Avaliando cardiomiócitos subtipos Seguindo Reprogramação Fator de Transcrição mediada por embrionárias de camundongos Fibroblastos

Resumo

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

Resumo

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs).

We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

Introdução

O coração é o primeiro órgão funcional para desenvolver no embrião ^{1, 2.} Em conjunto com o sistema circulatório, que fornece o oxigénio, nutrientes, e um mecanismo de eliminação de resíduos durante o desenvolvimento. Três semanas após a fertilização, o coração humano bate pela primeira vez e a sua regulação correcta é mantida por cardiomiócitos (CMS). A perda irreversível destas células especializadas é, por conseguinte, o problema fundamental subjacente a insuficiência cardíaca progressiva. Embora alguns organismos, tais como o peixe-zebra e Xenopus têm o potencial para a regeneração cardíaca, o coração de mamíferos adultos é mais limitada de ^{3, 5, 6.} Assim, tendo em conta a função crítica do coração, não é surpreendente que a doença cardíaca é a causa principal de morte no mundo, sendo responsável por 600.000 mortes nos Estados Unidos sozinho ^7. oguinte, terapias baseadas em células para reparar ou substituir o miocárdio lesado de forma eficiente são de grande interesse clínico.

O estudo seminal de Yamanaka e seus colegas ⁸ mostraram que a expressão forçada de quatro fatores de transcrição é suficiente para converter células de fibroblastos completamente diferenciadas para as células-tronco pluripotentes. No entanto, a capacidade tumorigénica de todas as estratégias de células estaminais pluripotentes tem sido uma preocupação crítica na sua utilização para fins terapêuticos. Isso motivou o campo científico para procurar métodos alternativos para transdiferenciam células, evitando um estágio pluripotente. Recentemente, vários grupos demonstraram a viabilidade desta estratégia, exibindo conversão directa de fibroblastos de rato para células de cardiomiócitos-like induzidas (iCLMs) com a expressão ectópica de fatores de transcrição GATA4, MEF2C, Tbx5, e mais tarde, HAND2 (GMT e GHMT , respectivamente) ^{9, 10.} Furthermore, a mesma estratégia pode ser realizada in vivo e nos tecidos de origem ^{humana-9, 11, 12.} Estudos recentes puseram em evidência factores adicionais ou as vias de sinalização que pode ser modulada de modo a melhorar ainda mais a eficiência cardíaca reprogramação ^{13, 14, 15.} Tomados em conjunto, estes estudos demonstram o potencial de transdiferenciação dirigido para terapias regenerativas. No entanto, a baixa eficiência de CM reprogramação, os mecanismos moleculares desconhecidos, reprodutibilidade inconsistente devido a diferenças metodológicas ^16, e a heterogeneidade dos iCLMs permanecem sem solução.

A fim de avaliar diretamente iCLM heterogeneidade, foi elaborado um ensaio de uma única célula discreta e robusta para a identificação de desenvolvimento sarcomere e Specificatio linhagem cardíacaN-duas características necessárias de cardiomiócitos funcionais. Há pelo menos três tipos principais de CM no coração tal como definido pela sua localização e propriedades elétricas únicas: atrial (AM), ventricular (VM) e pacemaker (PM) ^{17, 18, 19, 20.} Numa combinação orquestrada, eles permitem que a bombagem de sangue adequado. Durante a lesão cardíaca, um ou todos os subtipos pode ser afectada, e o tipo de terapia com células teriam de ser dirigida numa base de caso-a-caso. Atualmente, a maioria das estratégias de focar a geração global de cardiomiócitos, enquanto pouco trabalho está sendo feito para estudar os mecanismos moleculares que regulam a especificação subtipo.

Detalhes do estudo seguinte como quantificar adequadamente sarcômeros bem organizadas e identificar um conjunto diversificado de subtipos de cardiomiócitos. Usando um pacemaker (PM) do mouse repórter -específica, somos capazes de aplicar um iabordagem mmunocytochemical distinguir miócitos atriais induzidas-like (IAM), miócitos ventriculares induzidas-like (MIV), e induzidas miócitos PM-like (IPMS) ^21. Com base em nossas observações, apenas as células que exibem organização sarcomere são capazes de batimento espontâneo. Esta plataforma reprogramação exclusivo permite avaliar o papel de determinados parâmetros na organização do sarcômero, especificação subtipo, e a eficiência da reprogramação CM na resolução de uma única célula.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais envolvendo práticas animais foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional Animal da UT Southwestern Medical Center.

1. Isolamento de Hcn4-GFP E12.5 rato embrionário de fibroblastos (MEFs)

1. Configurar acasalamentos cronometrados entre homozigotos machos Hcn4-GFP e CD-1 fêmeas.
2. Sacrificar fêmea grávida em E12.5 por eutanásia dióxido de carbono e subsequente deslocamento cervical.
   1. Remover cornos uterinos com uma pinça de dissecação como descrito anteriormente ^{22, 23,} e colocá-los em uma placa de Petri sobre gelo com uma solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS) sem ^{Ca2 +} ou ^{Mg2 +.}
3. Execute todas as etapas posteriores na capa de cultura de tecido, utilizando uma técnica estéril.
   1. Retire os embriões do útero e saco amniótico com uma tesoura e dissecando fórceps. Mantenha a placenta anexado para melhor manuseio. pregnant CD-1 fêmeas geralmente dão à luz entre 10 e 14 filhotes.
   2. Usando dissecando uma pinça, levar os embriões isolados e rapidamente lavá-los duas vezes em 70% (v / v) EtOH.
      NOTA: As lavagens deve ser rápido para minimizar a morte celular.
   3. Retire a cabeça, membros, cauda e órgãos internos, incluindo o coração dos embriões isolados.
   4. Colocar o tecido restante em um prato de 10 cm com 1 mL de PBS 1x e tritura finamente com uma lâmina de barbear esterilizada para aproximadamente 1 mm ³ de tamanho.
   5. Transferir tecido moído para um tubo cónico de 50 ml com PBS.
   6. Girar a 300 xg por 3 min. Aspirar cuidadosamente o excesso de PBS.
   7. Adicionar 1 ml de estéril 0,25% de tripsina-EDTA por embrião. Incubar as células em um banho de água a 37 ° C durante 15 min. Misture delicadamente o tubo a cada 4 min. Sobre-digestão do tecido irá diminuir significativamente o rendimento.
   8. mistura de células Vortex à velocidade máxima (3.200 rpm) durante 4 s.
   9. Adicione 2 ml de meio de fibroblastos por embrião e misture. filtro ttravés de um filtro celular de 100 um, utilizando uma pipeta para auxiliar as células através do filtro. Consultar a Tabela 1 para a formulação de todos os meios subsequentes.
   10. Giram a 300 g durante 4 min. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante.
   11. Adicionar 10 ml de meio de fibroblastos fresca por 3 embriões e triturar 6-10 vezes.
   12. Placa as células em 1 15 cm prato de cultura de tecidos para cada 3 embriões preparados. Durante a noite em cultura a 37 ° C, 5% de _CO2.
   13. Após a incubação durante a noite, substituir a mídia com frescos 30 mL de mídia por placa. Colocar as células de volta na incubadora durante a noite.
       NOTA: Verifique se há Hcn4-GFP ⁺ contaminação de células sob um microscópio fluorescente. A cultura deve ser GFP ^- e só se tornam GFP ⁺ sobre a reprogramação.
   14. No dia seguinte, as células de colheita com 3 ml de fresco pré-aquecido 0,25% de tripsina-EDTA. Contagem e congelar células. Tipicamente, congelar as células a 3 x 10 ⁶ culas por ml. O Yie esperadoLD deve ser de 3 x 10 ⁶ células por embrião.

2. Retrovirus Produção e Reprogramação

Atenção: O protocolo seguinte exige a produção e manipulação de retrovírus infecciosos. Execute as seguintes etapas em um armário de Biossegurança Nível 2, sob BSL-2 orientações e técnica estéril. Use 10% de alvejante de dispor de todos os materiais expostos ao retrovírus.

1. Produção de retrovírus e preparação MEFs
   NOTA: O protocolo seguinte é para a produção retroviral em placas de 6 poços e MEF infecção em placas de 24 poços. Para outros formatos, consulte a Tabela 2. MEFs são banhados no dia -1, então o tempo terá de ser coordenado de forma adequada para cada experimento (Consulte a seção 2.3 e Figura 2).
   1. Manter as células como as recomendações do fabricante Plat-E (PE). Resumidamente, as células de cultura de PE em DMEM suplementado com 10% de FBS, 1 ug / mL puromyCIN, 10 ug / ml de blasticidina, penicilina e estreptomicina. células de passagem 1: 4 a cada dois dias quando a cultura atinge 70-90% de confluência.
   2. Dia -2: No dia antes da transfecção, as células semente Plat-E a 1 x 10 ⁶ células / poço numa placa de 6 poços em meio de transfecção. As células devem ser de 70-80% confluentes no momento da transfecção.
2. A transfecção utilizando um agente de transfecção comercial.
   NOTA: Os reagentes comerciais devem estar à temperatura ambiente (TA) antes da transfecção. Para a transfecção de ADN, adicionar cada ADN plasmídico retroviral individualmente (G, H, H, e T), para formar um cocktail GHMT ^9.
   1. Dia -1: Em um tubo de poliestireno de 15 mL cónico, misturar 60 mL de meio de soro reduzido com 6 mL de reagente de transfecção por reacção de um formato de placa de 6 poços. Incubar a mistura durante 5 minutos à temperatura ambiente.
      Observação: Uma vez que o reagente de transfecção utilizado aqui se liga aos plásticos, umadd directamente para o meio de soro reduzido para evitar qualquer diminuição da eficiência de transfecção.
   2. Adicionar um total de 2 mg de GHMT cocktail por reação e bata suavemente para misturar. não vortex. Incubar a reacção durante 15 min à TA.
   3. Adicionar a mistura do passo 2.2.3 às células PE de forma sensata gota.
   4. Incubar as células Plat-E transfectadas durante a noite num banho a 37 ° C, 5% de _CO2. Anote o tempo de transfecção.
3. Semeadura de rato Hcn4-GFP fibroblastos embrionárias.
   1. 1 h antes do plaqueamento MEFs, preparar uma placa de 24 poços para imunocitoquímica.
      1. Adicionar uma lamela fibronectina 12 mm por bem.
      2. Poços revestimento com 300 uL de solução de colagénio bovino (por exemplo, surecoat) e incuba-se num banho a 37 ° C incubadora durante 1 h.
      3. solução de revestimento aspirado imediatamente antes do plaqueamento MEF.
   2. Descongelar uma ampola congelada de Hcn4-GFP MEFs e lavar com x1 fibrobl pré-aquecidomeios AST a 500 xg durante 5 min.
   3. Determinar a viabilidade celular utilizando a exclusão de azul de tripano ou corantes semelhantes. Calcular o número de células viáveis ​​por ml de cultura, utilizando a seguinte fórmula:
      % de células viáveis ​​= [1,00 - (número de células azuis / número total de células)] x 100
      1. Calcular o número total de células viáveis ​​utilizando a seguinte fórmula:
         As células viáveis ​​=% de células viáveis ​​x factor de diluição x 10.000 x volume total de suspensão de células
   4. Seed 3 x 10 ⁴ culas por po para uma placa de 24 poços com colagénio bovino lamela solução de fibronectina previamente preparada.
4. Transdução e reprogramação de MEFs
   NOTA: De acordo com as notas do fabricante, devidamente mantido células Plat-E produzir um título médio de 1 x 10 ⁷ unidades de infecção / mL. Embora a título não é directamente medido para cada experiência, um controlo de GFP é sempre incluído como um substituto para a eficiência de infecção.Expressão GFP e alta intensidade (GFP ^+> 95%) está correlacionado com geração tipicamente mediada por GHMT bem sucedida de iCLMs.
   1. Dia 0: 24 h pós-transfecção, filtrar a forma retroviral PE através de um tamanho de poro uM-filtro de acetato de celulose sem agente tensioactivo 0,45 e transferir para um tubo cónico de 15 mL. Adicionar polibreno a uma concentração final de 8 ug / mL. Cuidadosamente repor as células com 2 ml de meio de transfecção fresco.
      NOTA: As células facilmente separar da placa se a mídia é alterado muito rapidamente.
   2. Aspirar o meio dos MEFs cultivadas e adicionar o meio retroviral recentemente colhido; deve proporcionar 1,7 mL de meio por poço de uma placa de 6 poços. Adicionar ~ 800 uL por poço de uma placa de 24 poços. Retorno placa MEF para a incubadora e incubar durante a noite.
   3. Dia 1: Repita os passos 2.4.1 e 2.4.2. Descarte células após a colecção de vírus da ^2ª. Voltar MEFs infectados para a incubadora e deixá-los descansar durante a noite.
   4. Dia 2: 48 h pós-indução, aspirar a célula condicionado mídia e lavagem x1 com 1x PBS. Adicionar 500 ul meios iCLM pré-aquecido por poço de uma placa de 24 poços.
   5. Substituir mídia iCLM cada 2 - 3 dias. placa processo de 14 dias após a indução viral para imunocitoquímica análise (ICC) de reprogramação cardíaca.

3. A imunocoloração de MEFs reprogramado

1. 14 dias pós-indução, aspirar cuidadosamente a mídia.
2. Lavar cada poço com 300 mL de gelo-frio 1x PBS. Aspirar o excesso de solução.
3. Fixar as células com 250 uL de solução de paraformaldeído a 4% (PFA) por poço de uma placa de 24 poços. Incubar 15 min a RT.
   NOTA: Fixa células podem ser armazenadas em PBS a 4 ° C durante 1 - 2 semanas antes da coloração.
4. permeabilizar células por Wells lavar 3x com 300 uL de 0,1% Triton X-100 de PBS (PBST). Incubar 5 min à temperatura ambiente entre lavagens. Aspirar o excesso de solução após a última lavagem.
5. Bloco para 10min à temperatura ambiente com tampão de bloqueio universal 1x a 300 uL / ​​poço.
6. Prepare tampão de coloração (ICC): Adicione 1: 1 de PBS 1x e 1x Universal tampão de bloqueio. Dilui-se os anticorpos primários em tampão de coloração ICC e incubar anticorpos durante a noite a 4 ° C. Consulte a seção de material para diluições recomendadas.
   1. Manchar um par de lâminas com α-actinina rato, αGFP frango e coelho NPPA para IPM e identificação IAM.
   2. Manchar um par de lâminas com rato α-actinina, αGFP frango, e Myl2 coelho para IPM e IVM identificação.
7. No dia seguinte, lave poços x3 com 300 mL de 0,1% PBST. Incubar 5 min à temperatura ambiente entre lavagens. Aspirar o excesso de solução após a última lavagem.
8. Preparar as diluições de anticorpo secundário em tampão de coloração ICC. Consulte a seção de material para diluições recomendadas. Incubar anticorpos secundários 1 h à temperatura ambiente, protegida da luz.
   1. Manchar todos os slides com o antibodie secundária seguintes: Rato Alexa-555, frango Alexa-488, e coelho Alexa-647.
9. Lave poços x3 com 300 mL de 0,1% PBST. Incubar 5 min à temperatura ambiente entre lavagens. Proteger da luz.
10. Adicionar 2,4 mL de meio de montagem contendo 1,5 ug / ml de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) para uma lâmina de microscópio de vidro. Remova cuidadosamente a lamela do poço da placa de 24 poços, remover o excesso de solução e transferir para a lâmina de vidro com meios de montagem. Pressione suavemente a lamela para remover o excesso de volume e ar.
11. lâminas de vedação com unha polonês preferencial ou selante plástico. Loja montadas lâminas a 4 ° C protegidos da luz.

4. Identificação do cardíacos subtipos Usando Microscopia Confocal

NOTA: Para imagens, um microscópio confocal equipado com pelo menos 2 detectores fluorescentes capazes de detecção espectral a 405, 488, 555, e 639 nm comprimento de onda é necessário, a fim de identificar IPMS, IAM, e iVMS. imagcélulas e usando um plano-Apochromat 20X / 0,75 objetiva ou melhor. Usando o software de análise de imagem do fabricante, a digitalização de imagens de zoom pode conseguir imagens de qualidade de imersão 40X de óleo.

1. biblioteca de imagens: tome imagens de 8 bits com DAPI, Alexa-488, Alexa-555 e Alexa-647 canais (cap.). Pixel tempo de permanência de 6 s, 1024 tamanho do quadro, passo linha no 2, e média de 2 é suficiente para imagens de alta resolução.
2. Para cada slide, começar a partir de uma extremidade e começar a digitalizar cima e para baixo no canal fluorescente vermelha (cap.) Para sarcômero ⁺ células α-actinina ⁺ (Consulte a Figura 3 e Figura 5A para exemplos). estrias sarcômero são mais fáceis de identificar visualmente no comprimento de onda 555 nm.
   1. Uma vez que um sarcômero ⁺ células α-actinina ⁺ foi identificado, mudar para o ch verde. e manter a nota se for positivo (IPM). Mudar para o computador para avaliar a vermelho-distante 647 ch. (IAM ou MIV).
      NOTA: As células que sãoα-actinina ⁺ / ⁺ sarcômero / Hnc4-GFP ⁺ / NPPA ^- / Myl2 ^- são designados como IPMS. Expressão da GFP será visto ao longo da célula (Figura 4A).
   2. lâminas mancha com α-actinina (mouse-Alexa555), Hcn4-GFP (frango-Alexa488), NPPA (coelho-Alexa647) e DAPI. Células que são α-actinina ⁺ / sarcômero ⁺ / Hnc4-GFP ^- / ⁺ NPPA são IAM. NPPA coloração aparece perinuclear e pontuada (Figura 4B).
   3. lâminas mancha com α-actinina (mouse-Alexa555), Hcn4-GFP (frango-Alexa488), Myl2 (coelho-Alexa647). Células positivas para α-actinina ⁺ / sarcômero ⁺ / Hnc4-GFP ^- / ⁺ Myl2 são iVMS. Myl2 coloração irá apresentar uma forma estriado ao longo do filamento sarcômero. Devido a variações na qualidade da coloração e o plano z, estrias podem nem sempre ser facilmente visível (Figura 4C).

5. quantificação

NOTA: De modo a avaliar o número real de MEFs potencialmente reprogramadas, 2 poços de uma placa de 24 cavidades são semeadas em paralelo aos poços experimentais e são colhidas um dia após o plaqueamento. O número total de células plaqueadas é então determinada através da média das duas cavidades. Isto torna-se total de células reais banhados (atotal).

1. sarcômero ⁺
   1. Inspecionar visualmente cada célula em uma lamela para o bom α-actinina ⁺ / sarcômero ⁺ (painéis da direita Figura 3) e registro (Figura 5B-I).
   2. Tabular o número total de α-actinina ⁺ / ⁺ sarcômero em cada lamela e dividir pelo número total de células plaqueadas reais (atotal) (Figura 5B-III). Por exemplo, se atotal = 12.500 células, e células 100 foram a-Actinina ⁺ / ⁺ sarcômero então, 0,8% de as MEFs plaqueadas foram reprogramadas. Uma médiareprogramação experiência renderá 1% de a-actinina ⁺ / sarcômero células ⁺ (Figura 5C).
2. subtipo ⁺
   NOTA: Para os passos seguintes, consulte a Figura 5B / C para um fluxo de trabalho iCLM quantificação representativa. Resumidamente, para cada célula sarcómero ^+, tabular se que é único para qualquer subtipo (Figura 5B-I). Calcular a% de subtipo (Figura 5B-III), dividindo o número de células ao longo do subtipo ⁺ sarcómero média ⁺ x 100 células (Figura 5B-I). Para calcular a% de eficiência absoluta subtipo (Figura 5B-IV), dividir o número subtipo ⁺ célula a partir da Figura 5B-I pelo número total de células semeadas x 100 (Figura 5B-II).
   1. Para cada uma das células α-actinina ⁺ / ⁺ sarcômero, avaliar se eles são GFP ^{+, +} NPPA, ou Myl2 +.
   2. Tabular número total de α-actinina ⁺ / sarcômero ⁺ / Hnc4-GFP ⁺ / NPPA ^- / Myl2 ^-, actinina ⁺ / sarcômero ⁺ / Hnc4-GFP ^- / NPPA _^+, e α-actinina ⁺ / sarcômero ⁺ / Hnc4-GFP ^- / ⁺ Myl2 células (Figura _5B-i).
   3. Para calcular a percentagem de cada subtipo, divida o número de células Subtipo ⁺ pelo número total de α-actinina ⁺ / sarcômero ⁺ células em que bem e multiplicar por 100. GHMT gera IPMS, Iams, e iVMS proporções mais ou menos iguais (Figura 5B-III).
   4. Para calcular o número absoluto de células subtipo ^+, dividir o número total de células subtipo ⁺ para a condição experimental por atotal e multiplicar por 100 (Figura 5B-II). Em IPMS médios representam 0,3% da população total de células infectadas, IAM 0,3%, eiVMS 0,25% (Figura 5B-IV).

Resultados

Tomando vantagem do rato repórter específica do PM, que desenvolveu uma estratégia para identificar imunocoloração multiplex diversas miócitos endógenos, como representado na Figura 1. Após os passos de reprogramação mostrados na Figura 2, a indução de MC específicos do subtipo pode ser detectada tão cedo como o dia 4 ^21, se bem que a uma velocidade baixa. Ao dia 14, o experimento pode ser interrompido e avaliadas pa...

Discussão

O presente estudo fornece uma estratégia de reprogramação direta para a conversão de MEFs em um conjunto diversificado de subtipos cardíacas via expressão mediada por retrovírus da transcrição cardíaca fatores GATA4, MEF2C, Tbx5 e HAND2 (GHMT). Usando uma abordagem imunocoloração multiplex em combinação com um rato repórter específica do PM, somos capazes de identificar IAM, iVMS e IPMS em resolução de uma única célula. Um tal ensaio permite uma experimental sistema in vitro capaz de isolar ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma	D5796	Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media
Medium 199	Thermo Fisher Scientific	11150059	Component of iCLM media
Fetal bovine serrum (FBS)	Sigma	F2442	Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media
Insulin-Transferrin-Selenium G	Thermo Fisher Scientific	41400-045	Component of iCLM media
MEM vitamin solution	Thermo Fisher Scientific	11120-052	Component of iCLM media
MEM amino acids	Thermo Fisher Scientific	1601149	Component of iCLM media
Non-Essential amino acids	Thermo Fisher Scientific	11140-050	Component of iCLM media
Antibiotic-Antimycotics	Thermo Fisher Scientific	15240062	Component of iCLM media
B-27 supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044	Component of iCLM media
Heat-Inactivated Horse Serum	Thermo Fisher Scientific	26050-088	Component of iCLM media
NaPyruvate	Thermo Fisher Scientific	11360-70	Component of iCLM media
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	1514022	Component of Plat-E media and fibroblast media
Puromycin	Thermo Fisher Scientific	A11139-03	Component of Plat-E media
Blasticidin	Gemini Bio-Products	400-128P	Component of Plat-E media
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050-061	Component of Fibroblast media
Confocal laser scanning LSM700	Zeiss		For confocal analysis
FuGENE 6 transfection Reagent	Promega	E2692	Transfection reagent
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985-070	Transfection reagent
Polybrene	Millipore	TR-1003-G	Induction reagent. Use at a final concentration of 8 μM/mL
Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, Ecotropic	CellBiolabs	RV-101	Retroviral pacaking cell line
Trypsin 0.25% EDTA	Thermo Fisher Scientific		For MEFs and Plat-E dissociation
Mouse anti α-Actinin (Clone EA-53)	Sigma	A7811	Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Chicken anti-GFP IgY	Thermo Fisher Scientific	A10262	Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Rabbit Pab anti-NPPA	Abgent	AP8534A	Antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Rabbit Pab anti Myl2 IgG	ProteinTech	10906-1-AP	Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Vectashield solution with DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Vector Labs	H-1500	Dye for confocal analysis
Superfrost Plus Microscope slides	Thermo Fisher Scientific	12-550-15	25 x 75 x 1.0 mm
BioCoat Fibronectin 12 mm coverslips	NeuVitro Corp	GG-12-1.5	Coverslips for confocal analysis
100 μm cell strainer	Thermo Fisher Scientific	08-771-19
0.45 μm Syringes filters SFCA 25MM	Thermo Fisher Scientific	09-740-106	For virus filtration
6 mL Syringes	Covidien	8881516937	For virus filtration
Goat anti-Chicken IgY (H&L) A488	Abcam	AB150169	Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Donkey anti-rabbit A647 IgG(H+L)	Thermo Fisher Scientific	A31573	Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Goat anti-mouse IgG(H+L) A555	Thermo Fisher Scientific	A21422	Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Triton X-100	Sigma	93443-100ml	For cell permeabilization
Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS)	Sigma	D8537
Power Block 10x Universal Blocking reagent	Thermo Fisher Scientific	NC9495720	Dilute to 1x in H2O
16% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA)	Electro Microscopy Sciences	15710	Use at 4% diluted in dH2O
6 cm  plates	Olympus	25-260
6-well plates	Genesee Scientific	25-105
24-well plates	Genesee Scientific	25-107
10 cm Tissue culture dishes	Corning	4239
15 cm  Tissue culture dishes	Thermo Fisher Scientific	5442
15 mL Conical tubes	Corning	4308
50 mL Conical tubes	Corning	4249
0.4% Trypan blue solution	Sigma	T8154	For viability
Ethyl Alcohol 200 proof	Thermo Fisher Scientific	7005
Bleach	Thermo Fisher Scientific	6009