصاميم السابقة ^5، والعديد من معامل الخميرة قد استخدمت أجهزة ميكروفلويديك لدراستهم.

في ثقافة خلية تشهد نموا مطردا، وعدد الخلايا الأم في سن المتوفرة للمراقبة هو miniscuجنيه. ولذلك، فإن مبدأ التصميم العام للجهاز ميكروفلويديك لقياس عمر هو الإبقاء الخلايا الأم ولإزالة الخلايا الوليدة. واحدة من هذه التصاميم يستفيد من حقيقة أن الخميرة يخضع انقسام الخلايا غير المتماثلة. الهياكل في الخلايا الأم إرادة جهاز فخ اكبر وتسمح للخلايا ابنته الصغيرة التي يجب غسلها بعيدا. يستخدم رقاقة ميكروفلويديك الموصوفة في هذه المقالة polydimethylsiloxane لينة (PDMS) لوحة (الأعمدة متدل العمودي) إلى خلايا فخ الأم (الشكل 1). وقد تم الإبلاغ عن الأجهزة من تصميم مماثل سابقا ^{3 و 4 و 6 و 7.} يستخدم هذا البروتوكول إجراء أبسط لصنع أجهزة ميكروفلويديك واضحة طريقة خلية التحميل التي يتم أمثل للتجارب الوقت الفاصل بين التصوير. واحدة من المعالم الرئيسية في الجهاز ميكروفلويديك هو العرض من منصات PDMS تستخدم لخلايا فخ الأم. لدينا ديستخدم evice منصات أوسع يمكن أن تبقي أكثر من الخلايا الأم تحت كل لوحة، بما في ذلك جزء كبير من الخلايا الأم العذبة التي يمكن تتبعها طيلة حياتها. بالإضافة إلى قياسات عمر، وهذا البروتوكول هو مفيد لتجارب التصوير وحيد الخلية مرور الزمن عندما تحتاج لتعقبها لأجيال عديدة أو عند ملاحظة طوال العمر كله ضروري الخلايا.

Protocol

1. رقاقة السيليكون قالب التصنيع

ملاحظة: تم تصميم الضوئية الرئيسية مع برنامج أوتوكاد وتصنيعها من قبل شركة تجارية. هذا التصميم يحتوي على ثلاث طبقات من أنماط مختلفة ( ملف التكميلي 1 ). مرتفعات الطبقات الأولى والثانية، والثالثة هي حوالي 4 ميكرون، 10 ميكرون، و 50 ميكرون، على التوالي. تم إنشاء قالب السيليكون رقاقة من الضوئية الرئيسية باستخدام الطباعة الحجرية الناعمة ^{9 و 10.}

1. خبز رقاقة السيليكون على حرارة 200 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لتتبخر بخار الماء. معطف تدور مقاومة للضوء سلبي SU-8 على رقاقة السيليكون.
   ملاحظة: معطف سبين SU-8 3005 في 5000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية لتوليد الطبقة الأولى، SU-8 2010 في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية لتوليد الطبقة الثانية، وSU-8 3025 في 2000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية لتوليد الطبقة الثالثة.
2. لينة خبز الرقاقة المغلفة قبل روقال انه نقل نمط. محاذاة وفضح الرقاقة في وضع "الاتصال المباشر" باستخدام اليجنر قناع.
   ملاحظة: لينة خبز الرقاقة لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة الطبقة الأولى، 3 دقيقة في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة الطبقة الثانية، و 15 دقيقة في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة الطبقة الثالثة. استخدام جرعة التعرض للفي 100 ميغا جول / سم ² للطبقة الأولى، 130 ميغا جول / سم ² للطبقة الثانية، و 200 ميغا جول / سم ² للطبقة الثالثة.
3. بعد التعرض، بعد خبز الرقاقة وتطويره باستخدام SU-8 المطور. تجفيف الرقاقة باستخدام مدفع N ₂ ويصعب خبز الرقاقة على حرارة 200 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
   ملاحظة: تم إصلاح العفن رقاقة السيليكون إلى 15 سم القطر البلاستيك طبق بتري باستخدام الشريط سكوتش، مع الجانب نمط مواجهة. عادة، وضعنا العديد من الهياكل رقاقة متطابقة على نفس القالب، والذي يسمح متعددة رقائق ميكروفلويديك لتكون ملفقة في نفس الوقت. يمكن لكل قالب إعادة استخدامها مرات عديدة لصنع رقائق ميكروفلويديك.

2. ميكروفلويديكتصنيع رقاقة

1. ضع قارب وزنها نظيف على التوازن والفارغة التوازن. صب 50 غ من قاعدة PDMS في وزن القارب.
2. إضافة 5 غرام من PDMS كيل علاج للوزن القارب (ث / ث نسبة من 01:10 إلى قاعدة PDMS).
   ملاحظة: يعتمد هذا الكتاب على 15 سم القطر طبق بيتري مع القالب. ضبط كمية من كاشف في حالة استخدام طبق بتري من حجم مختلف.
3. تحريك قاعدة PDMS وكيل علاج مع ماصة المتاح. بدء من على حافة القارب وزنها والتحرك ببطء الى الداخل. يقلب جيدا لعدة دقائق حتى تتشكل فقاعات صغيرة على مدار الخليط. خلط دقيق أمر ضروري لPDMS البلمرة.
4. يصب الخليط ببطء في طبق بيتري. الخليط يجب أن تغطي تماما العفن رقاقة السيليكون.
5. وضع طبق بتري في فراغ لمدة 10 دقيقة لإزالة جميع فقاعات الهواء من خليط PDMS. إذا بقيت فقاعات على سطح الخليط، واستخدام ماصة لتفجير بها.
6. احتضان السيليكونرقاقة القالب مع PDMS في فرن عند 75 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
7. قشر بلطف طبقة PDMS بلمرة قبالة العفن رقاقة السيليكون، وتجنب أي ضرر للبناء العفن رقاقة. بدلا من ذلك، وقطع PDMS مباشرة من العفن رقاقة السيليكون مع الحد الأدنى من هامش 5 ملم حول نمط استخدام حافة واحدة حلاقة الصناعية شفرة. قشر بلطف طبقة PDMS قبالة العفن رقاقة.
8. وضع طبقة PDMS على مقاعد البدلاء مع الجانب نمط مواجهة. قطع بعناية شريحة الأفراد مع حافة واحدة حلاقة الصناعية شفرة، والإبقاء على هامش كاف من حافة كل شريحة واحدة لتجنب الضرر البناء.
9. مع الجانب نمط مواجهة، استخدم القلم لكمة (ID 0.75 ملم) لكمة ثقوب أسفل على التوالي من خلال الدوائر مدخل ومخرج على كل جانب من القنوات.
   ملاحظة: هذه الثقوب خلق مسار لتدفق المتوسطة. ولذلك، من المهم أن تذهب من خلال الدوائر ولكمة على طول الطريق من خلال طبقة PDMS. تاكد منإزالة أعمدة PDMS من الحفرة.
10. تحقق كل ثقب اللكم من قبل إدخال الإبرة لكمة ركلة جزاء ثانية في حفرة. تأكد من الإبرة يمكن أن يخرج من الجانب الآخر، مشيرا إلى أنه لا يوجد انسداد. تطبيق الشريط إلى سطح النمط، ثم تقشر بلطف الشريط لتنظيف الغبار والجسيمات. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات على الأقل. ترك قطعة نظيفة من لاصق شفاف على PDMS للحفاظ على التعقيم.
11. كرر هذا الإجراء على الجانب الآخر من PDMS وترك آخر قطعة من الشريط على كذلك.
12. إعداد 24 مم × 30 مم غطاء زجاجي مع سمك 0،13-0،17 ملم. رذاذ الايثانول 70٪ على الزجاج والجافة مع مزيل الغبار لتعقيم السطح؛ بالإضافة إلى ذلك، والزجاج يمكن غسلها بالماء تعقيمها وتجفيفها مع مزيل الغبار.
13. نقل الغطاء الزجاجي وPDMS لوحة من البلاستيك. إزالة الشريط سكوتش من PDMS ووضع الجانب نمط مواجهة. تجنب أي اتصال مع سطح نمط أثناء عملية النقل.
14. وضع لوحة من البلاستيك في آلة البلازما. تطبيق العلاج الأكسجين البلازما إلى PDMS وغطاء زجاجي لجعل الأسطح المائية مع المعلمات العملية التالية: التعرض، 75 ثانية؛ تثبيت غازات، 20 سم مكعب / دقيقة. ضغط، 200. والسلطة، و 100 W.
15. وضع بعناية PDMS على الزجاج غطاء، وربط كل السطوح المائية (السطوح التي واجهت حتى أثناء العلاج البلازما). تأكد من عدم وجود أي فقاعات الهواء بين PDMS والزجاج غطاء.
16. احتضان شريحة PDMS في فرن عند 75 درجة مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل.
    ملاحظة: على microfluidics ناقص قد يسبب تسرب السائل على المجهر خلال التجربة. ولذلك، فمن المهم للتحقق من السندات بين PDMS والزجاج غطاء من خلال رفع قليلا من PDMS من الحواف مع ملاقط. رفع بلطف PDMS لا ينبغي فصلها عن غطاء زجاجي، مما يدل على السندات الناجح.

3. الاستعداد للتجربة

إعداد أنبوب.
1. غمر المدخلات والمخرجات الأنابيب في 70٪ من محلول الإيثانول بشكل منفصل 1 يوم قبل إعداد PDMS رقاقة.
2. ملء حقنة 5 مل مع الماء تعقيمها لغسل الأنابيب. يغسل كل أنبوب عن طريق توصيل أنبوب على حقنة والتنظيف الأنبوب بالماء.
3. كرر الخطوة الغسيل 3 مرات على الأقل لتنظيف بقايا الايثانول.
1. دراسة قنوات PDMS تحت المجهر الضوئي مع الهدف 10X للتأكد من أن هيكل ثابت وسليمة. استقرار رقاقة PDMS على منصة باستخدام المجهر الاسكتلندي.
   ملاحظة: جعل رقائق متعددة في وقت واحد في الخطوة 2 لضمان عدم وجود رقائق النسخ الاحتياطي، وخاصة إذا جعل الجهاز لأول مرة.
2. ملء حقنة 5 مل مع الماء تعقيمها. تأمين حقنة إلى ضخ حقنة وادخال المدخلات والمخرجات أنابيب المقابلة. ضبط سرعة غسل إلى 750 ميكرولتر / ساعة لشطف رقاقة لحوالي 10 دقيقة. فقاعات الهواء على القنوات فرعيجب أن جرفت خلال هذه الفترة؛ إذا كانت هناك فقاعات المتبقية، يدويا ضبط سرعة للقضاء على فقاعات.
3. إعداد نموذج الخميرة.
   1. نقل 1 مل من عينة الخميرة المعدة (OD ₆₀₀ 0،6-0،8) إلى قسمين أنابيب 1.5 مل microcentrifuge لوأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 3000 ز س.
   2. إزالة معظم طاف من كل أنبوب والجمع بين ما تبقى لتشكيل عينة 0.5 مل.
4. إيقاف ضخ حقنة وإزالة أنابيب مدخلات من رقاقة PDMS.
5. يدويا عكس ضخ حقنة لامتصاص فقاعة الهواء الصغيرة (1-2 سم في الطول) في كل أنبوب الإدخال. الانتقال إلى مص في العينة الخميرة. سوف فقاعة الهواء تظهر حدود عينة وتبين مقدار عينة تم استخلاصها.
   ملاحظة: تجنب امتصاص العينة إلى الحقنة.
6. إدراج أنبوب الإدخال مرة أخرى إلى رقاقة PDMS وإعادة تشغيل مضخة لتحميل الخلايا بسرعة 750 ميكرولتر / ساعة.
7. ترك حقنة لضخ لمدة 10 دقيقة لن ودراسة تطور الخلايا تحميل تحت المجهر. سوف تحميل الناجح خلايا فخ تحت أكثر من 60٪ من تعليق دعامة.
8. التبديل إلى حل التغذية وضبط السرعة إلى 400 ميكرولتر / ساعة لزراعة الخلايا.
9. مواقع المراقبة الاختيار للمجهر.
   ملاحظة: للحصول على قياسات عمر، واتخذت صورة مرة واحدة كل 15 دقيقة بواسطة المجهر الضوئي مع الهدف 40X. لتحليل مراسل فلوري، واتخذت صورة مرة واحدة كل 15 دقيقة بواسطة المجهر مضان مع الهدف النفط 60X.

النتائج

بعد التجارب، وأعمار من الخلايا والعديد من الظواهر الخلوية والجزيئية يمكن استخراجها من تسجيل الصور مرور الزمن. وبما أن هناك عددا من الميزات المختلفة التي يمكن استخلاصها من كل خلية، فإن الخطوة الأولى من التحليل هي لتعليم الخلايا والأحداث، بما في ذلك...

Discussion

يحتاج إلى أن تقدم طازجة الجهاز PDMS. وإلا فإن فقاعات الهواء الناجم عن إدخال الأنابيب في الجهاز يكون من الصعب إزالتها. الخطوة 3.4 هامة لتحسين كفاءة الخلايا تحميل من خلال التركيز الخلايا. لزيادة سرعة نقل التجربة، من 4 إلى 6 وحدات على الشريحة نفسها PDMS متصلة تستخدم مضخات تعمل ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3'' <111> silicon wafer	Addison Engineering
SU-8 2000 and 3000 Series	MicroChem
Sylgard® 184 Silicone Elastomer Kit	ellsworth	2065622	Include Sylgard® silicone elastomer base and curing agent
Petri dishes	VWR	391-1502
Harris Uni-core™ punch (I.D. 0.75 mm)	Sigma-Aldrich	29002513
24 mm x 40 mm SLIP-RITE® cover glass	Thermo Fisher Scientific	102440
3M Scotch Tape	ULINE	S-10223
VWR® Razor Blades	VWR	55411-050
Pure Ethanol, Koptec	VWR	64-17-5
Whoosh-Duster™	VWR	16650-027
5 mL BD Syringe (Luer-Lock™ Tip)	Becton, Dickinson and Company	309646
PTFE Standard Wall Tubing (100 ft, AWG Size: 22, Nominal ID: 0.028)	Component Supply Company	SWTT-22
Needle Assortment	Component Supply Company	NEKIT-1
Desiccator	HACH	2238300
Lab Oven	Fisher Scientific	13246516GAQ
Nikon TE2000 microscope with 40X and 60X objective	Nikon
Zeiss Axio Observer Z1 with 40X and 60X objective	Zeiss
Syringe Pump	Longerpump	TS-1B