JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

Abstract

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs).

We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

Introduction

والقلب هو أول جهاز وظيفي لتطوير في الجنين 1 و 2. بالتزامن مع الدورة الدموية، فإنه يوفر الأوكسجين والمغذيات، وآلية التخلص من النفايات خلال التنمية. بعد ثلاثة أسابيع من الإخصاب، وقلب الإنسان يدق للمرة الأولى، ويتم الحفاظ على التنظيم الصحيح من قبل العضلية (CMS). وبالتالي فإن خسارة لا رجعة فيها هذه الخلايا المتخصصة هي القضية الأساسية الكامنة وراء فشل القلب التدريجي. في حين أن بعض الكائنات الحية مثل الزرد والقيطم لديها القدرة على التجدد القلب، الكبار قلب الثدييات أكثر محدودية 3 و 5 و 6. وهكذا، وبالنظر إلى وظيفة حرجة من القلب، فإنه ليس من المدهش أن أمراض القلب هي السبب الرئيسي للوفاة في العالم، وهو ما يمثل 600،000 حالة وفاة في الولايات المتحدة وحدها 7. الrefore، العلاجات المستندة إلى الخلايا لإصلاح أو استبدال عضلة القلب جرح بكفاءة ذات الفائدة السريرية كبيرة.

وأظهرت الدراسة المنوية من ياماناكا وزملاؤه 8 هذا التعبير القسري لأربعة عوامل النسخ غير كافية لتحويل الخلايا الليفية متباينة تماما الخلايا الجذعية المحفزة. ومع ذلك، فإن قدرة مكون للأورام من جميع الاستراتيجيات الخلايا الجذعية المحفزة مصدر قلق بالغ في استخدامها لأغراض علاجية. هذا الدافع المجال العلمي للبحث عن طرق بديلة لتحورها الخلايا مع تجنب مرحلة المحفزة. في الآونة الأخيرة، وقد أظهرت عدة مجموعات جدوى هذه الاستراتيجية من خلال عرض التحويل المباشر من الخلايا الليفية الماوس لالناجم عن خلايا تشبه cardiomyocyte (iCLMs) مع التعبير خارج الرحم من عوامل النسخ Gata4، Mef2c، Tbx5، وفي وقت لاحق، Hand2 (GMT وGHMT ، على التوالي) 9، 10. Furthermore، نفس الاستراتيجية لا يمكن أن يؤديها في الجسم الحي وفي الأنسجة المستمدة الإنسان 9 و 11 و 12. وقد أبرزت الدراسات الحديثة عوامل إضافية أو مسارات الإشارات التي يمكن التضمين لزيادة تحسين كفاءة إعادة برمجة القلب 13 و 14 و 15. أخذت معا، هذه الدراسات توضح إمكانات transdifferentiation موجهة لعلاجات التجدد. ومع ذلك، فإن انخفاض كفاءة CM برمجة، الآليات الجزيئية غير معروفة، واستنساخ يتعارض بسبب الاختلافات المنهجية 16، وطبيعة متجانسة من iCLMs تظل دون معالجة.

من أجل تقييم مباشرة iCLM عدم التجانس، قمنا بتصميم فحص وحيدة الخلية منفصلة وقوية للتعرف على تطوير قسيم عضلي والقلب specificatio النسبالخصائص اللازمة العضلية وظيفية اثنين ن. هناك على الأقل ثلاثة أنواع رئيسية من CM في قلب كما هو محدد حسب الموقع والخصائص الكهربائية فريدة من نوعها: الأذيني (AM)، البطين (VM) وجهاز تنظيم ضربات القلب (بعد الظهر) 17، 18، 19، 20. في مزيج مدبرة، فهي تسمح ضخ السليم من الدم. أثناء إصابة القلب، قد تتأثر واحد أو كل أنواع فرعية، وسيكون نوع من العلاج بالخلايا تحتاج إلى أن تعالج على أساس كل حالة على حدة. حاليا، تركز معظم الاستراتيجيات على الجيل العام للالعضلية، في حين يجري القيام به القليل من العمل لدراسة الآليات الجزيئية التي تنظم مواصفات النوع الفرعي.

تفاصيل الدراسة التالية كيفية قياس صحيح ساركومير منظمة تنظيما جيدا وتحديد مجموعة متنوعة من أنواع فرعية cardiomyocyte. باستخدام جهاز تنظيم ضربات القلب (PM) -specific الماوس المراسل، ونحن قادرون على تطبيق طنهج mmunocytochemical للتمييز الناجم عن myocytes مثل الأذيني (IAM)، الناجم عن myocytes مثل البطين (IVM)، والتي يسببها myocytes PM تشبه (مراقبي الشرطة الدوليين) 21. وبناء على ملاحظاتنا، فقط الخلايا التي تظهر منظمة قسيم عضلي قادرة على الضرب من تلقاء أنفسهم. هذه المنصة إعادة برمجة فريدة من نوعها تسمح لتقييم دور بعض المعلمات في منظمة قسيم عضلي، مواصفات النوع الفرعي، وكفاءة إعادة برمجة سم في قرار وحيد الخلية.

Protocol

وقد وافق جميع الإجراءات التجريبية التي تنطوي الممارسات الحيوانية من لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في مركز ساوث ويسترن الطبي UT.

1. عزل Hcn4-GFP E12.5 الفأر الجنينية الخلايا الليفية (MEFS)

  1. إنشاء التزاوج توقيتها بين متماثل الذكور Hcn4-GFP و CD-1 الإناث.
  2. التضحية أنثى الحوامل في E12.5 من القتل الرحيم ثاني أكسيد الكربون والتفكك عنق الرحم لاحق.
    1. إزالة قرون الرحم مع ملقط تشريح كما هو موضح سابقا 22، 23، ووضعها في طبق بيتري على الجليد مع المياه المالحة الفوسفات-1X (PBS) دون الكالسيوم 2+ أو المغنيسيوم 2+.
  3. تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في نسيج الثقافة هود باستخدام تقنية معقمة.
    1. إزالة الأجنة من الرحم والسلوي الكيس باستخدام مقص وملقط تشريح. إبقاء المشيمة المرفقة لمعالجة أفضل. Pregnaالإقليم الشمالي CD-1 الإناث عادة تلد ما بين 10 و 14 الجراء.
    2. باستخدام ملقط التشريح، واتخاذ الأجنة المعزولة وبسرعة شطف لهم مرتين في 70٪ (ت / ت) ETOH.
      ملاحظة: يجب أن يكون يغسل سريع للحد من موت الخلايا.
    3. إزالة الرأس والأطراف، والذيل، والأعضاء الداخلية، بما في ذلك القلب من الأجنة المعزولة.
    4. وضع الأنسجة المتبقية في صحن 10 سم مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X واللحم المفروم ناعما باستخدام شفرة حلاقة معقمة لحوالي 1 ملم 3 الحجم.
    5. نقل الأنسجة المفروم في أنبوب مخروطي 50 مل مع برنامج تلفزيوني.
    6. تدور في 300 x ج لمدة 3 دقائق. نضح بعناية زائدة برنامج تلفزيوني.
    7. إضافة 1 مل من معقم 0.25٪ التربسين-EDTA في جنين. احتضان الخلايا في 37 ° C حمام الماء لمدة 15 دقيقة. بلطف مزيج أنبوب كل 4 دقائق. الإفراط في هضم الأنسجة من شأنه أن يخفض بشكل كبير من العائد.
    8. خليط الخلية دوامة في سرعة قصوى (3200 دورة في الدقيقة) لمدة 4 ق.
    9. إضافة 2 مل من وسائل الاعلام الليفية في جنين وتخلط. مرشح رhrough خلية مصفاة 100 ميكرون باستخدام ماصة للمساعدة الخلايا من خلال مصفاة. الرجوع إلى الجدول رقم 1 لصياغة جميع وسائل اللاحقة.
    10. تدور في 300 x ج لمدة 4 دقائق. نضح بعناية طاف.
    11. إضافة 10 مل من وسائل الاعلام الليفية جديدة في 3 أجنة ويسحن 6-10 مرات.
    12. لوحة الخلايا في 1 15 سم صحن زراعة الأنسجة لكل 3 أجنة أعد. الثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 الحاضنة.
    13. بعد الحضانة بين عشية وضحاها، واستبدال وسائل الإعلام مع 30 مل جديدة من وسائل الإعلام في لوحة. وضع الخلايا مرة أخرى في حاضنة بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: التحقق من وجود Hcn4-GFP + تلوث الخلية تحت المجهر الفلورسنت. وينبغي أن تكون ثقافة GFP - وتصبح فقط GFP + على إعادة برمجة.
    14. في اليوم التالي، وخلايا الحصاد مع 3 مل من جديد قبل تحسنت 0.25٪ التربسين-EDTA. العد وتجميد الخلايا. عادة، وتجميد الخلايا في 3 × 10 6 خلايا لكل مليلتر. وyie المتوقعوينبغي أن تكون دينار 3 × 10 6 خلايا في جنين.

2. الارتجاعي إنتاج وإعادة برمجة

تحذير: البروتوكول التالي يتطلب إنتاج ومعالجة الفيروسات المعدية. نفذ الخطوات التالية في خزانة السلامة البيولوجية المستوى 2 تحت BSL-2 المبادئ التوجيهية وتقنية معقمة. استخدام التبييض 10٪ للتخلص من جميع المواد المعرضة للالفيروسات القهقرية.

  1. إنتاج الفيروس الارتجاعي وإعداد MEFS
    ملاحظة: بروتوكول التالي هو لإنتاج فيروسات في 6 لوحات جيدة والعدوى MEF في 24 لوحات جيدة. لغيرها من الأشكال، يرجى الرجوع إلى الجدول 2. ومطلي MEFS في يوم -1، لذلك سوف تحتاج توقيت ليتم التنسيق على نحو ملائم لكل تجربة (راجع القسم 2.3 والشكل 2).
    1. الحفاظ على خلايا حسب توصيات الشركة الصانعة بلات-E (PE). لفترة وجيزة، والخلايا ثقافة PE في DMEM تستكمل مع FBS 10٪، 1 ميكروغرام / مل puromyCIN، 10 ميكروغرام / مل blasticidin، البنسلين، والستربتومايسين. خلايا مرور 4: 1 كل يومين عندما تصل الثقافة 70-90٪ confluency.
    2. اليوم -2: قبل يوم واحد ترنسفكأيشن، البذور خلايا بلات-E في 1 × 10 6 خلايا / جيد على طبق من 6 جيدا في وسائل الإعلام ترنسفكأيشن. وينبغي أن تكون خلايا 70-80٪ متموجة في وقت ترنسفكأيشن.
  2. ترنسفكأيشن باستخدام عامل ترنسفكأيشن التجاري.
    ملاحظة: يجب أن يكون الكواشف التجارية في درجة حرارة الغرفة (RT) قبل ترنسفكأيشن. لترنسفكأيشن الحمض النووي، وإضافة كل فيروسات DNA البلازميد بشكل فردي (G، H، M، و T) لتشكيل كوكتيل GHMT 9.
    1. اليوم -1: في أنبوب البوليسترين 15 مل المخروطية، مزيج 60 ميكرولتر من تخفيض وسائل الاعلام المصل مع 6 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن في رد الفعل لشكل لوحة 6-جيدا. احتضان الخليط لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: منذ كاشف ترنسفكأيشن المستخدمة هنا بربط البلاستيك، لDD مباشرة إلى وسائل الإعلام المصل خفض لتجنب أي انخفاض في كفاءة ترنسفكأيشن.
    2. إضافة ما مجموعه 2 ميكروغرام من GHMT كوكتيل في رد الفعل والاستفادة بلطف لأنها مزيج. لا الدوامة. احتضان رد فعل لمدة 15 دقيقة في RT.
    3. يضاف خليط من الخطوة 2.2.3 لخلايا PE بطريقة حكيمة انخفاض.
    4. احتضان الخلايا بلات-E transfected بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 الحاضنة. تسجيل وقت ترنسفكأيشن.
  3. البذر من Hcn4-GFP الخلايا الليفية الماوس الجنينية.
    1. 1 ساعة قبل الطلاء MEFS، وإعداد لوحة 24-جيدا لمناعية.
      1. إضافة فبرونيكتين ساترة 12 ملم لكل بئر.
      2. آبار معطف مع 300 ميكرولتر من محلول الكولاجين البقري (على سبيل المثال، SureCoat) واحتضان في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
      3. نضح حل طلاء مباشرة قبل الطلاء MEF.
    2. ذوبان الجليد قارورة المجمدة من Hcn4-GFP MEFS وغسل X1 مع fibrobl قبل حرارةوسائل الإعلام أست في 500 x ج لمدة 5 دقائق.
    3. تحديد بقاء الخلية باستخدام استبعاد التريبان الأزرق أو الأصباغ مماثلة. احسب عدد خلايا قابلة للحياة لكل مليلتر من الثقافة باستخدام الصيغة التالية:
      خلايا قابلة للحياة٪ = [1.00 - (عدد الخلايا الزرقاء / عدد مجموع الخلايا)] × 100
      1. حساب العدد الكلي للخلايا قابلة للحياة باستخدام الصيغة التالية:
        خلايا قابلة للحياة =٪ خلايا قابلة للحياة س عامل تخفيف س س 10000 الحجم الكلي للتعليق الخلية
    4. البذور 3 × 10 4 خلايا لكل بئر على 24 لوحة جيدا مع معدة مسبقا البقري الكولاجين حل فبرونيكتين ساترة.
  4. تنبيغ وإعادة برمجة MEFS
    ملاحظة: وفقا لمذكرات الشركة المصنعة، حافظت بشكل صحيح خلايا بلات-E تنتج من عيار متوسط 1 × 10 7 وحدات عدوى / مل. على الرغم من أن لا يقاس عيار مباشرة لكل تجربة، ودائما تضمن السيطرة GFP كبديل للكفاءة العدوى.التعبير عالية GFP وكثافة (GFP +> 95٪) يرتبط عادة مع نجاح الجيل بوساطة GHMT من iCLMs.
    1. اليوم 0: 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن، تصفية المتوسطة فيروسات PE من خلال 0.45 ميكرون، حجم المسام خالية من التوتر السطحي السليلوز فلتر خلات ونقل إلى أنبوب مخروطي 15 مل. إضافة polybrene إلى تركيز النهائي من 8 ميكروغرام / مل. بعناية تجديد الخلايا مع 2 مل من المتوسط ​​ترنسفكأيشن جديدة.
      ملاحظة: خلايا تنفصل بسهولة من لوحة إذا تم تغيير وسائل الإعلام بسرعة كبيرة.
    2. نضح في المتوسط ​​من MEFS مثقف وإضافة المتوسطة فيروسات جمعت حديثا. يجب أن تسفر عن 1.7 مل من وسائل الاعلام في بئر من لوحة 6 جيدا. إضافة ~ 800 ميكرولتر لكل بئر من 24 لوحة جيدا. العودة لوحة MEF إلى الحاضنة واحتضان بين عشية وضحاها.
    3. يوم 1: كرر الخطوات من 2.4.1 و 2.4.2. تجاهل الخلايا بعد جمع فيروس 2 الثانية. العودة MEFS المصاب إلى الحاضنة والسماح لهم بقية ليلة وضحاها.
    4. يوم 2: 48 ساعة بعد الاستقراء، ونضح الخلية مكيفة وسائل الإعلام وغسل X1 مع برنامج تلفزيوني 1X. إضافة 500 ميكرولتر قبل تحسنت وسائل الإعلام iCLM لكل بئر من 24 لوحة جيدا.
    5. استبدال وسائل الإعلام iCLM كل 2-3 أيام. لوحة العملية بعد 14 يوما تحريض الفيروسي ل(ICC) تحليل مناعية من إعادة برمجة القلب.

3. المناعية من MEFS برمجتها

  1. 14 يوما بعد الاستقراء، ونضح بعناية وسائل الإعلام.
  2. شطف كل جيدا مع 300 ميكرولتر من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X. نضح الحل الزائد.
  3. إصلاح الخلايا مع 250 ميكرولتر من بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) حل لكل بئر من 24 لوحة جيدا. احتضان 15 دقيقة في RT.
    ملاحظة: الثابتة الخلايا يمكن تخزينها في برنامج تلفزيوني في 4 درجة مئوية لمدة 1-2 أسابيع قبل تلطيخ.
  4. خلايا Permeabilize عن طريق غسل الآبار X3 مع 300 ميكرولتر 0.1٪ في برنامج تلفزيوني-TritonX 100 (PBST). احتضان 5 دقائق على RT بين يغسل. نضح الحل الزائد بعد غسل الماضي.
  5. كتلة ل10دقيقة في RT مع 1X العازلة كتلة العالمي في 300 ميكرولتر / جيد.
  6. إعداد عازلة تلطيخ (ICC): إضافة 1: 1 من برنامج تلفزيوني 1X 1X والعالمي عازلة تمنع. تمييع الأجسام المضادة الأولية في المخزن تلطيخ المحكمة الجنائية الدولية واحتضان الأجسام المضادة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. الرجوع إلى قسم المادي للالتخفيفات الموصى بها.
    1. وصمة عار زوج واحد من الشرائح مع الماوس α-actinin، αGFP الدجاج، والأرانب NPPA الإدارة المتكاملة للآفات وتحديد الهوية والوصول.
    2. وصمة عار زوج واحد من الشرائح مع الماوس α-actinin، αGFP الدجاج، وMyl2 أرنب الإدارة المتكاملة للآفات والإدارة المتكاملة للناقلات تحديد الهوية.
  7. في اليوم التالي، وغسل الآبار X3 مع 300 ميكرولتر 0.1٪ PBST. احتضان 5 دقائق على RT بين يغسل. نضح الحل الزائد بعد غسل الماضي.
  8. إعداد التخفيفات الأجسام المضادة الثانوية في المخزن تلطيخ للمحكمة الجنائية الدولية. الرجوع إلى قسم المادي للالتخفيفات الموصى بها. احتضان الأجسام المضادة الثانوية 1 ساعة عند RT، محمية من الضوء.
    1. وصمة عار كافة الشرائح مع antibodie الثانوية التاليةالصورة: الفأر اليكسا-555، الدجاج اليكسا-488، وأرنب اليكسا-647.
  9. غسل الآبار X3 مع 300 ميكرولتر 0.1٪ PBST. احتضان 5 دقائق على RT بين يغسل. احم من الضوء.
  10. إضافة 2.4 ميكرولتر من وسائل الإعلام المتصاعدة التي تحتوي 1.5 ميكروغرام / مل من 4، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي) إلى شريحة المجهر والزجاج. إزالة بعناية ساترة من البئر من 24 لوحة جيدا، وإزالة حل الزائد، ونقل إلى شريحة زجاجية مع وسائل الإعلام في تصاعد مستمر. اضغط بلطف ساترة لإزالة حجم الزائد والهواء.
  11. الشرائح ختم بطلاء الأظافر المفضل أو تسرب من البلاستيك. متجر شنت الشرائح في 4 درجات مئوية محمية من الضوء.

4. تحديد الأنواع الفرعية للقلب عن طريق الميكروسكوب متحد البؤر

ملاحظة: للحصول على التصوير، والمجهر متحد البؤر مجهزة على الأقل 2 للكشف عن الفلورسنت قادرة على الكشف الطيفي في 405، 488، 555، و 639 نانومتر موجات هو ضروري من أجل تحديد مراقبي الشرطة الدوليين، علماء المسلمين، وIVMS. ايماجخلايا البريد باستخدام الهدف بخطة امزيغ 20X / 0.75 أو أفضل منه. باستخدام برمجيات تحليل الصور الشركة المصنعة، ومسح الصور التكبير يمكن تحقيق 40X النفط صور ذات جودة الغمر.

  1. مكتبة الصور: تأخذ الصور 8 بت مع دابي، اليكسا-488، اليكسا-555، واليكسا-647 قنوات (الفصل). بكسل يسكن الوقت من 6 ق، 1024 حجم الإطار، خطوة خط في 2، والمتوسط ​​من 2 يكفي لصور عالية الدقة.
  2. لكل شريحة، تبدأ من حافة واحدة وبدء المسح الضوئي صعودا وهبوطا في القناة الحمراء الفلورسنت (الفصل) لα-actinin + قسيم عضلي + الخلايا (راجع الشكل 3 والشكل 5A على سبيل المثال). التصدعات قسيم عضلي هي أسهل لتحديد بصريا في الطول الموجي 555 نانومتر.
    1. مرة واحدة وقد تم التعرف على-actinin α + خلية + قسيم عضلي، والتحول إلى الفصل الأخضر. والحفاظ على مذكرة إذا كانت إيجابية (IPM). التبديل إلى جهاز الكمبيوتر لتقييم بعيدة الحمراء 647 الفصل. (IAM أو IVM).
      ملاحظة: الخلايا التي هي يتم تصنيفها مراقبي الشرطة الدوليين - α-actinin + / قسيم عضلي + / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2. سيتبين GFP التعبير في جميع أنحاء الخلية (الشكل 4A).
    2. الشرائح وصمة عار مع α-actinin (الماوس Alexa555)، Hcn4-GFP (الدجاجة Alexa488)، NPPA (أرنب Alexa647)، ودابي. الخلايا التي هي ألفا-actinin + / قسيم عضلي + / Hnc4-GFP - / + NPPA هي IAM. ستظهر NPPA تلطيخ محيط بالنواة والمنقط (الشكل 4B).
    3. الشرائح وصمة عار مع α-actinin (الماوس Alexa555)، Hcn4-GFP (الدجاجة Alexa488)، Myl2 (أرنب Alexa647). خلايا إيجابية لα-actinin + / قسيم عضلي + / Hnc4-GFP - / + Myl2 هي IVMS. سوف Myl2 تلطيخ تظهر على شكل المخططة على طول خيوط قسيم عضلي. بسبب الاختلافات في نوعية تلطيخ وZ-الطائرة، التصدعات قد لا تكون دائما مرئية بسهولة (الشكل 4C).

= "jove_title"> 5. تحديد الكميات

ملاحظة: من أجل تقييم العدد الفعلي للMEFS يحتمل برمجتها، هي المصنفة 2 الآبار من 24 لوحة جيدا بالتوازي مع الآبار التجريبية ويتم حصادها بعد يوم واحد الطلاء. ثم يتم تحديد العدد الكلي للخلايا مطلي عن طريق حساب متوسط ​​البئرين. هذا يصبح مجموع الخلايا الفعلية مطلي (aTotal).

  1. قسيم عضلي +
    1. تفقد البصر كل خلية في ساترة لالسليم α-actinin + / + قسيم عضلي (لوحات اليمين الشكل 3) وسجل (الشكل 5B-ط).
    2. جدولة عدد من α-actinin + / + قسيم عضلي على كل ساترة والقسمة على مجموع الخلايا الفعلية مطلي (aTotal) (الشكل 5B-ج). على سبيل المثال، إذا aTotal = 12500 الخلايا، و 100 خلايا تم ألفا Actinin + / + قسيم عضلي ذلك الحين، تم برمجتها 0.8٪ من MEFS مطلي. معدلسوف reprograming التجربة تسفر عن 1٪ α-Actinin + / + قسيم عضلي الخلايا (الشكل 5C).
  2. نوع فرعي +
    ملاحظة: للحصول على الخطوات التالية، انظر الشكل 5B / C لسير عمل iCLM الكمي التمثيلي. لفترة وجيزة، لكل قسيم عضلي + خلية، جدولة إذا أنها فريدة من نوعها لأي نوع فرعي (الشكل 5B-ط). احسب٪ النوع الفرعي (الشكل 5B-ج) من خلال قسمة عدد من سلالة + الخلايا على مدى متوسط قسيم عضلي + خلايا × 100 (الشكل 5B-ط). لحساب المطلقة كفاءة٪ سلالة (الشكل 5B-IV)، تقسيم فرعي + خلية عدد من الشكل 5B-ط من العدد الكلي للخلايا المصنف × 100 (الشكل 5B-ب).
    1. لكل من α-actinin خلايا + / + قسيم عضلي، وتقييم إذا كانت GFP +، NPPA +، أو Myl2 +.
    2. جدولة عدد من α-actinin + / قسيم عضلي + / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2 - actinin + / قسيم عضلي + / Hnc4-GFP - / NPPA +، وα-actinin + / قسيم عضلي + / Hnc4-GFP - / Myl2 + الخلايا (الشكل 5B-ط).
    3. لحساب النسبة المئوية من كل سلالة، وتقسيم عدد من نوع فرعي + الخلايا عن طريق عدد من α-actinin + / + قسيم عضلي الخلايا في ذلك بشكل جيد ومضاعفة 100. GHMT يولد مراقبي الشرطة الدوليين، علماء المسلمين، وIVMS نسب متساوية تقريبا (الشكل 5B-ج).
    4. لحساب العدد المطلق للسلالة + الخلايا، تقسيم العدد الإجمالي للسلالة + خلايا لحالة تجريبية من aTotal وضرب من قبل 100 (الشكل 5B-ب). على تمثيل المتوسط ​​مراقبي الشرطة الدوليين 0.3٪ من إجمالي عدد السكان الخلية المصابة، علماء المسلمين بنسبة 0.3٪، وIVMS 0.25٪ (الشكل 5B-IV).

النتائج

الاستفادة من الفأرة مراسل PM محددة، وضعنا استراتيجية المناعية متعددة لتحديد myocytes الذاتية المتنوعة كما هو مبين في الشكل 1. باتباع الخطوات برمجة هو مبين في الشكل 2، تحريض CMS-سلالة معينة يمكن أن يتم الكشف في وقت مبكر من يوم 4 21?...

Discussion

وتقدم هذه الدراسة استراتيجية لإعادة برمجة مباشرة لتحويل MEFS إلى مجموعة متنوعة من أنواع فرعية في القلب عن طريق التعبير بوساطة الارتجاعي من النسخ القلب العوامل Gata4، Mef2c، Tbx5، وHand2 (GHMT). باستخدام نهج المناعية تعدد الإرسال في توليفة مع الماوس مراسل PM محددة، ونحن قادرون على ?...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

A.F.-P. was supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship under Grant No.2015165336. N.V.M was supported by grants from the NIH (HL094699), Burroughs Wellcome Fund (1009838), and the March of Dimes (#5-FY14-203). We acknowledge Young-Jae Nam, Christina Lubczyk, and Minoti Bhakta for their important contributions to protocol development and data analysis. We also thank John Shelton for valuable technical input and members of the Munshi lab for scientific discussion.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMSigmaD5796Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media
Medium 199Thermo Fisher Scientific11150059Component of iCLM media
Fetal bovine serrum (FBS)SigmaF2442Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media
Insulin-Transferrin-Selenium GThermo Fisher Scientific41400-045Component of iCLM media
MEM vitamin solutionThermo Fisher Scientific11120-052Component of iCLM media
MEM amino acidsThermo Fisher Scientific1601149Component of iCLM media
Non-Essential amino acidsThermo Fisher Scientific11140-050Component of iCLM media
Antibiotic-AntimycoticsThermo Fisher Scientific15240062Component of iCLM media
B-27 supplementThermo Fisher Scientific17504044Component of iCLM media
Heat-Inactivated Horse SerumThermo Fisher Scientific26050-088Component of iCLM media
NaPyruvateThermo Fisher Scientific11360-70Component of iCLM media
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific1514022Component of Plat-E media and fibroblast media
Puromycin Thermo Fisher ScientificA11139-03Component of Plat-E media
Blasticidin  Gemini Bio-Products400-128PComponent of Plat-E media
GlutamaxThermo Fisher Scientific35050-061Component of Fibroblast media
Confocal laser scanning LSM700ZeissFor confocal analysis
FuGENE 6 transfection ReagentPromegaE2692Transfection reagent 
Opti-MEM Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific31985-070Transfection reagent 
PolybreneMilliporeTR-1003-GInduction reagent. Use at a final concentration of 8 μM/mL
Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, EcotropicCellBiolabsRV-101Retroviral pacaking cell line
Trypsin 0.25% EDTAThermo Fisher ScientificFor MEFs and Plat-E dissociation
Mouse anti α-Actinin (Clone EA-53)SigmaA7811Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Chicken anti-GFP IgYThermo Fisher ScientificA10262Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Rabbit Pab anti-NPPA AbgentAP8534AAntibody for confocal analysis. Use at 1:400
Rabbit Pab anti Myl2 IgG ProteinTech10906-1-APAntibody for confocal analysis. Use at 1:200
Vectashield solution with DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Vector LabsH-1500Dye for confocal analysis
Superfrost Plus Microscope slidesThermo Fisher Scientific12-550-1525 x 75 x 1.0 mm
BioCoat Fibronectin 12 mm coverslipsNeuVitro CorpGG-12-1.5Coverslips for confocal analysis
100 μm cell strainerThermo Fisher Scientific08-771-19
0.45 μm Syringes filters SFCA 25MMThermo Fisher Scientific09-740-106For virus filtration
6 mL SyringesCovidien8881516937For virus filtration
Goat anti-Chicken IgY (H&L) A488AbcamAB150169Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Donkey anti-rabbit A647 IgG(H+L) Thermo Fisher ScientificA31573Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Goat anti-mouse IgG(H+L) A555Thermo Fisher ScientificA21422Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Triton X-100Sigma93443-100mlFor cell permeabilization 
Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS)SigmaD8537
Power Block 10x Universal Blocking reagentThermo Fisher ScientificNC9495720Dilute to 1x in H2O
16% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA)Electro Microscopy Sciences 15710Use at 4% diluted in dH2O
6 cm  platesOlympus25-260
6-well platesGenesee Scientific25-105
24-well platesGenesee Scientific25-107
10 cm Tissue culture dishesCorning4239
15 cm  Tissue culture dishesThermo Fisher Scientific5442
15 mL Conical tubesCorning4308
50 mL Conical tubesCorning4249
0.4% Trypan blue solutionSigmaT8154For viability
Ethyl Alcohol 200 proofThermo Fisher Scientific7005
BleachThermo Fisher Scientific6009

References

  1. Sissman, N. J. Developmental landmarks in cardiac morphogenesis: comparative chronology. Am J Cardiol. 25 (2), 141-148 (1970).
  2. Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6 (11), 826-835 (2005).
  3. Ali, S. R., et al. Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (24), 8850-8855 (2014).
  4. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  5. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
  6. Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6 (239), 239rv231 (2014).
  7. Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
  8. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  9. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
  10. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
  11. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
  12. Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1 (3), 235-247 (2013).
  13. Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (38), 11864-11869 (2015).
  14. Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
  15. Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nat Commun. 6, 8243 (2015).
  16. Miki, K., Yoshida, Y., Yamanaka, S. Making steady progress on direct cardiac reprogramming toward clinical application. Circ Res. 113 (1), 13-15 (2013).
  17. Atkinson, A., et al. Anatomical and molecular mapping of the left and right ventricular His-Purkinje conduction networks. J Mol Cell Cardiol. 51 (5), 689-701 (2011).
  18. Bootman, M. D., Smyrnias, I., Thul, R., Coombes, S., Roderick, H. L. Atrial cardiomyocyte calcium signalling. Biochim Biophys Acta. 1813 (5), 922-934 (2011).
  19. Miquerol, L., Beyer, S., Kelly, R. G. Establishment of the mouse ventricular conduction system. Cardiovasc Res. 91 (2), 232-242 (2011).
  20. Später, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
  21. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
  22. Conner, D. A. . Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).
  23. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
  24. Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).
  25. Ichim, C. V., Wells, R. A. Generation of high-titer viral preparations by concentration using successive rounds of ultracentrifugation. J Transl Med. 9, 137 (2011).
  26. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
  27. Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nat Commun. 5, 5807 (2014).
  28. Muraoka, N., Ieda, M. Direct reprogramming of fibroblasts into myocytes to reverse fibrosis. Annu Rev Physiol. 76, 21-37 (2014).
  29. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E., Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. . Retroviruses. , (1997).
  30. Bass, G. T., et al. Automated image analysis identifies signaling pathways regulating distinct signatures of cardiac myocyte hypertrophy. J Mol Cell Cardiol. 52 (5), 923-930 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

121 cardiomyocyte Gata4 Hand2 Mef2c Tbx5 Hcn4 NPPA Myl2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved