Évaluation des cardiomyocytes types suivants Reprogrammation Transcription Factor médiée par des fibroblastes embryonnaires de souris

Résumé

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

Résumé

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs).

We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

Introduction

Le cœur est le premier organe fonctionnel à se développer dans l'embryon ^{1, 2.} En conjonction avec le système circulatoire, il fournit de l'oxygène, des nutriments, et un mécanisme d'élimination des déchets au cours du développement. Trois semaines après la fécondation, le cœur humain bat pour la première fois et sa réglementation appropriée est maintenue par cardiomyocytes (SGC). La perte irréversible de ces cellules spécialisées est donc la question fondamentale qui sous-tend l'insuffisance cardiaque progressive. Tandis que certains organismes , tels que le poisson zèbre et Xenopus ont un potentiel de régénération cardiaque, le cœur de mammifère adulte est plus limitée ^{3, 5, 6.} Ainsi, compte tenu de la fonction critique du cœur, il est pas étonnant que la maladie cardiaque est la principale cause de décès dans le monde, ce qui représente 600.000 décès aux Etats-Unis seulement ^7. lerefore, les thérapies à base de cellules pour réparer ou remplacer efficacement le myocarde blessés sont d'un grand intérêt clinique.

L'étude séminal Yamanaka et ses collègues ⁸ montré que l' expression forcée de quatre facteurs de transcription est suffisante pour transformer des cellules de fibroblastes complètement différenciées des cellules souches pluripotentes. Cependant, la capacité tumorigène de toutes les stratégies de cellules souches pluripotentes a été une préoccupation critique dans leur utilisation à des fins thérapeutiques. Ceci a motivé le domaine scientifique à la recherche de méthodes alternatives pour transdifférencier cellules tout en évitant une étape pluripotentes. Récemment, plusieurs groupes ont montré la faisabilité de cette stratégie en affichant la conversion directe de fibroblastes de souris aux cellules analogues à des cardiomyocytes induites (iCLMs) avec l'expression ectopique de facteurs de transcription Gata4, MEF2C, Tbx5, et plus tard, Hand2 (GMT et GHMT , respectivement) , ^{9, 10.} Furthermore, la même stratégie peut être réalisée in vivo et dans des tissus d' origine humaine ^{9, 11, 12.} Des études récentes ont mis en évidence des facteurs supplémentaires ou les voies de signalisation qui peuvent être modulées pour améliorer encore l' efficacité de reprogrammation cardiaque ^{13, 14, 15.} Pris ensemble, ces études démontrent le potentiel de transdifférenciation dirigé pour les thérapies régénératrices. Cependant, la faible efficacité de CM reprogrammation, les mécanismes moléculaires inconnus, reproductibilité incompatibles en raison des différences méthodologiques ^16, et de la nature hétérogène de iCLMs restent sans réponse.

Afin d'évaluer directement ICLM hétérogénéité, nous avons conçu un essai à cellule unique discrète et robuste pour l'identification du développement des sarcomères et cardiaque lignée specification-deux caractéristiques nécessaires de cardiomyocytes fonctionnels. Il y a au moins trois grands types de CM dans le coeur tel que défini par leur emplacement et les propriétés électriques uniques: auriculaire (AM), ventriculaire (VM) et pacemaker (PM) ^{17, 18, 19, 20.} Dans une combinaison orchestrée, ils permettent le bon pompage du sang. Pendant les blessures du cœur, un ou tous les sous-types peuvent être affectés, et le type de thérapie cellulaire devraient être abordées au cas par cas. À l'heure actuelle, la plupart des stratégies axées sur la production globale de cardiomyocytes, alors que peu de travaux sont en cours pour étudier les mécanismes moléculaires qui régule la spécification de sous-type.

L'étude suivante détaille comment quantifier correctement sarcomères bien organisés et identifier un ensemble diversifié de sous-types de cardiomyocytes. L'utilisation d'un pacemaker (PM) souris rapporteur spécifique de, nous sommes en mesure d'appliquer un iapproche mmunocytochemical de distinguer les myocytes atriaux induites comme (IAM), les myocytes ventriculaires induites comme (IVM), et myocytes PM-like induits (IPMS) ^21. Sur la base de nos observations, seules les cellules qui présentent l'organisation sarcomère sont capables de battre spontanée. Cette plate-forme de reprogrammation unique permet d'évaluer le rôle de certains paramètres dans l'organisation du sarcomère, la spécification du sous-type, et l'efficacité de CM reprogrammation à seule cellule de résolution.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales impliquant des pratiques animales ont été approuvées par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle à l'UT Southwestern Medical Center.

1. Isolement de HCN4-GFP E12.5 souris embryonnaires fibroblaste (MEF)

1. Mettre en place des accouplements chronométrés entre homozygotes mâles HCN4-GFP et CD-1 femelles.
2. Sacrifiez femme enceinte à E12.5 par le dioxyde de carbone et l'euthanasie dislocation cervicale postérieure.
   1. Retirer cornes utérines avec des pinces à dissection comme décrit précédemment ^{22, 23,} et les placer dans une boîte de Pétri sur de la glace avec une solution saline 1x tampon phosphate (PBS) sans Ca ²⁺ ou Mg ^2+.
3. Effectuez toutes les étapes ultérieures de la hotte de culture tissulaire en utilisant une technique stérile.
   1. Retirer les embryons de l'utérus et sac amniotique à l'aide de ciseaux et de pinces à disséquer. Gardez le placenta attaché pour une meilleure manipulation. pregnant CD-1 femelles donnent généralement naissance à entre 10 et 14 chiots.
   2. Utilisation de pinces à disséquer, prendre les embryons isolés et rapidement les rincer deux fois dans 70% (v / v) EtOH.
      NOTE: Les lavages doivent être rapides pour réduire au minimum la mort cellulaire.
   3. Retirez la tête, les membres, la queue et les organes internes, y compris le cœur des embryons isolés.
   4. Placer le tissu restant dans une boîte de 10 cm avec 1 ml de 1 x PBS et finement hachée à l' aide d' une lame de rasoir stérile à environ 1 ^mm3 en taille.
   5. Transfert tissu haché dans un tube de 50 ml conique avec du PBS.
   6. Spin à 300 xg pendant 3 min. Aspirer soigneusement l'excès de PBS.
   7. Ajouter 1 ml de 0,25% de trypsine-EDTA stérile par embryon. Incuber les cellules dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 15 min. Mélanger délicatement le tube toutes les 4 min. Over-digestion du tissu va réduire considérablement le rendement.
   8. mélange de cellules de Vortex à vitesse maximale (3.200 rpm) pendant 4 s.
   9. Ajouter 2 mL de milieu de fibroblaste par embryon et mélanger. Filtre trâce un tamis cellulaire de 100 um à l'aide d'une pipette pour aider les cellules à travers le tamis. Reportez - vous au tableau 1 pour la formulation de tous les supports suivants.
   10. Spin à 300 xg pendant 4 min. Aspirer soigneusement surnageant.
   11. Ajouter 10 ml de milieu de fibroblastes frais par 3 embryons et triturer 6-10 fois.
   12. Plaque les cellules de 1 à 15 cm boîte de culture de tissus pour tous les 3 embryons préparés. Nuit de la culture dans un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur.
   13. Après une nuit d'incubation, remplacer les médias avec des produits frais 30 ml de milieu par plaque. Placez les cellules de nouveau dans l'incubateur pendant une nuit.
       NOTE: Vérifier HCN4-GFP ⁺ contamination des cellules sous un microscope à fluorescence. La culture doit être GFP ^- et ne deviennent GFP ⁺ sur la reprogrammation.
   14. Le lendemain, les cellules de récolte avec 3 mL de frais préchauffé 0,25% de trypsine-EDTA. Comptez et congeler les cellules. En règle générale, le gel des cellules à 3 x 10 ⁶ cellules par ml. La yie attendueld devrait être de 3 x 10 ⁶ cellules par embryon.

2. Rétrovirus Production et Reprogrammation

Attention: Le protocole suivant nécessite la production et la manipulation des rétrovirus infectieux. Effectuez les étapes suivantes dans une armoire de biosécurité de niveau 2 en vertu de BSL-2 des lignes directrices et une technique stérile. Utilisez l'eau de Javel à 10% de disposer de tous les matériaux exposés à des retrovirus.

1. La production de retrovirus et de préparation MEFs
   NOTE: Le protocole suivant est pour la production rétrovirale dans des plaques 6 puits et de l'infection MEF dans des plaques à 24 puits. Pour les autres formats, se reporter au tableau 2. MEFs sont étalées à jour -1, de sorte que le calendrier devra être coordonné de manière appropriée pour chaque expérience ( Se reporter à la section 2.3 et à la figure 2).
   1. Maintenir les cellules selon les recommandations du fabricant Plat-E (PE). En bref, la culture de cellules PE dans du DMEM supplémenté avec 10% de FBS, 1 pg / ml puromycin, 10 pg / ml de blasticidine, de la pénicilline et de la streptomycine. cellules Passage 1: 4 tous les deux jours lorsque la culture atteint 70-90% de confluence.
   2. Jour -2: Le jour avant la transfection, les cellules ensemencer Plat-E à 1 x 10 ⁶ cellules / puits sur une plaque de 6 puits dans les milieux de transfection. Les cellules doivent être de 70 à 80% de confluence au moment de la transfection.
2. Transfection en utilisant un agent de transfection commercial.
   NOTE: Les réactifs commerciaux doivent être à température ambiante (TA) avant la transfection. Pour la transfection d'ADN, ajouter chaque ADN plasmidique retroviral individuellement (G, H, M et T) pour former un cocktail de GHMT ^9.
   1. Jour -1: Dans un tube en polystyrène de 15 ml conique, mélanger 60 ul de milieu de sérum réduit avec 6 ul de réactif de transfection par réaction d'un format de plaque à 6 puits. Laisser incuber le mélange pendant 5 min à température ambiante.
      NOTE: Étant donné que le réactif de transfection utilisé ici se lie aux plastiques, undd directement au milieu de sérum réduit afin d'éviter toute diminution de l'efficacité de la transfection.
   2. Ajouter un total de 2 pg de GHMT cocktail par réaction et appuyez doucement pour mélanger. Ne pas vortex. Laisser incuber la réaction pendant 15 min à température ambiante.
   3. Ajouter le mélange de l'étape 2.2.3 pour les cellules PE d'une manière sage de chute.
   4. Incuber les cellules transfectées Plat-E pendant une nuit dans un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur. Noter le temps de transfection.
3. Ensemencement des fibroblastes embryonnaires HCN4-GFP souris.
   1. 1 h avant l'étalement MEF, préparer une plaque de 24 puits pour immunocytochimie.
      1. Ajouter un fibronectine lamelle de 12 mm par puits.
      2. Revêtir les puits avec 300 ul d' une solution de collagène bovin (par exemple, surecoat) et incuber dans un incubateur à 37 ° C pendant 1 h.
      3. Solution de revêtement Aspirer juste avant le placage MEF.
   2. Décongeler une fiole congelée de HCN4-GFP MEFs et laver x1 avec fibrobl préchaufféemédias ast à 500 xg pendant 5 min.
   3. Déterminer la viabilité des cellules en utilisant l'exclusion du bleu trypan ou des colorants similaires. Calculer le nombre de cellules viables par millilitre de culture à l'aide de la formule suivante:
      de cellules viables% = [1,00 - (Nombre de cellules bleues / Nombre de cellules totales)] x 100
      1. Calculer le nombre total de cellules viables en utilisant la formule suivante:
         des cellules viables de cellules viables =% x facteur de dilution x 10 000 x volume total de la suspension cellulaire
   4. Seed 3 x 10 ⁴ cellules par puits sur une plaque de 24 puits avec préalablement préparé collagène bovin solution fibronectine lamelle.
4. Transduction et la reprogrammation de MEFs
   NOTE: Selon les notes du fabricant, bien entretenu cellules Plat-E produisent un titre moyen de 1 x 10 ⁷ unités d'infection / mL. Bien que le titre ne soit pas directement mesurée pour chaque expérience, un témoin GFP est toujours inclus en tant que substitut pour l'efficacité de l'infection.Une expression élevée de la GFP et de l' intensité (GFP ^+> 95%) corrélé avec succès de la production d'GHMT à médiation iCLMs.
   1. Jour 0: 24 h post-transfection, filtrer le milieu rétroviral de PE par un pm à pores de taille cellulose filtre d'acétate 0,45 sans tensioactif et transférer dans un tube de 15 ml conique. Ajouter du polybrène à une concentration finale de 8 pg / ml. reconstituer soigneusement les cellules avec 2 ml de milieu de transfection frais.
      NOTE: Les cellules se détachent facilement de la plaque si le support est changé trop rapidement.
   2. Aspirer le milieu des MEFs cultivées et ajoutez le moyen rétroviral fraîchement prélevé; il devrait donner 1,7 mL de milieu par puits d'une plaque à 6 puits. Ajouter ~ 800 ul par puits d'une plaque de 24 puits. Retour plaque MEF à l'incubateur et incuber pendant la nuit.
   3. Jour 1: Répétez les étapes 2.4.1 et 2.4.2. Jeter les cellules après la collection de virus 2 ^ème. Retour MEFs infectés à l'incubateur et laisser reposer toute la nuit.
   4. Jour 2: 48 h après l'induction, aspirez la cellule conditionné médias et lavage x1 avec PBS 1x. Ajouter 500 ul préchauffé médias ICLM par puits d'une plaque de 24 puits.
   5. Remplacer les médias ICLM tous les 2 - 3 jours. Plaque de 14 jours après l'induction virale pour immunocytochimie (ICC) analyse de reprogrammation cardiaque.

3. Immunomarquage de MEFs reprogrammée

1. 14 jours après l'induction, aspirer soigneusement les médias.
2. Rincer chaque puits avec 300 pi de glace-froid 1x PBS. Aspirer l'excès de solution.
3. Fixer les cellules avec 250 pi de paraformaldehyde (PFA) solution à 4% par puits d'une plaque de 24 puits. Incuber 15 min à température ambiante.
   NOTE: les cellules fixes peuvent être stockés dans du PBS à 4 ° C pendant 1 - 2 semaines avant la coloration.
4. cellules perméabiliser par puits de lavage x3 avec 300 ul de 0,1% PBS-Triton 100 (PBST). Incuber 5 min à température ambiante entre les lavages. Aspirer l'excès de solution après le dernier lavage.
5. Bloc 10min à température ambiante avec 1x tampon Bloc universel à 300 pl / puits.
6. Préparer (CPI) tampon de coloration: Ajouter 1: 1 de PBS 1x et 1x Universal tampon de blocage. Diluer anticorps primaires dans un tampon de coloration de la CPI et incuber des anticorps nuit à 4 ° C. Reportez-vous à la section matériel pour les dilutions recommandées.
   1. Colorer une paire de diapositives avec α-actinine souris, αGFP de poulet et de lapin NPPA pour iPM et identification iAM.
   2. Colorer une paire de diapositives avec la souris α-actinine, αGFP de poulet et de lapin Myl2 pour LID et GIV identification.
7. Le lendemain, lavez les puits x3 avec 300 ul de 0,1% PBST. Incuber 5 min à température ambiante entre les lavages. Aspirer l'excès de solution après le dernier lavage.
8. Préparer les dilutions d'anticorps secondaires dans un tampon ICC de coloration. Reportez-vous à la section matériel pour les dilutions recommandées. Incuber Anticorps secondaires 1 h à température ambiante, à l'abri de la lumière.
   1. Colorer toutes les diapositives avec le antibodie secondaire suivants: la souris Alexa-555, poulet Alexa-488, et le lapin Alexa-647.
9. Laver les puits x3 avec 300 ul de 0,1% PBST. Incuber 5 min à température ambiante entre les lavages. Protéger de la lumière.
10. Ajouter 2,4 ul de milieu de montage contenant 1,5 pg / ml de 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) sur une lame de microscope en verre. Retirez délicatement la lamelle du puits de la plaque de 24 puits, enlever l'excès de solution, et transfert à la lame de verre avec les médias de montage. Appuyez doucement sur la lamelle pour enlever un excès de volume et de l'air.
11. diapositives Seal avec vernis à ongles préféré ou d'étanchéité en plastique. Magasin diapositives montées à 4 ° C à l'abri de la lumière.

4. Identification des cardiaques sous-types utilisant la microscopie confocale

NOTE: Pour l'imagerie, un microscope confocal équipé d'au moins 2 détecteurs fluorescents capables de détection spectrale à 405, 488, 555, et 639 longueurs d'onde nm est nécessaire afin d'identifier IPMS, Iams et MVI. Imagcellules e en utilisant un objectif Plan-Apochromat 20X / 0,75 ou mieux. En utilisant le logiciel d'analyse d'image du fabricant, la numérisation des images de zoom peut atteindre 40X-huile des images de qualité d'immersion.

1. Bibliothèque d'images: prendre des images de 8 bits avec DAPI, Alexa-488, Alexa-555 et Alexa-647 canaux (ch.). Pixel temps de séjour de 6 s, 1024 taille de l'image, l'étape de ligne à 2, et une moyenne de 2 est suffisante pour des images haute résolution.
2. Pour chaque diapositive, démarrer à partir d' un bord et commencer à numériser haut et en bas dans le canal rouge fluorescent (ch.) Pour α-actinine ⁺ Sarcomère cellules ⁺ (Reportez - vous à la figure 3 et la figure 5A pour des exemples). striures Sarcomère sont plus faciles à identifier visuellement la longueur d'onde de 555 nm.
   1. Une fois qu'une α-actinine ⁺ cellule Sarcomère ⁺ a été identifié, passer à la ch vert. et de garder la note si elle est positive (LAI). Basculer vers l'ordinateur pour évaluer le bien-rouge 647 ch. (IAM ou iVM).
      NOTE: Les cellules qui sontα-actinine ⁺ / Sarcomère ⁺ / Hnc4-GFP ⁺ / NPPA ^- / Myl2 ^- sont désignés comme IPMS. L' expression de GFP sera vu dans toute la cellule (figure 4A).
   2. diapositives Stain avec α-actinine (souris-Alexa555), HCN4-GFP (poulet-Alexa488), NPPA (lapin-Alexa647) et DAPI. Les cellules qui sont α-actinine ⁺ / Sarcomère ⁺ / Hnc4-GFP ^- / NPPA ⁺ sont iAM. NPPA coloration apparaît périnucléaire et punctiformes (figure 4B).
   3. diapositives Stain avec α-actinine (souris-Alexa555), HCN4-GFP (poulet-Alexa488), Myl2 (lapin-Alexa647). Les cellules positives pour α-actinine ⁺ / Sarcomère ⁺ / Hnc4-GFP ^- / Myl2 ⁺ sont MVI. Myl2 coloration présentera une forme striée le long du filament de sarcomère. En raison des variations dans la qualité de la coloration et le plan Z, striations ne peuvent pas toujours être facilement visibles (figure 4C).

5. Quantification

NOTE: Afin d'évaluer le nombre réel de MEFs potentiellement reprogrammées, 2 puits d'une plaque de 24 puits sont ensemencées en parallèle aux puits expérimentaux et sont récoltés un jour après placage. Le nombre total de cellules ensemencées est alors déterminée en calculant la moyenne des deux puits. Cela devient les cellules totales réelles plaquées (Un total).

1. Sarcomère ⁺
   1. Inspecter visuellement chaque cellule sur une lamelle pour le bon α-actinine ⁺ / Sarcomère ⁺ (panneaux de droite Figure 3) et enregistrer (figure 5B-i).
   2. Tabulez le nombre total d'α-actinine ⁺ / Sarcomère ⁺ sur chaque lamelle et diviser par les cellules totales réelles plaquées ( Un total) (figure 5B-iii). Par exemple, si = 12.500 cellules Un total et 100 cellules ont été a-Actinin ⁺ / Sarcomère ⁺ puis, 0,8% des MEFs plaqués ont été reprogrammée. Une moyenneexpérience reprogrammant donnera 1% a-actinine ⁺ / Sarcomère ⁺ cellules (Figure 5C).
2. Sous ⁺
   NOTE: Pour les étapes suivantes, reportez - vous à la figure 5B / C pour une ICLM quantification représentant workflow. En bref, pour chaque sarcomère ⁺ cellule, tabuler si elle est unique pour les deux sous - type (figure 5B-i). Calculer% Subtype (figure 5B-iii) en divisant le nombre de sous - type ⁺ cellules sur sarcomère moyenne ⁺ cellules x 100 (figure 5B-i). Pour calculer l'efficacité absolue% du sous - type (figure 5B-iv), diviser le nombre de sous - type ⁺ cellule à partir de la figure 5B-i par le nombre total de cellules ensemencées x 100 (figure 5B-ii).
   1. Pour chacun des α-actinine cellules ⁺ / Sarcomère ^+, d' évaluer si elles sont GFP ^+, NPPA ⁺ ou Myl2 ^+.
   2. Tabulez nombre total d'α-actinine ⁺ / Sarcomère ⁺ / Hnc4-GFP ⁺ / NPPA ^- / Myl2 ^-, actinin ⁺ / Sarcomère ⁺ / Hnc4-GFP ^- / NPPA ⁺ et α-actinine ⁺ / Sarcomère ⁺ / Hnc4-GFP ^- / ⁺ Myl2 cellules (figure _5B-I).
   3. Pour calculer le pourcentage de chaque sous - type, il faut diviser le nombre de sous - type ⁺ cellules par le nombre total d'α-actinine ⁺ / Sarcomère ⁺ cellules dans ce puits et multiplier par 100. GHMT génère IPMS, Iams et iVMS ratios à peu près égales (Figure 5B-iii).
   4. Pour calculer le nombre absolu de sous - type ⁺ cellules, diviser le nombre total de sous - type ⁺ cellules pour la condition expérimentale par Un total et multiplier par 100 (figure 5B-ii). Sur IPMS moyenne représentent 0,3% de la population totale de cellules infectées, Iams 0,3%, etiVMS 0,25% (figure 5B-iv).

Résultats

Profitant de la souris reporter PM-spécifique, nous avons développé une stratégie d'immunocoloration multiplex pour identifier divers myocytes endogènes comme le montre la figure 1. Après les étapes de reprogrammation de la figure 2, l' induction de CMs spécifiques du sous-type peut être détectée dès le jour 4 ^21, mais à un faible taux. Au jour 14, l'expérience peut être arrêté et évalué pour l' ...

Discussion

La présente étude fournit une stratégie directe reprogrammation pour la conversion de MEFs dans un ensemble diversifié de sous-types cardiaques via l'expression de retrovirus de la transcription cardiaque Facteurs Gata4, MEF2C, Tbx5 et Hand2 (GHMT). En utilisant une approche d'immunocoloration multiplex en combinaison avec une souris reporter PM-spécifique, nous sommes en mesure d'identifier iAM, IVM, et IPMS à la résolution d'une seule cellule. Un tel essai permet une expérimentation dans

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma	D5796	Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media
Medium 199	Thermo Fisher Scientific	11150059	Component of iCLM media
Fetal bovine serrum (FBS)	Sigma	F2442	Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media
Insulin-Transferrin-Selenium G	Thermo Fisher Scientific	41400-045	Component of iCLM media
MEM vitamin solution	Thermo Fisher Scientific	11120-052	Component of iCLM media
MEM amino acids	Thermo Fisher Scientific	1601149	Component of iCLM media
Non-Essential amino acids	Thermo Fisher Scientific	11140-050	Component of iCLM media
Antibiotic-Antimycotics	Thermo Fisher Scientific	15240062	Component of iCLM media
B-27 supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044	Component of iCLM media
Heat-Inactivated Horse Serum	Thermo Fisher Scientific	26050-088	Component of iCLM media
NaPyruvate	Thermo Fisher Scientific	11360-70	Component of iCLM media
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	1514022	Component of Plat-E media and fibroblast media
Puromycin	Thermo Fisher Scientific	A11139-03	Component of Plat-E media
Blasticidin	Gemini Bio-Products	400-128P	Component of Plat-E media
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050-061	Component of Fibroblast media
Confocal laser scanning LSM700	Zeiss		For confocal analysis
FuGENE 6 transfection Reagent	Promega	E2692	Transfection reagent
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985-070	Transfection reagent
Polybrene	Millipore	TR-1003-G	Induction reagent. Use at a final concentration of 8 μM/mL
Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, Ecotropic	CellBiolabs	RV-101	Retroviral pacaking cell line
Trypsin 0.25% EDTA	Thermo Fisher Scientific		For MEFs and Plat-E dissociation
Mouse anti α-Actinin (Clone EA-53)	Sigma	A7811	Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Chicken anti-GFP IgY	Thermo Fisher Scientific	A10262	Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Rabbit Pab anti-NPPA	Abgent	AP8534A	Antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Rabbit Pab anti Myl2 IgG	ProteinTech	10906-1-AP	Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Vectashield solution with DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Vector Labs	H-1500	Dye for confocal analysis
Superfrost Plus Microscope slides	Thermo Fisher Scientific	12-550-15	25 x 75 x 1.0 mm
BioCoat Fibronectin 12 mm coverslips	NeuVitro Corp	GG-12-1.5	Coverslips for confocal analysis
100 μm cell strainer	Thermo Fisher Scientific	08-771-19
0.45 μm Syringes filters SFCA 25MM	Thermo Fisher Scientific	09-740-106	For virus filtration
6 mL Syringes	Covidien	8881516937	For virus filtration
Goat anti-Chicken IgY (H&L) A488	Abcam	AB150169	Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Donkey anti-rabbit A647 IgG(H+L)	Thermo Fisher Scientific	A31573	Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Goat anti-mouse IgG(H+L) A555	Thermo Fisher Scientific	A21422	Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Triton X-100	Sigma	93443-100ml	For cell permeabilization
Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS)	Sigma	D8537
Power Block 10x Universal Blocking reagent	Thermo Fisher Scientific	NC9495720	Dilute to 1x in H2O
16% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA)	Electro Microscopy Sciences	15710	Use at 4% diluted in dH2O
6 cm  plates	Olympus	25-260
6-well plates	Genesee Scientific	25-105
24-well plates	Genesee Scientific	25-107
10 cm Tissue culture dishes	Corning	4239
15 cm  Tissue culture dishes	Thermo Fisher Scientific	5442
15 mL Conical tubes	Corning	4308
50 mL Conical tubes	Corning	4249
0.4% Trypan blue solution	Sigma	T8154	For viability
Ethyl Alcohol 200 proof	Thermo Fisher Scientific	7005
Bleach	Thermo Fisher Scientific	6009