Mikroakışkan Aygıtlar Kullanma Tek Budding Maya Hücreleri ömrü ve Hücresel fenotipleri Ölçmek için

Özet

Bu makalede, mikro akışkan cips üretim ve kullanım ömrü ve tek bir maya hücrelerinin hücresel fenotipleri ölçmek için mikro-akışkan deney kurulumu için optimize edilmiş bir protokol sunulur.

Özet

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

Giriş

mayayı tomurcuklanan araştırma yaşlanma güçlü bir model organizmadır. Bununla birlikte, mayada, geleneksel bir ömrü deneyi sadece emek yoğun değil, aynı zamanda, düşük ^{verimlilik, 1, 2} olan mikrodiseksiyon dayanır. yaşlandıkça Ayrıca, geleneksel mikrodiseksiyon yaklaşım bekar bir anne hücrelerde çeşitli hücresel ve moleküler özelliklerinin ayrıntılı bir görünümünü sağlamaz. Mikro-akışkan cihazlarının gelişimi maya ömrü ölçmek için hem de ana ^{hücreleri, 3, 4, 5, 6, 7, 8,} ömrü boyunca moleküler işaretçileri ve çeşitli hücre fenotipleri takip otomatik bir prosedür sağladı. Maya hücreleri, bir mikro-akışkan cihazın içine yüklendikten sonra, bunlar otomatik zaman tur kullanılarak mikroskop altında izlenebilenE görüntüleme. Işleme araçları görüntülenmesi sayesinde, çeşitli hücresel ve moleküler ^{fenotipleri, 3} elde edilebilir ^{6 kullanılarak} elde edilmesi zor veya imkansız olan birçok vb ömrü, boyut, floresan haberci, hücre morfolojisi, hücre döngüsü dinamiği, dahil olmak üzere, ^8, geleneksel mikrodiseksiyon yöntemi. Mikroakışkan cihazlar birkaç yıl önce ^{3, 4, 6, 7} başarılı gelişme beri maya yaşlanma araştırmalarında önem kazanmıştır. Çeşitli gruplar sonradan daha erken tasarımları ⁵ varyasyonları yayınlanan ve birçok maya laboratuarları kendi çalışma için microfluidic cihazlar kullanmışlardır.

üstel büyümeyi geçiren bir hücre kültüründe, gözlem için mevcuttur yaşlı anne hücre sayısı miniscu olduğunule. Bu nedenle, ömrü ölçümler için mikro-akışkan cihazının genel tasarım prensibi anne hücreleri korumak için ve kızı hücreleri kaldırmaktır. Bu tür tasarımlar maya asimetrik hücre bölünmesini uğrar gerçeği kullanır. Cihaz irade kapanı büyük anne hücrelerinde yapı ve izin küçük kızı hücreleri uzakta yıkanacak. Bu makalede açıklanan mikro-akışkan çip tuzak ana hücrelere yumuşak polidimetilsiloksan (PDMS) ped (dikey sarkık sütun) (Şekil 1) kullanır. Benzer bir tasarıma sahip cihazlar daha önce ^{3, 4, 6, 7} bildirilmiştir. Bu protokol microfluidic cihazlar ve zaman atlamalı görüntüleme deneyleri için optimize edilmiş basit bir hücre yükleme yöntemi üretmek için daha basit bir prosedür kullanır. mikroakışkan cihaz önemli parametrelerden biri tuzak ana hücrelere kullanılan PDMS pedleri genişliğidir. Bizim dihaz hayatları boyunca izlenebilir taze anne hücrelerinin önemli bir kısmı dahil olmak üzere her yastık altında daha anne hücreleri tutabilir geniş yastıkları kullanır. Hücreler nesiller veya tüm ömrü boyunca bir gözlem gereklidir için izlenmesi gereken zaman ömrü ölçümlerine ek olarak, bu protokol, tek bir hücre zaman atlamalı görüntüleme deneyleri için kullanışlıdır.

Protokol

1. Silikon Gofret Kalıp İmalat

NOT: Işık maskesi AutoCAD yazılımı ile tasarlandı ve ticari bir firma tarafından üretilmektedir. Bu tasarım farklı desenler (üç kat içerir Ek İçerik 1 ). Birinci, ikinci ve üçüncü tabakaların yükseklikleri sırasıyla yaklaşık 4 um, 10 um ve 50 um olan. Silikon gofret kalıp yumuşak litografi ^{9, 10} kullanılarak photomask oluşturuldu.

1. 10 dk su buharı buharlaşması için 200 ° C'da bir silikon gofret pişiriniz. Spin kat negatif fotorezist SU-8 silikon gofret üzerine.
   Not: Spin kat SU-8 3005, 30 ilk bir tabaka oluşturmak için 5000 rpm'de, SU-8 2010 3000 rpm'de 30 ikinci bir tabaka oluşturmak için, ve SU-8 3025 2,000 rpm'de 30 saniye üretmek için üçüncü tabaka.
2. t önce kaplanmış gofret Yumuşak fırındaDesen transferini diye. Hizalayın ve bir maske hizalama kullanarak "doğrudan temas" modunda gofret maruz.
   Not: Yumuşak fırında birinci tabaka, 95 ° C'de 2 dakika, ikinci tabaka 95 ° C 'de 3 dakika, ve üçüncü tabaka için 95 ° C' de 15 dakika süre ile çok ince bisküvi. 100 mJ / Birinci tabaka için ^cm2, 130 mJ / ikinci katman için ^cm2 ve 200 mJ / üçüncü katmanın için ^cm2'de maruz doz kullanın.
3. maruziyet sonrasında gofreti sonrası pişir ve SU-8 geliştirici kullanarak geliştirmek. _N2 silah ve sert fırında 30 dakika 200 ° C 'de çok ince bisküvi ile gofret kurutun.
   Not: silikon gofret kalıp model tarafı yukarı bakacak şekilde, File bandı kullanılarak 15 cm çaplı plastik Petri kabına sabitlenmiştir. Genellikle, çok sayıda mikro-akışkan kartları aynı zamanda imal edilmesini sağlar aynı kalıp, birçok aynı çip yapıları koydu. Her bir kalıp mikroakışkan fiş imal etmek için pek çok kez yeniden kullanılabilmektedir.

2. mikroakışkanÇip Fabrikasyon

1. Bir denge üzerinde temiz bir tartı tekne yerleştirin ve dengeyi daralayın. tartmak tekne içine PDMS tabanının 50 g dökün.
2. tartı teknesinde PDMS kürleme maddesi, 5 g ekleyin (ağırlık / PDMS tabanına 1:10 oranında ağırlık).
   NOT: Bu hacim, kalıp ile bir 15 cm çaplı bir Petri tabağına dayanır. Farklı büyüklükte bir petri kabı kullanarak, eğer reaktif miktarını ayarlayın.
3. PDMS tabanı ve tek kullanımlık bir pipet ile sertleştirme ajanı karıştırılır. tartım kabı kenarından başlayıp yavaş yavaş içeri doğru hareket eder. küçük kabarcıklar karışım boyunca meydana kadar birkaç dakika süreyle iyice karıştırılır; Karışımın tam PDMS polimerizasyonu için esastır.
4. yavaş Petri kabı içine dökün; Karışım, tam olarak silikon gofret kalıp kapsamalıdır.
5. 10 dakika PDMS karışımından tüm hava kabarcıklarını çıkarmak için bir vakum içinde Petri tabağına yerleştirin. kabarcıklar karışımın yüzeyinde kalır ise, onları dışarı üflemek için bir pipet kullanın.
6. silikon inkübeyaklaşık 2 saat süreyle 75 ° C'de bir fırın içinde PDMS ile gofret kalıbı.
7. Yavaşça gofret kalıp yapımı için herhangi bir zarar vermeden, silikon gofret kalıp kapalı polimerize PDMS tabaka soyun. Seçenek olarak ise, bir tek kenarlı endüstriyel jilet kullanılarak desen etrafında en az 5 mm aralık ile silikon gofret kalıp şirketinden PDMS kesme; hafifçe gofret kalıp kapalı PDMS katmanı soyun.
8. model tarafı yukarı bakacak şekilde tezgah PDMS tabaka yerleştirin. Dikkatle yapı hasarı önlemek için her bir çip kenarından uygun bir devamlılığının bir tek kenar endüstriyel jilet ile tek tek çip kesip.
9. yukarı bakacak şekilde model tarafı, her bir kanal tarafına düz bir şekilde giriş ve çıkış çevrelerine boyunca delikler bir zımba kalem (0.75 mm İD) kullanın.
   NOT: Bu delikler ortamın akışı için yol oluşturun. Nedenle, çevrelerinde geçmesi ve PDMS tabakasının içinden tüm yol yumruk için çok önemlidir. Emin oldelikten PDMS sütunları kaldırın.
10. deliğe tekrar delme kalem iğne sokarak her delinmiş delik edin. İğne herhangi bir blokaj bulunmamaktadır belirten diğer taraftan dışarı gelebilir emin olun. Desen yüzeye bant uygulama yavaşça toz parçacıklarını temizlemek için bant soyulabilir. bu adımı en az üç kez tekrarlayın. sterilizasyonu korumak için PDMS üzerinde viski bant temiz bir parça bırakın.
11. PDMS'den karşı tarafında bu işlemi tekrarlayın ve yanı üzerine bant son dilimini bırakın.
12. 0,13-0,17 mm kalınlığında, 24 mm x 30 mm kapak camı hazırlayın. yüzey sterilize etmek için toz sökücü ile cam üzerinde% 70 etanol püskürtme ve kurutma; buna ek olarak, cam otoklavlanmış su ile yıkandı ve toz sökücü ile kurutulabilir.
13. Plastik bir plakaya kapak cam ve PDMS aktarın. PDMS viski bandını çıkarın ve yukarı bakacak desen tarafını yerleştirin. Aktarım sırasında desen yüzeye sahip herhangi bir temastan kaçının.
14. Plazma makinesinde plastik levha yerleştirin. PDMS oksijen plazma işlemi, aşağıdaki işlem parametrelerine sahip hidrofilik yüzeyler oluşturmak için cam kapak geçerlidir: maruziyet, 75 s; Gaz sabitleme, 20 cc / dakika; basınç, 200; ve güç, 100 W
15. Dikkatle hidrofilik yüzeyler (plazma işlemi sırasında karşılaştığı yüzeyler), bağlantı, kapak camı üzerine PDMS yerleştirin. PDMS ve kapak cam arasında hava kabarcığı olmadığından emin olun.
16. en az 2 saat boyunca 75 ° C'de bir fırın içinde PDMS çip inkübe edin.
    Not: Eksik mikro sıvılaştırma deney sırasında mikroskop üzerine sızıntıya neden olabilir. Bu nedenle, biraz cımbız ile kenarlarından PDMS kaldırarak PDMS ve kapak camı arasındaki bağı kontrol edilmesi önemlidir. Yavaşça başarılı bağı belirten kapak camı ayırmak gerektiğini PDMS kaldırarak.

3. Deney hazırlığı

1. Tüp hazırlanması.
   1. % 70 etanol çözeltisi ayrıca PDMS çip hazırlanmasından önce 1 gün içinde giriş ve çıkış boruları daldırın.
   2. tüpleri yıkamak için otoklava su ile 5 ml şırınga doldurun. şırınga üzerindeki tüp takmayı ve su ile tüp ateş basması her tüp yıkayın.
   3. etanol kalıntısını temizlemek için, yıkama adımı en az 3 kez tekrarlayın.
2. emin yapı, tutarlı ve sağlam olmak için 10X objektif ile bir optik mikroskop altında PDMS kanalları inceleyin. File bandı kullanılarak mikroskop platformu üzerine PDMS çip stabilize.
   NOT: İlk defa cihaz yapma, özellikle yedekleme cips var olmasını sağlamak için adım 2'de tek seferde birden cips olun.
3. otoklava su ile 5 ml şırınga doldurun. bir şırınga pompası şırıngayı edin ve karşılık gelen giriş ve çıkış boruları yerleştirin. yaklaşık 10 dakika boyunca çip durulama 750 uL / ​​saat çamaşır hızını ayarlayın. şube kanallarında hava kabarcıklarıBu süre sırasında uzaklaşmış olmalıdır; Kalan kabarcıklar varsa, elle kabarcıklarını yok etmek için hızını ayarlamak.
4. Maya numune hazırlama.
   1. 3.000 x g'de 5 dakika boyunca iki adet 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine ml hazırlanan maya örneği _(OD600 0.6-0.8) devri 1 ve santrifüj.
   2. Her bir tüpten yüzer çoğunluğu çıkarın ve 0.5 ml örnek oluşturmak üzere geri kalan birleştirir.
5. şırınga pompası Pause ve PDMS, çip giriş tüpleri kaldırmak.
6. El ile her bir giriş tüpüne (uzunluk olarak 1 ila 2 cm) küçük bir hava kabarcığı emmek için şırınga pompası ters. maya örneğinde emmek geçin; hava kabarcığı örnek sınırını göstermek ve çizilmiştir ne kadar örnek gösterecektir.
   NOT: şırıngaya örnek emme kaçının.
7. Lütfen PDMS çip içine giriş tüpü yerleştirin ve 750 uL / ​​saat bir hızda hücrelerin yüklenmesi için pompayı yeniden.
8. 10 dakika üzerinde pompa şırınga bırakınburada n ve mikroskop altında hücre yükleme ilerlemesini incelemek; direği askıya fazla% 60 altında başarılı bir yükleme olacak tuzak hücreleri.
9. beslenme solüsyonu geçin ve hücre kültürü için 400 uL / ​​saat hızı ayarlayın.
10. mikroskop için seçin gözlem pozisyonlar.
    NOT: ömrü ölçümleri için, görüntüler 40x amacı ile bir optik mikroskop ile her 15 dakikada alındı. flüoresan raportör analizi için, görüntüler 60X petrol amacı ile bir floresan mikroskobu ile bir kez, her 15 dakikada bir alındı.

Sonuçlar

Deneylerden sonra, hücreler ve birçok hücresel ve moleküler fenotipleri yaşam süreleri kaydedilmiş zaman atlamalı görüntüleri elde edilebilir. her bir hücreden ekstre edilebilir, farklı bir dizi özellik olduğundan, analiz ilk adım, pozisyonları ve hücre sınırları ve izlenen çeşitli olayların zamanlama dahil olmak üzere hücreleri ve olayları, açıklama şekildedir tomurcuklanan olaylar olarak. Bu ek açıklamalar daha kolay gelecekte farklı özelliklere hücre...

Tartışmalar

PDMS cihazı taze yapılmış olması gerekmektedir. Aksi takdirde, cihaz içine tüpler sokulması neden olduğu hava kabarcıkları uzaklaştırmak için zor olacaktır. Adım 3.4 hücrelerini yoğunlaşarak hücre yükleme verimliliğini artırmak için önemlidir. Deneyin verimini arttırmak için aynı PDMS çip üzerinde 4 ila 6 modül bağımsız olarak çalışan pompalar genellikle eş zamanlı olarak 4 ila 6 farklı deneyler (farklı tür ya da ortam bileşimler) gerçekleştirmek için kullanılan bağlı.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3'' <111> silicon wafer	Addison Engineering
SU-8 2000 and 3000 Series	MicroChem
Sylgard® 184 Silicone Elastomer Kit	ellsworth	2065622	Include Sylgard® silicone elastomer base and curing agent
Petri dishes	VWR	391-1502
Harris Uni-core™ punch (I.D. 0.75 mm)	Sigma-Aldrich	29002513
24 mm x 40 mm SLIP-RITE® cover glass	Thermo Fisher Scientific	102440
3M Scotch Tape	ULINE	S-10223
VWR® Razor Blades	VWR	55411-050
Pure Ethanol, Koptec	VWR	64-17-5
Whoosh-Duster™	VWR	16650-027
5 mL BD Syringe (Luer-Lock™ Tip)	Becton, Dickinson and Company	309646
PTFE Standard Wall Tubing (100 ft, AWG Size: 22, Nominal ID: 0.028)	Component Supply Company	SWTT-22
Needle Assortment	Component Supply Company	NEKIT-1
Desiccator	HACH	2238300
Lab Oven	Fisher Scientific	13246516GAQ
Nikon TE2000 microscope with 40X and 60X objective	Nikon
Zeiss Axio Observer Z1 with 40X and 60X objective	Zeiss
Syringe Pump	Longerpump	TS-1B