الرئة ماوس شرائح لتصور لايف الخلايا الجذعية الرئوي قطع الدقة

Summary

نحن تصف طريقة لتوليد قطع الدقة الرئة شرائح (PCLS) والمناعية لهم لتصور توطين مختلف أنواع الخلايا المناعية في الرئة. ويمكن تمديد بروتوكول لدينا تصور موقع وظيفة العديد من أنواع مختلفة من الخلايا في إطار مجموعة من الشروط.

Abstract

استنشاق المواد المسببة للحساسية والجراثيم يثير عدة تغييرات في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا المناعية في الرئة. التدفق الخلوي هو أسلوب قوية للتحليل الكمي للبروتينات سطح الخلية في الخلايا المناعية، لكنه لا يقدم أي معلومات عن التوطين والهجرة أنماط من هذه الخلايا داخل الرئة. وبالمثل، المقايسات الكيميائي يمكن أن يؤديها لدراسة إمكانية الخلايا على الاستجابة للعوامل الكيميائي في المختبر، ولكن هذه المقايسات لا تتكاثر في بيئة معقدة في الرئة سليمة. وعلى النقيض من هذه التقنيات المذكورة أعلاه، وموقع من أنواع الخلايا الفردية داخل الرئة يمكن تصور بسهولة عن طريق توليد خفض الدقة والرئة شرائح (PCLS)، تلطيخ لهم المتاحة تجاريا الأجسام المضادة، الموسومة fluorescently، وتصور المقاطع بواسطة المجهر متحد البؤر. PCLS يمكن أن تستخدم في كل من يعيش وأنسجة الرئة ثابتة، ويمكن للشرائح تشمل مناطق كبيرة مثل شريحة من الفص كامل. وقد استخدمنا هذا البروتوكول لتصور بنجاح مكان وجود مجموعة واسعة من أنواع الخلايا في الرئة، بما في ذلك أنواع متميزة من الخلايا الجذعية، الضامة، العدلات، وخلايا T والخلايا B، وكذلك خلايا هيكلية مثل اللمفاوية، البطانية، و الخلايا الظهارية. القدرة على تصور التفاعلات الخلوية، مثل تلك التي بين الخلايا الجذعية وخلايا T، في العيش، وأنسجة الرئة ثلاثية الأبعاد، يمكن أن تكشف عن كيفية تحرك الخلايا داخل الرئة وتتفاعل مع بعضها البعض في حالة مستقرة وخلال الالتهاب. وهكذا، عندما تستخدم بالاقتران مع إجراءات أخرى، مثل التدفق الخلوي وPCR الكمي، PCLS يمكن أن تسهم في فهم شامل من الأحداث الخلوية التي تكمن وراء أمراض الحساسية والتهابات الرئة.

Introduction

عقب استنشاق من المحفزات الموالية للالتهابات مثل lipopolysaccharide في (LPS)، وهناك حركة منسقة من الخلايا المناعية إلى داخل، ومن الرئة. على سبيل المثال، يتم تجنيد العدلات بسرعة في لحمة الرئة والشعب الهوائية. وبالإضافة إلى ذلك، بعض مستضد الخلايا المهنية المعروفة باسم الخلايا الجذعية التقليدية (جان تنمية المجتمعات المحلية) تخضع لنمط الهجرة معقدة نسبيا ^{1 و 2.} ويمكن تحديد جان تنمية المجتمعات المحلية باستخدام التدفق الخلوي، ومقرها في جزء منها على العرض الخاصة بها من علامة السطح، CD11c و. فرعية متميزة من البلدان النامية يمكن تمييزها عن طريق التعبير عن سطح التفاضلية للCD103 وCD11b ^3. على الحصول على مستضد استنشاق بعض جان تنمية المجتمعات المحلية الخروج من الرئة وتهاجر من خلال الأوعية الليمفاوية إلى استنزاف الرئة الغدد الليمفاوية (LNS) حيث أنها تقدم الببتيدات لمستضد محددة الخلايا T ^4. هذا حدث في وقت مبكر حاسما في بدء ص المناعة التكيفيةesponses. لأسباب غير معروفة، ولكن، ليس كل جان تنمية المجتمعات المحلية التي تحصل على مستضدات استنشاق ترك الرئة، وتبقى العديد من هذه الخلايا في هذا الجهاز لعدة أشهر ^{5، 6.} هذه الملاحظة يمكن تفسيرها جزئيا من أصل التنموي من هذه الخلايا لالوحيدات المستمدة CD11c ^و+ خلايا تفتقر إلى مستقبلات chemokine، CCR7، غير قادرين على الهجرة إلى LNS الإقليمية ^{7 و 8.} ويبدو من المرجح أن إمكانيات هجرة جان تنمية المجتمعات المحلية ويتحدد أيضا، على الأقل جزئيا، من خلال وضع تشريحي في غضون الرئة. ومع ذلك، لا تتميز بشكل كامل التعريب الدقيق لهذه مجموعات مختلفة من جان تنمية المجتمعات المحلية في الرئة. معرفة محسنة لتوطين الخلايا المناعية في الرئة، والجزيئات التي توجه إليها، وهناك حاجة لفهم أفضل لكيفية عمل نظام المناعة في الرئة يصبح تفعيلها.

PCLS يجري يتزايدتستخدم لاي كنهج خارج الحي لتصور المواقع الخلوية وخلية خلية التفاعلات، مع الحفاظ على السلامة الهيكلية للبنية الرئة ^{9، 10.} وقد استخدمت PCLS لدراسة الرئتين لكثير من الأنواع، بما في ذلك الفئران والأبقار والقرود والأغنام والخيول، والبشر ^(11). والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو أن ما يقرب من 20 شرائح يمكن إعداد من الفص واحد من الرئة الماوس، مما يقلل من عدد الحيوانات اللازمة لإجراء التجارب الفردية. تقريبا جميع أنواع الخلايا المناعية، بما في ذلك البلدان النامية، الضامة، العدلات، والخلايا T، موجودة في PCLS والحفاظ على هياكلها العادية.

يمكن أن تستخدم أيضا لدراسة PCLS إشارات الكالسيوم وانقباض الخلايا الهوائية والعضلات الملساء بعد العلاج مع أستيل ¹² أو ¹³ ميثاكولين. في هذا النهج، سوى جزء صغير من الرئة هوalyzed مجهريا، ولكن ذكرت إحدى الدراسات أن قياسات انكماش الهوائية في PCLS تختلف حوالي 10٪ فقط من شريحة إلى شريحة، وهذه الفرق هي مماثلة لتلك التي شوهدت باستخدام اختبارات وظائف الرئة في الحيوانات سليمة ^14. وقد استخدم باحثون آخرون PCLS كنهج خارج الحي لدراسة التغيرات في التعبير خلوى وسطح الخلية علامات بعد الحضانة مع LPS ^15. كما استخدمت PCLS في نموذج المجراة سابقا من تضيق الأوعية الرئوية نقص الأوكسجين في الشرايين الصغيرة داخل عنيبية. تقع هذه السفن في جزء من الرئة التي لا يمكن الوصول إليها باستخدام إجراءات أخرى، بما في ذلك تسجيلات من شرائح الشريانية تشريح أو تحليل السفن تحت الجنبة ^16. وقد استخدمت مختبرنا في المقام الأول PCLS لتصور توطين الخلايا المناعية في أنسجة الرئة يعيش في حالة مستقرة وبعد في الجسم الحي تحفيز التهابات. الإجراءات وضعنا لذلك هي على النحو التالي.

Protocol

تمت الموافقة على إجراءات حيوانات التجارب وصفها في هذه الورقة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات معهد علوم الصحة البيئية (IACUC).

1. إعداد الرئة

1. الفئران منزل ما بين 6 و 12 أسابيع من العمر في ظروف معينة خالية من مسببات الأمراض وفقا للمبادئ التوجيهية التي قدمتها لجان رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي.
   ملاحظة: يمكن تصوير الفئران أن يكون إما ساذجا، أو معاملة، اعتمادا على المصالح الخاصة لكل الباحث. هنا، نحن تصف توطين الخلايا المناعية في الفئران ساذجة وفي الفئران التي عولجت مع 100 ميكروغرام ألبومين البيض (OVA) و 0.1 ميكروغرام lipopolysaccharide في (LPS)، وذلك باستخدام الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) كوسيلة في حجم ما مجموعه 50 ميكرولتر. لغرس oropharyngeally OVA / LPS في الشعب الهوائية، وتخدير الحيوانات مع استنشاق الأيزوفلورين وعلقت عموديا أسنانهم مع الشريط المطاطي. وقد أدرك اللسان بلطف مع ملقط وعقد لجانب واحد لمنع البلع، و 50 & #181؛ L من الحل OVA / LPS المودعة في الجزء الخلفي من تجويف الفم كما هو موضح سابقا ^(17).
2. الموت ببطء الفأر مع حقن داخل الصفاق من بنتوباربيتال الصوديوم (100 ملغ / كلغ)، ويعلقون الحيوان إلى قاعدة البوليسترين.
3. فتح تجويف البطن مع مقص عن طريق قطع الجلد والغشاء البريتوني من منتصف البطن حتى الفك. سحب الأمعاء جانبا مع ملقط أو حافة مملة من مقص، وقص الوريد الأجوف السفلي لاستنزاف الدم بعيدا عن الرئتين. ثقب الحجاب الحاجز مع طرف حاد من مقص للسماح توسيع القفص الصدري، والحرص على عدم قطع الرئتين.
4. الغدد اللعابية واضحة وغيرها من الأنسجة بعيدا عن القصبة الهوائية عن طريق الاستيلاء على الأنسجة وجرها بعيدا عن القصبة الهوائية الأساسية مع ملقط يدويا. إجراء شق صغير في القصبة الهوائية على الجانب الأمامي من سمكا عصابة من الغضروف باستخدام ملقط غرامة أو مقص، والحرص على عدم قطع كل وسيلة على الرغم من أن هيئة تنظيم الاتصالاتشيا. فإن شق تكون كبيرة بما يكفي للسماح للإبرة 20 G بالمرور.
5. الشريحة 1.5 بوصة، و 20 G إبرة على قسم من أنابيب البولي ايثيلين، وترك حوالي 1 سم من الأنابيب بعد نهاية الإبرة. قطع الأنابيب في زاوية ما يقرب من 45 درجة إلى شطبة النهاية، إرفاق الإبرة إلى حقنة 1 مل، وتحميل حقنة عن طريق رسم 0.8 مل من الحارة (40 درجة مئوية) 2٪ نقطة انصهار منخفضة الاغاروز حتى من خلال إبرة.
6. ضع نهاية الأنبوب في شق القصبة الهوائية وحقن ببطء الاغاروز إلى الرئتين. دون تحريك إبرة أو حقنة، الشريط المحقنة إلى قاعدة البوليسترين لضمان تبقى الإبرة في القصبة الهوائية.
   ملاحظة: بعد الحقن، والرئتين تكون أكبر وتضخم في الصدر. الفص الأيمن توسيع أولا، ثم الفص الأيسر. إذا توسع فص واحد فقط، وقد تم إدخال الإبرة بعمق (الماضي القصبات الهوائية)، وسيكون من الضروري أن تخلعها قليلا قبل المتابعة. هذا الجزء منيحتاج الإجراء الذي يتعين القيام به بسرعة نسبيا، قبل أن يبدأ الاغاروز لترسيخ.
7. ضع الماوس، مع قاعدة والمحاقن لا يزال إدراجها في القصبة الهوائية، في غرفة باردة أو الثلاجة لمدة 10 دقيقة على الأقل. إذا لزم الأمر، والحيوان يمكن أن تبقى هناك لمدة تصل إلى عدة ساعات، حتى لو الشروع في الهجرة الخلية الصورة بواسطة المجهر الفيديو.
8. وبمجرد أن الفأر هو بارد، استئصال بعناية الرئتين في تضخيم الاغاروز باستخدام مقص، ووضعها في طبق 3 سم مع الجليد PBS الباردة. الحفاظ على الجليد.
9. اختيار الفص المطلوب للتشريح الأنسجة (على سبيل المثال، والحق الفص العلوي). تأكد من أن الجزء الداخلي من الرئة (حيث يصل إلى القصبة الهوائية) وجهه لأسفل في الطبق.
   ملاحظة: الفص استخدامها وسوف توجهها على المكبس تحديد حجم السفن والخطوط الجوية التي من شأنها أن تكون واضحة. التوجه هو موضح هنا مثالية لرؤية الخطوط الجوية الكبيرة، وحمة. الفئران لها واحد الفص الأيسر كبير وأربعة فصوص صغيرة على اليمين. إلى عن علىالتصوير PCLS بعد إدخال المواد المسببة للحساسية في الرئتين عبر فموي بلعومي أو طموح الأنف، هو مقطوع عادة الفص العلوي الأيمن، في جزء منه لأنه هو حجم مناسب، ولكن أيضا بسبب عوامل استنشاق تفريق موحد داخلها. ومع ذلك، فصوص الأخرى، وخاصة الفص الأيسر، ويمكن أيضا أن تدرس. عند المقارنة بين سلالات الماوس أو العلاج، من المهم أن يقارن نفسه الفص.

2. الرئة التقطيع

ملاحظة: تأكد شرائح باستخدام تقطيع الآلي، والمعادن تبريد كتلة، الغواص والمحاقن المعدنية، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.

1. وضع قطرة صغيرة من جميع الأغراض، لا تديرها هلام superglue على المكبس ونشر الغراء في حركة دائرية، مع الحرص على عدم السماح للالغراء تلمس الجانبين من الحقنة المعدنية. إذا الغراء اللمسات الجانبين من الحقنة، وسوف الغراء حقنة والغطاس معا.
2. فورا بعد تغطية الغطاس مع الغراء، فهم بلطفالفص رفعه مع ملقط مع الجانب القصبة الهوائية أسفل، ربت على منديل ورقي لإزالة السائل الزائد، وبعناية وضعه على رأس المكبس. تقليم قبالة أي نوع من الأنسجة إضافية تتجاوز حافة المكبس.
3. تحرك المكبس إلى أسفل بحيث الجانبين من الحقنة المعدنية تتحرك صعودا وأكثر من الأنسجة، وخلق تماما مع الرئة لصقها في الجزء السفلي، أي أكثر من عدة سنتيمترات عميقة. الشريط حول الجزء السفلي من حقنة معدنية لعقد هذا الموقف في المكان.
4. بعناية صب 2٪ منخفضة ذوبان الاغاروز في 40 ° C في البئر بحيث أنها تغطي فقط الجزء العلوي من الفص.
5. تحيط حقنة معدنية مع كتلة تقشعر لها الأبدان الجليد الباردة وتبريد الفص والاغاروز 1 - 2 دقيقة.
   ملاحظة: التبريد وقت أقصر من الاغاروز المحيطة الأنسجة يمكن أن يؤدي إلى تفكك الاغاروز تشريح، والتي قد تؤدي إلى خفض PCLS بشكل غير متساو خلال.
6. تحميل حقنة العينة في تقطيع اللحم الآلي وملء خزان العازلة مع الجليد الباردة PBS. محاذاة خطوة محرك السيارات مع حقنة العينة وإزالة قطعة من الشريط من الجزء السفلي. بدوره التحول إلى موقف سريع إلى الأمام (FF) حتى محرك السيارات الخطوة مجرد تلامس الجزء الخلفي من المكبس.
7. محاذاة شفرة جديدة مع حقنة العينة. مجموعة سمك الأنسجة، المستمر / شريحة واحدة، التذبذب والسرعة في تقطيع اللحم. على سبيل المثال، سمك الأنسجة: 150 ميكرون، القطع المستمر (تابع)، التذبذب: 9، وسرعة: 3 - بداية 4. برس. يجب أن يتم تعديلها للمواصفات تقطيع الآلية المحددة الإعدادات أعلاه.
8. باستخدام ملعقة رقيقة أو الفرشاة، وجمع PCLS في وقت واحد حيث أنها تقع في خزان العازلة ووضعها في لوحة 24-جيدا تحتوي على الجليد الباردة PBS.
   ملاحظة: من المهم للحفاظ على شرائح من أجل الحفاظ على التناسق بين التجارب. على الرغم من كل الرئة تختلف حسب العمر والجنس والوزن، وشريحة ^ال 10، على سبيل المثال، عادة ينتج الحجم بالمثل الهوائية.

ove_title "> 3. الضد تلطيخ

1. تصميم لوحة من الأجسام المضادة الموسومة fluorescently استنادا إلى نوع من الخلايا في المصالح، مع الأخذ بعين الاعتبار احتمال التداخل الطيفي الفلورسنت وقدرات الكشف المجهر.
   ملاحظة: وكمثال على ذلك، لجنة للكشف فرعية DC هي على النحو التالي: CD11c و/ ألفا X إنتغرين - BrilliantViolet (BV) 605 (الإثارة: 405 نانومتر، ذروة الانبعاثات: 605 نانومتر)، CD324 / E-كادهيرين - اليكسا 488 (AF488 ) (الإثارة: 488 نانومتر، والانبعاثات الذروة: 519 نانومتر)، CD88 / C5Ra1 - فيكوإيريترين (PE) (الإثارة: 561 نانومتر، والانبعاثات الذروة: 578 نانومتر)، CD103 / ألفا E إنتغرين - Allophycocyanin (APC) (الإثارة: 633 نانومتر ، والانبعاثات الذروة: 660 نانومتر). مضان أدوات المشاهد الطيفية (انظر قائمة المواد) هي مفيدة لتصميم اللوحات.
2. تقديم كوكتيل الأجسام المضادة التي تحتوي على الأجسام المضادة المطلوبة.
   1. للتصوير PCLS ثابت، إضافة 800 ميكرولتر عازلة تلطيخ، و 100 ميكرولتر فك بلوكر، 50 ميكرولتر مصل الفأر العادي، و 50 ميكرولتر العادي الفئران المصل إلى 1.5 مل microcentrifuأنبوب gation لإجمالي حجم 1 مل. لتصوير الخلايا الحية، استخدم 800 ميكرولتر المتوسطة يبوفيتش (1X) تحتوي على 10٪ FBS (يبوفيتش 10) بدلا من العازلة تلطيخ.
   2. إضافة أجسام مضادة لضبط التركيز النهائي المطلوب من كل الأجسام المضادة. نقل الحل الضد إلى طبق 3 سم، ونضع في الظلام حتى جاهزة للاستخدام.
      ملاحظة: تركيزات النهائي في حاجة إلى أن يكون الأمثل لكل الأجسام المضادة الفردية (عادة 1-5 ميكروغرام / مل).
3. اختيار PCLS بمساحة التشريحية للاهتمام، مثل الخطوط الجوية الكبيرة أو محيط الرئة، ووضع في طبق 3 سم، ويحتوي على 1 مل من محلول الأجسام المضادة.
4. PCLS وصمة عار في الظلام، على الجليد، هزاز ببطء لمدة 30 أو 60 دقيقة.
5. للتصوير PCLS ثابت، انتقل إلى القسم 4. لتصوير الخلايا الحية، انتقل إلى القسم 5.

4. ساكنة التصوير من PCLS

1. بعد 60 دقيقة حضانة PCLS مع الأجسام المضادة، وإزالة حل الأجسام المضادة من الطبق وشطف ركان شرائح مرتين مع 1 مل الجليد PBS الباردة.
2. ماصة 50 ميكرولتر PBS على 3 سم جولة طبق من الزجاج السفلي. باستخدام ملعقة أو الفرشاة، ونقل PCLS الملون إلى الانخفاض، والتلاعب بلطف شريحة حتى أنها مسطحة، وانتشرت. إزالة برنامج تلفزيوني مع ماصة. شريحة يجب الاستلقاء قدر الإمكان. تحتاج إلى أن يؤديها بسرعة لتجنب photobleaching من الإجراءات المذكورة أعلاه.
3. وضع 1 قطرة من درجة حرارة الغرفة المتوسطة المتزايدة على شريحة وإسقاط بلطف ساترة الزجاج في بئر من لوحة. الحفاظ PCLS في الظلام عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى ساعة قبل التصوير.
4. عند عرض تحت المجهر متحد البؤر، واستخدام الهدف 20X (انظر قائمة المواد). استخدام أداة "بلاط" لتحديد مكان وبمناسبة حواف النسيج في الإعداد "بدن محدب". هذا وسوف تساعد على تقليل وقت الفحص البلاط.
5. أثناء إعداد مجموعة ض المكدس، تحقق في مجالات متعددة من شريحة، وخصوصا على طول الحواف، أن نطاقات مجموعةهي مناسبة.
   ملاحظة: إن المدى ض المرجح أن تحتاج إلى أن تكون أكبر من سمك الأنسجة نفسها لأنه من الصعب جدا الحصول على الأنسجة لوضع مسطح تماما. على سبيل المثال، مع PCLS سميكة 150 ميكرون، وسوف تحتاج مجموعة ض المكدس المرجح أن يتم تعيين إلى 200-250 ميكرون لاستيعاب المطبات والمنحنيات في شريحة. اعتمادا على مجموعة ض المكدس وحجم الأنسجة، وكل فحص الرئة الكامل يستغرق ما بين 7-12 ساعة مع هدف 20X. كل الرئة هي فريدة من نوعها ويجب تعديلها إعدادات كل تجربة.

5. يعيش التصوير خلية من PCLS

1. بعد 30 دقيقة حضانة PCLS مع الأجسام المضادة، وإزالة حل الأجسام المضادة من الطبق وشطف شرائح مرتين مع 1 مل الباردة يبوفيتش 10.
2. ماصة الطازجة 50 ميكرولتر يبوفيتش 10 إلى فتحة واحدة من ساترة غرف (8 فتحات). استخدام ملعقة لنقل PCLS إلى المتوسطة، والتلاعب برفق حتى شريحة مسطحة، وانتشرت. الإجراءات المذكورة أعلاهتحتاج إلى أن يؤديها بسرعة لتجنب photobleaching من.
3. إزالة المتوسطة 50 ميكرولتر باستخدام ماصة. شريحة وأن الاستلقاء قدر الإمكان.
   ملاحظة: فمن المقبول إذا انقلبت حواف شريحة عموديا على جدار الغرفة. وعلاوة على ذلك، إن وجدت، على وزن البلاتين معدن يمكن أن تستخدم لترسيخ شريحة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. انظر قائمة المواد المرفقة لمثال واحد من سلك البلاتين التي يمكن قص وعازمة في الأوزان الصغيرة.
4. في 4 ° C الغرفة الباردة، مزيج 100 ميكرولتر من النمو انخفاض عامل، الفينول مجانا الحمراء المصفوفة خارج الخلية مع 100 ميكرولتر يبوفيتش 10. استخدام نصائح ماصة precooled لهذا، أو أن المصفوفة خارج الخلية يصلب في الطرف.
   ملاحظة: هذه النسبة من المصفوفة والمتوسطة (1: 1) بإنشاء هلام كثيفة بما فيه الكفاية لعقد PCLS أسفل في ظروف الأنسجة الثقافة.
5. ماصة بلطف مصفوفة لخلط، وماصة بعناية على رأس PCLS، والتأكد من أن الجل يذهب على رأس لونانوغرام شريحة، وأن شريحة لا تطفو على أعلى من هلام. هلام يجب أن تعمل بمثابة الوزن، وترسيخ PCLS أسفل على الجزء السفلي من لوحة.
6. نقل بعناية ساترة غرف ل37 ° C حاضنة والسماح للمصفوفة ترسيخ ب ~ 5 دقائق.
7. نقل ساترة تشامبيريد كامل على مرحلة ما قبل تحسنت المجهر متحد البؤر. الحفاظ على غرفة في 37 ° C طوال التصوير. ليس مطلوبا CO ₂ العرض خلال حضانة الخلية عند استخدام المتوسطة يبوفيتش.
8. تعيين نطاق مجموعة ض المكدس والبلاط واستنادا إلى الفاصل الزمني المطلوب بين الإطارات. عند عرض تحت المجهر متحد البؤر، واستخدام الهدف 20X (انظر قائمة المواد). استخدام أداة "البلاط" للدلالة على المنطقة من الاهتمام في الأنسجة، وذلك باستخدام "شبكة محورها" إعداد (على سبيل المثال، وهو 2X2 تركز الشبكة).
9. أثناء إعداد مجموعة ض المكدس، تحقق في مجالات متعددة من شريحة التي يتراوح مجموعة مناسبة.
   ملاحظة: ZRوانجى على الأرجح يساوي سمك الأنسجة. كل الرئة هي فريدة من نوعها ويجب تعديلها إعدادات كل تجربة. والبلاط 2X2 و 10 مداخن ض ينتج بصفة عامة ~ 1 إطار / 2 دقيقة. تأكد من تشغيل وظيفة التركيز التلقائي قبل بدء التجربة للحد س ص و z العائمة خلال فترة التصوير.

النتائج

لتحديد الموقع من مجموعتين فرعيتين DC، CD11b جان تنمية المجتمعات المحلية ^مرحبا وCD103 ⁺ جان تنمية المجتمعات المحلية، PCLS من C57BL / 6 الفئران قطعت وملطخة الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (MABS) محددة لCD11c و، CD88، CD103، وCD324 (E-كادهيرين). يتم عرض الأجسام المضا?...

Discussion

وقد تم تطوير هذا البروتوكول هو موضح هنا أصلا لتصور مواقع اثنين من مجموعات فرعية من جان تنمية المجتمعات المحلية داخل الرئة. ومع ذلك، هذا البروتوكول يمكن تكييفه بسهولة لدراسة العديد من أنواع مختلفة من الخلايا، مع الحفاظ على سلامة الخلية والهندسة المعمارية ثلاثية الأب...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	000664
Prox1-TdTomato transgenic mice	Jackson Laboratory	018128	B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J
OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice	Jackson Laboratory	004194, 016617	B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J
Rag1 knock-out mice	Jackson Laboratory	002216	B6.129S7-Rag1tm1Mom/J
Ovalbumin, Low Endo, Purified	Worthington Biochemical Corporation	LS003059
Lipopolysaccharides from Escherichia coli	Sigma-Aldrich Co.	L2630-25MG
Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft	BD Diagnostic Systems	427421	0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter
GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose	BioExpress	E-3112-125	2% solution dissolved in PBS at 70 °C and held at 40 °C.
Compresstome VF-300	Precisionary Instruments, Inc.	VF-300
Double Edge Stainless Razor Blade	Electron Microscopy Sciences	72000	Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung.
Krazy Glue All Purpose Instant Gel	VWR	500033-484	Commonly available for $3/tube in local drugstores
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red	ThermoFisher Scientific	21083027
Normal Rat Serum (NRS)	Jackson ImmunoResearch Inc.	012-000-120
Normal Mouse Serum (NMS)	Jackson ImmunoResearch Inc.	015-000-120
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03HI
Staining Buffer	Made in House	N/A	PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4
Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies)	Made in House	N/A	Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2
Anti-mouse CD11b eFluor 450	eBioscience	48-0112-80	Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70)
Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605	BioLegend	101237	Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70)
Anti-mouse CD11c Phycoerythrin	eBioscience	12-0114-82	PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418)
Anti-mouse CD11c Allophycocyanin	BD Phamingen	550261	APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3)
Anti-mouse CD88 Phycoerythrin	BioLegend	135806	PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70)
Anti-mouse CD103 Allophycocyanin	eBioscience	17-1031-82	Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7)
Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450	eBioscience	48-0902-82	Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1)
Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin	eBioscience	17-1721-82	Anti-mouse CD172a APC (clone: P84)
Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421	BD Horizon	564188	BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4)
Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488	eBioscience	53-3249-82	Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1)
Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647	eBioscience	51-3249-82	Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1)
Glass Bottom Microwell Dishes 35 mm petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 coverglass	MatTek Corperation	P35G-1.5-14-C
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	ThermoFisher Scientific	155411PK	Pack of 16
15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness	MatTek Corperation	PCS-1.5-15
Bare Platinum Wire	World Precision Instruments	PTP201	0.020" (0.5 mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an "L" shape
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher Scientific	P36934	Keep at 4 °C, warm to room tempterature before use.
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free	Corning	356231
Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope	Carl Zeiss		Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss)
Plan-Apochromat 20X/0.8 M27 objective lends	Carl Zeiss	420650-9901-000