Использование микрофлюидальных устройств для измерения срок службы и сотовых фенотипов в одиночных дрожжевых клетках почкования

Резюме

Данная статья представляет собой протокол, оптимизированный для производства чипов микрофлюидальных и настроек микрофлюидальных экспериментов для измерения продолжительности жизни и клеточных фенотипов одиночных дрожжевых клеток.

Аннотация

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

Введение

Баддинги дрожжей является мощной моделью организмом в исследовании старения. Однако традиционный анализ продолжительности жизни дрожжей зависит от микродиссекции, который является не только трудоемкий , но и низкой пропускной способностью ^{1, 2.} Кроме того, традиционная микродиссекция подход не дает детальное представление о различных клеточных и молекулярных особенностях в отдельных материнские клетках, поскольку они стареют. Развитие микрофлюидальных устройств позволило автоматизированную процедуру для измерения дрожжей срока службы, а также , чтобы следовать молекулярным маркерам и различные клеточные фенотипам в течение всего срока службы материнских клеток ^{3, 4, 5, 6, 7, 8.} После того, как клетки дрожжей загружаются в микрожидкое устройство, они могут быть отслежены под микроскопом с помощью автоматических временных кругове изображений. С помощью визуализации инструменты обработки, различные клеточные и молекулярные фенотипы могут быть извлечены ^{3, 6, 8,} в том числе срока службы, размера, флуоресцентный репортера, клеточной морфологии, динамики клеточного цикла, и т.д., многие из которых трудно или невозможно получить , используя традиционный метод микродиссекции. Микрофлюидальные устройства приобрели широкую известность в научных исследованиях дрожжей старения , так как их успешного развития несколько лет назад ^{3, 4, 6, 7.} Несколько группы впоследствии опубликованы на вариации предыдущих конструкций ^5, и многие дрожжевые лаборатории использовали микрожидкостные устройства для их изучения.

В культуре клеток, подвергающейся экспоненциальный рост, число пожилых материнских клеток, которые доступны для наблюдения miniscuле. Таким образом, общий принцип конструкции микрожидкостных устройства для измерения продолжительности жизни является сохранением материнских клеток и удалить дочерние клетки. Одним из таких конструкций используют тот факт, что дрожжи подвергается асимметричному делению клеток. Структуры в устройстве поглотит крупные материнские клетки и позволяют более мелкие дочерние клетки должны быть смыты. Микрожидкостный чип описан в этой статье используется мягкая полидиметилсилоксан (PDMS) подкладки (вертикальные столбцы Pensile) для улавливания материнских клеток (рис 1). Устройства аналогичной конструкции были ранее сообщалось ^{3, 4, 6, 7.} Этот протокол использует более простую процедуру для изготовления микрожидкостных устройств и простого метода клеточной загрузки, который оптимизирован для экспериментов визуализации покадровых. Одним из ключевых параметров в микрофлюидальном устройстве ширин PDMS прокладок, используемых для ловушки материнских клеток. Наш device использует более широкие подушечки, которые могут держать больше маточных клеток в каждой площадке, в том числе значительной части свежих материнских клеток, которые можно отслеживать на протяжении всей их жизни. В дополнении к измерениям продолжительности жизни, этот протокол является полезным для экспериментов визуализации одной клетки покадровых когда клетки должны быть отслежены в течение многих поколений, или когда наблюдение в течение всего срока службы необходимо.

протокол

1. Кремний вафельные Mold Fabrication

Примечание: фотошаблон разработан с программным обеспечением AutoCAD и производством коммерческой компанией. Эта конструкция состоит из трех слоев различных шаблонов ( Дополнительный File 1 ). Высоты первого, второго, и третьего слоев около 4 мкм, 10 мкм и 50 мкм, соответственно. Кремниевая пластина пресс - форма была создана из фотошаблона , используя мягкую литографию ^{9, 10.}

1. Испечь кремниевую пластину при 200 ° С в течение 10 мин для испарения водяного пара. Спин покрытие негативного фоторезиста СУ-8 на кремниевой пластине.
   Примечание: Спин покрытие СУ-8 3005 при 5000 оборотах в минуту в течение 30 с, чтобы генерировать первый слой, СУ-8 2010 при 3000 оборотах в минуту в течение 30 с, чтобы создать второй слой, и SU-8 3025 при 2000 оборотах в минуту в течение 30 секунд, чтобы генерировать третий слой.
2. Мягкая выпекать пластины с нанесенным покрытием до тон перенос рисунка. Выравнивание и подвергать пластины в режиме «прямой контакт» с использованием маски выравнивателя.
   Примечание: Soft-выпекать пластины в течение 2 мин при 95 ° С в течение первого слоя, 3 мин при 95 ° C для второго слоя и 15 мин при 95 ° С в течение третьего слоя. Используйте дозу облучения при 100 мДж / см ² для первого слоя, 130 мДж / см ² для второго слоя и 200 мДж / см ² для третьего слоя.
3. После экспозиции, после выпекать пластины и развивать его с помощью SU-8 проявителя. Сушат пластины с использованием N ₂ пистолета и трудно выпекать пластины при 200 ° С в течение 30 мин.
   Примечание: кремниевая пластина форма прикреплена к 15 см диаметр пластиковой чашки Петри с помощью скотча, с боковым узором лицевой стороны вверх. Как правило, мы помещаем несколько структур идентичны чип на одной и той же пресс-форме, что позволяет несколько микрофлюидные чипы, которые будут изготовлены в то же самое время. Каждая форма может быть повторно использована много раз, чтобы изготовить микрофлюидальных чипы.

2. микрожидкостныхЧип Fabrication

1. Поместите чистый вес лодку на весах и тарирование. Залить 50 г PDMS основания в взвешивании лодки.
2. Добавляют 5 г PDMS отвердителя на взвешивании лодки (вес / вес соотношении 1:10 к основанию PDMS).
   Примечание: Этот объем основан на 15 см диаметра чашки Петри с формой. Регулировка количества реагента при использовании чашки Петри другого размера.
3. Перемешать основание PDMS и отвердитель с одноразовой пипеткой. Начните с краями взвешенной лодочки и медленно двигаться внутрь. тщательно перемешать в течение нескольких минут, пока маленькие пузырьки не образуются по всей смеси; тщательное перемешивание имеет важное значение для полимеризации PDMS.
4. Поток смесь медленно в чашку Петри; смесь должна полностью покрыть кремниевую пластину пресс-форму.
5. Поместите чашку Петри в вакууме в течение 10 мин, чтобы удалить все пузырьки воздуха из смеси PDMS. Если пузырьки остаются на поверхности смеси, с помощью пипетки, чтобы взорвать их.
6. Инкубируйте кремнийпластины пресс-формы с PDMS в печи при 75 ° С в течение приблизительно 2 ч.
7. Аккуратно очистить слой полимеризованных PDMS отходящих от кремниевой пластины пресс-формы, избегая любого повреждения конструкции пластин пресс-формы. В качестве альтернативы, вырезать PDMS непосредственно из кремниевой пластины пресс-формы с минимальным запасом 5 мм вокруг рисунка с использованием одного края промышленного лезвия бритвы; осторожно очистить слой PDMS выключения вафельной формы.
8. Поместите слой PDMS на скамье с боковым узором лицевой стороны вверх. Тщательно вырезать отдельный чип с одним краем промышленной лезвием бритвы, сохраняя достаточный запас прочности от края каждого одного чипа, чтобы избежать повреждения конструкции.
9. С бокового шаблоном лицевой стороны вверх, использовать пуансон ручку (0,75 мм ID) для пробивки отверстий прямо вниз через входные и выходные круги на каждой стороне каналов.
   Примечание: Эти отверстия создают пути для потока среды. Поэтому крайне важно, чтобы пройти через круги и удар весь путь через слой PDMS. Убедись вудалить столбцы PDMS из отверстия.
10. Проверьте каждую пробитое отверстие, вставив удар пера иглу снова в отверстие. Убедитесь, что игла может выйти с другой стороны, указывая, что нет закупорки. Нанесите ленту на поверхность шаблона, затем аккуратно снимите пленку для очистки частиц пыли. Повторите этот шаг, по крайней мере в три раза. Оставьте чистый кусок скотча на PDMS для поддержания стерилизации.
11. Повторите эту процедуру на противоположной стороне PDMS и оставить последнюю часть ленты на а.
12. Подготовка 24 мм х 30 мм покровного стекла с толщиной 0.13-0.17 мм. Спрей 70% этанола на стекле и насухо для удаления пыли, чтобы стерилизовать поверхность; Кроме того, стекло может быть промыто автоклавной водой и сушит для удаления пыли.
13. Передача покровного стекла и PDMS к пластиковой пластине. Снимите липкую ленту с PDMS и положите шаблон лицевой стороной вверх. Избегать контакта с поверхностью шаблона во время передачи.
14. Поместите пластиковую пластину в плазменной машине. Применение плазменной обработки кислорода к PDMS и покровное стекло для визуализации поверхности гидрофильные со следующими параметрами работы: экспозиция, 75 с; Стабилизация газа, 20 см / мин; давление, 200; и мощность, 100 Вт
15. Осторожно поместите PDMS на покровное стекло, соединяя обе гидрофильные поверхности (поверхности, которые, с которыми сталкиваются в ходе плазменной обработки). Убедитесь, что нет пузырьков воздуха между PDMS и покровным стеклом.
16. Инкубируйте чип PDMS в сушильном шкафу при 75 ° С в течение по меньшей мере 2 ч.
    Примечание: Дефектные микрофлюидики могут привести к утечке жидкости в микроскоп во время эксперимента. Поэтому важно, чтобы проверить связь между PDMS и покровного стекла, слегка поднимая PDMS от краев с помощью пинцета. Осторожно поднимая PDMS не должен отделить его от покровного стекла, что указывает на успешную связь.

3. Подготовка к эксперименту

Подготовка труб.
1. Submerge входные и выходные трубы в 70% растворе этанола отдельно за 1 день до получения чипа ПДМС.
2. Заполните 5-мл шприц с автоклавной водой, чтобы промыть трубы. Промыть каждую пробирку, подключив трубку на шприц и промывки трубки с водой.
3. Повторите стадии промывки по крайней мере, 3 раза, чтобы очистить остаток этанола.
1. Проверьте PDMS каналов под оптическим микроскопом с объективом 10Х, чтобы убедиться, что структура соответствует и неповрежденными. Стабилизировать чип PDMS на платформу микроскопа с помощью скотча.
   Примечание: Сделайте несколько фишек за один раз в шаге 2, чтобы гарантировать, что есть резервные чипы, особенно если сделать устройство в первый раз.
2. Заполните 5-мл шприц с автоклавной водой. Безопасный шприц в шприцевой насос и вставить соответствующие входные и выходные трубы. Установите скорость стирки до 750 мкл / ч для промывки чипа в течение приблизительно 10 мин. Воздушные пузырьки на ветке каналовдолжны быть смыты в течение этого периода; если есть остальные пузырьки, вручную регулировать скорость удаления пузырьков.
3. Дрожжи подготовки образца.
   1. Передача 1 мл подготовленного образца дрожжей (OD ₆₀₀ 0,6-0,8) на две 1,5-мл микроцентрифужных пробирках и центрифугируют в течение 5 мин при 3000 х г.
   2. Удалить большинство супернатанта из каждой пробирки и объединяют остаток с образованием пробы 0,5 мл.
4. Пауза шприцевой насос и удалите входные трубки от чипа PDMS.
5. Вручную обратный шприцевой насос, чтобы сосать небольшой воздушный пузырь (от 1 до 2 см в длину) в каждой входной трубы. Перемещение по сосать в образце дрожжей; воздушный пузырек покажет границу образца и указать, сколько образец был нарисован.
   Примечание: Во избежание всасывания образца в шприц.
6. Вставьте входной трубки обратно в чип PDMS и перезапустить насос для загрузки ячейки со скоростью 750 мкл / ч.
7. Оставьте шприц насоса в течение 10 мин вп и исследовать прогрессию клеточного загрузки под микроскопом; успешная загрузка воля клетка ловушки под более чем 60% приостановить столп.
8. Переключение в питательный раствор и регулировать скорость до 400 мкл / ч для культивирования клеток.
9. Выбор позиции наблюдения за микроскопом.
   Примечание: Для измерения продолжительности жизни, снимки были сделаны один раз каждую 15 мин с помощью оптического микроскопа с 40x объективом. Для флуоресцентного анализа репортера, изображения были взяты один раз каждые 15 мин с помощью флуоресцентного микроскопа с целью 60X нефти.

Результаты

После экспериментов продолжительность жизнь этих клеток и многих клеточных и молекулярных фенотипов может быть извлечена из записанных изображений покадровых. Поскольку существует целый ряд различных функций, которые могут быть извлечены из каждой ячейки, первый ш...

Обсуждение

Устройство ПДМСА должно быть свежеприготовленным. В противном случае, пузырьки воздуха, вызванные вставки трубы в устройство будет трудно удалить. Шаг 3.4 имеет важное значение для повышения эффективности нагрузки сотовой ячейки путем концентрации клеток. Для того, чтобы увеличить про...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
3'' <111> silicon wafer	Addison Engineering
SU-8 2000 and 3000 Series	MicroChem
Sylgard® 184 Silicone Elastomer Kit	ellsworth	2065622	Include Sylgard® silicone elastomer base and curing agent
Petri dishes	VWR	391-1502
Harris Uni-core™ punch (I.D. 0.75 mm)	Sigma-Aldrich	29002513
24 mm x 40 mm SLIP-RITE® cover glass	Thermo Fisher Scientific	102440
3M Scotch Tape	ULINE	S-10223
VWR® Razor Blades	VWR	55411-050
Pure Ethanol, Koptec	VWR	64-17-5
Whoosh-Duster™	VWR	16650-027
5 mL BD Syringe (Luer-Lock™ Tip)	Becton, Dickinson and Company	309646
PTFE Standard Wall Tubing (100 ft, AWG Size: 22, Nominal ID: 0.028)	Component Supply Company	SWTT-22
Needle Assortment	Component Supply Company	NEKIT-1
Desiccator	HACH	2238300
Lab Oven	Fisher Scientific	13246516GAQ
Nikon TE2000 microscope with 40X and 60X objective	Nikon
Zeiss Axio Observer Z1 with 40X and 60X objective	Zeiss
Syringe Pump	Longerpump	TS-1B