精密カットライブ肺樹状細胞を可視化するために、マウスの肺スライスを

要約

我々は、精密カット肺スライス（PCLS）を生成し、肺における種々の免疫細胞型の局在を可視化するために、それらを免疫染色するための方法を記載しています。我々のプロトコルは、種々の条件下で多くの異なる細胞型の位置と機能を可視化するために拡張することができます。

要約

アレルゲンおよび病原体を吸入すると、肺の免疫細胞型の様々な複数の変更を誘発します。フローサイトメトリー、免疫細胞上の細胞表面タンパク質の定量分析のための強力な技術であるが、それは、肺内のこれらの細胞の局在および移動パターンに関する情報を提供しません。同様に、走化性アッセイは、in vitroで走化性因子に応答する細胞の可能性を研究するために行うことができますが、これらのアッセイは、完全な肺の複雑な環境を再現していません。これらの前述の技術とは対照的に、肺内の個々の細胞型の位置は、容易に商業的に入手可能な、蛍光タグ付けされた抗体を用いてそれらを染色し、精密カット肺スライス（PCLS）を生成し、共焦点顕微鏡により断面を可視化することにより可視化することができます。 PCLSは生きと固定の両方の肺組織に使用することができ、スライス全体ローブの断面と同じ大きさの領域を包含することができます。我々正常樹状細胞、マクロファージ、好中球、T細胞及びB細胞の異なるタイプ、ならびにリンパ管などの構造細胞、内皮を含む肺における細胞型の多様な位置を視覚化するためにこのプロトコルを使用している、および上皮細胞。細胞が肺内に移動し、定常状態での炎症の間に相互作用どのようなライブ、三次元の肺組織における樹状細胞とT細胞との間のもののような細胞相互作用を視覚化する能力は、明らかにすることができます。そのようなフローサイトメトリーおよび定量的PCRのような他の処置と組み合わせて使用​​される場合したがって、PCLSは、肺のアレルギー性および炎症性疾患の基礎となる細胞事象の包括的な理解に寄与することができます。

概要

このようリポポリサッカライド（LPS）などの炎症誘発性刺激の吸入後、への免疫細胞の協調運動は内、および肺から、そこにあります。例えば、好中球が急速に肺実質や気道に動員されます。また、従来の樹状細胞（cDCを）として知られているいくつかのプロフェッショナル抗原提示細胞は、比較的複雑な移行パターン^1,2を受けます。 cDCを、表面マーカーのCD11cのそれらの表示に部分的に基づいて、フローサイトメトリーを用いて同定することができます。 DCの異なるサブセットは、CD103とのCD11b ³の差動表面発現によって区別することができます。吸入抗原を取得すると、いくつかのcDCを、肺を出て、それらが抗原特異的T細胞⁴にペプチドを提示する場合、肺流入領域リンパ節（LNS）にリンパ管を通って移動します。これは、適応免疫Rの開始における重要な初期のイベントでありますesponses。理由は不明であるが、しかし、吸入抗原を獲得していないすべてのcDCを、肺を残し、そしてこれらの細胞の多くは、数ヶ月^5、6のためにその器官にとどまります。単球由来のCD11c ⁺ケモカイン受容体CCR7を欠く細胞は、地域のLN ^7,8に移行することができないので、この観察は、部分的に、これらの細胞の発達祖先によって説明することができます。 cDCをの移行の可能性はまた、肺内でのそれらの解剖学的位置によって、少なくとも部分的に決定される可能性が高いようです。しかし、肺におけるcDCを、これらの異なる集団の正確な位置は、完全に特徴付けされていません。肺内、およびそれを指示する分子の免疫細胞局在の改善知識は、肺の免疫系が活性化する方法をよりよく理解するために必要とされています。

PCLSが増加していますLY肺アーキテクチャ^9、10の構造的完全性を維持しながら、細胞の位置決めおよび細胞-細胞相互作用を可視化するためのex vivoアプローチとして使用。 PCLSは、マウスを含む多くの種の肺、ウシ、サル、羊、馬、そして人間^11を研究するために使用されています。この技術の主な利点は、約20スライスは、それによって個々の実験に必要な動物の数を減少させる、マウス肺の単一葉から調製することができることです。事実上すべてのDC、マクロファージ、好中球、およびT細胞を含む免疫細胞の種類は、PCLS中に存在し、彼らの正常な構造を維持します。

PCLSはまた、アセチルコリン¹²またはメタコリン¹³で処理した後カルシウムシグナル伝達および気道平滑筋細胞の収縮性を研究するために使用することができます。このアプローチでは、肺の小部分のみです微視的alyzed、しかし、1つの研究では、PCLSにおける気道収縮の測定はスライスするスライスから約10％しか変動し、この変動がそのまま動物における肺機能検査^14を使用して見られるものに匹敵することを報告しました。他の研究者らは、LPS ¹⁵とのインキュベーション後にサイトカイン発現および細胞表面マーカーの変化を研究するためのex vivoアプローチとしてPCLSを使用しています。 PCLSも小さいイントラ腺房動脈における低酸素性肺血管収縮のex vivoモデルにおいて使用されてきました。これらの血管は、動脈切開セグメントまたは胸膜下容器¹⁶の分析からの記録を含む他の手順を使用して到達できない肺の一部に配置されています。私たちの研究室では、主に、定常状態でのライブ肺組織中の免疫細胞の局在を可視化するためにPCLSを使用し、in vivoでの炎症性刺激を以下ました。次のように我々はこのために開発した手順があります。

プロトコル

このホワイトペーパーで説明する動物実験手順はNIEHS動物実験委員会（IACUC）によって承認されました。

1.肺の調製

1. 施設内動物管理使用委員会によって提供されたガイドラインに従い、特定病原体フリーの条件で生後6と12週の間にハウスマウス。
   注：画像形成されたマウスは、各研究者の特定の興味に応じて、ナイーブ、または治療のいずれかになります。ここでは、50μLの総容量でビヒクルとしてリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて、ナイーブマウスおよび100μgの卵白アルブミン（OVA）及び0.1μgのリポ多糖（LPS）で処置したマウスにおける免疫細胞局在化を記載しています。 oropharyngeally気道にOVA / LPSを植え付けるために、動物をイソフルラン吸入によって麻酔し、垂直にゴムバンドと、その歯によって懸濁させました。舌を穏やかに鉗子で把持し、嚥下を防ぐために、一方の側に保持され、そして50＆＃ました181;以前に^17を説明したように、口腔の奥で堆積OVA / LPS溶液のL。
2. ペントバルビタールナトリウム（100mg / kg）の腹腔内注射でマウスを安楽死させる、およびポリスチレンベースに動物を固定します。
3. ジョーに腹部までの途中から皮膚および腹膜を切断することによりハサミで腹腔を開きます。鉗子やハサミの鈍いエッジに脇腸を引き、離れて肺から血液を排出するために下大静脈を切り取ります。肺を切断しないように注意しながら、胸郭の膨張を可能にするために、はさみの鋭い先端を有する隔膜を穿刺します。
4. クリア唾液腺や組織をつかみ、手動ピンセットで根本的な気管からそれを離れて引いて離れて気管から他の組織。 TRAかかわらず、すべての方法をカットしないように注意しながら、細かいピンセットやハサミを使用して、軟骨の最も厚いバンドの前方側の気管に小さな切開を行いますCHEA。切開は20 G針を通過させるのに十分なだけ大きくなります。
5. 針の端を越えてチューブの約1cmを残し、ポリエチレンチューブのセクションに1.5インチ、20 G針をスライド。 、端部を面取り1mLのシリンジに針を取り付け、針を介して暖かい（40℃）、2％低融点アガロースアップ0.8mLのを描くことによって、シリンジをロードするために、約45°の角度でチューブを切断します。
6. 気管の切開部にチューブの端に置き、ゆっくりと肺にアガロースを注入。針や注射器を移動させることなく、針が気管に残るを保証するために、ポリスチレンベースにシリンジをテープ。
   注：注射後、肺は胸の中大きく膨らんだことになります。右のローブは、まず左葉を展開します。唯一のローブは拡大した場合、針は（気管支を過ぎて）あまりにも深く挿入されている、少し先に進む前に、それを引き出すことが必要であろう。のこの部分アガロースが固化を開始する前の手順では、比較的速やかに行う必要があります。
7. ベースとは少なくとも10分間、低温室又は冷蔵庫内、気管に挿入シリンジを用いて、マウスを置きます。必要であれば、動物は、ビデオ顕微鏡によって画像の細胞遊走に進む場合でも、数時間までそこに保つことができます。
8. マウスは寒いしたら、慎重にハサミを用いてアガロース-膨張肺を切除し、氷冷PBSで3センチの皿に置きます。氷の上に保管してください。
9. 組織スライスのために所望の葉（ 例えば 、右上葉）を選択します。肺の内側部分は、（それが気管に接続されている箇所）皿に下向きであることを確認してください。
   注：プランジャに使用ローブとその向きが見えるようになり血管及び気道の大きさを決定します。ここで説明するの向きは、大きな気道の可視化、および実質のために理想的です。マウスは、一つの大きな左葉と右の4つの小さなローブを持っています。ためにそれは便利なサイズであるためだけでなく、吸入剤がその中に均一に分散するので、口腔咽頭または鼻腔吸引を介して肺へのアレルゲンの導入後PCLSイメージングは​​、右上葉は、典型的には部分的に切断されます。しかし、他のローブ、特に左葉には、また、研究することができます。マウス系統または治療を比較するとき、同じ葉を比較することが重要です。

2.肺スライス

注：製造元の指示に従って、自動化されたスライサー、金属冷却ブロック、プランジャと金属注射器を使用してスライスを作成します。

1. プランジャー上に万能の小滴、無ランゲル瞬間接着剤を入れて、接着剤は、金属注射器の側面に触れないように注意しながら、円を描くように接着剤を広げます。接着剤が注射器の側面に触れた場合、それは一緒にシリンジプランジャーを接着します。
2. すぐに接着剤でプランジャーをカバーした後、そっと握りますダウン気管側をピンセットで摘出したローブは、過剰な液体を除去し、慎重にプランジャーの上に配置する組織でそれを軽くたたきます。プランジャの端を越えて延びる余分な組織を切り落とします。
3. 金属シリンジの側面が上に移動し、組織の上になるように作成、ダウンプランジャを移動させるだけでなく深い数センチメートルを超えない、底部に接着肺。場所にこの位置を保持する金属製の注射器の下部の周りにテープ。
4. それだけ葉の上部を覆うように注意深くウェルに40℃で2％低融点アガロースを注ぎます。
5. 氷冷冷却ブロックと金属シリンジを包囲し、1葉およびアガロース冷却 - 2分。
   注：周囲組織アガロース短い時間冷却が不均一に切断PCLSをもたらす可能性がある、スライス間のアガロースの崩壊につながる可能性があります。
6. 自動化されたスライサに検体シリンジをロードし、氷冷PBSでバッファータンクを埋めます。揃え検体シリンジでモータ駆動ステップと底部からテープ片を除去します。ステップモータ駆動だけで、プランジャーの背面に接触するまで早送り（FF）の位置にスイッチを入れます。
7. 検体シリンジで新鮮な刃を揃えます。スライサーで組織の厚さ、連続/シングルスライス、振動や速度を設定します。例えば、組織の厚さ：150ミクロン、連続切削（続き）、発振：9、及び速度：3 - 4.開始。上記の設定は、特定の自動化されたスライサーの仕様に調整する必要があります。
8. 彼らは、バッファタンク内に落下し、氷冷PBSを含む24ウェルプレートに置くように薄いへら又は絵筆を使用して、一度にPCLSものを集めます。
   注：これは、実験の間の一貫性を維持するために、スライスを維持することが重要です。すべての肺は、年齢、性別および体重に応じて異なるが、10 ^{番目のスライス}は、例えば、一般的に同様のサイズの気道をもたらします。

ove_title "> 3。抗体染色

1. 考慮電位蛍光スペクトルの重なりと顕微鏡の検出能力を取って、目的の細胞型に基づいて、蛍光タグ付き抗体のパネルを設計します。
   注：以下のような例として、DCサブセットを検出するためのパネルである：のCD11c /アルファXインテグリン - BrilliantViolet（BV）605（励起：405nmでピーク発光：605 nm）を、CD324 / E-カドヘリン - アレクサ488（AF488 ）（励起：488nmのピーク発光：519 nm）を、CD88 / C5Ra1 - フィコエリトリン（PE）（励起：561 nmで、ピーク発光：578 nm）を、CD103 /アルファEインテグリン - アロフィコシアニン（APC）（励起：633nmの、ピーク発光：660nmで）。蛍光スペクトルビューアーツールは、（物質一覧を参照）のパネルを設計するのに有用です。
2. 所望の抗体を含む抗体カクテルを作ります。
   1. 静的PCLSイメージングのために、1.5 mLのmicrocentrifu 800μL染色バッファー、100μLフク・ブロッカー、50μLの正常マウス血清、および50μL正常ラット血清を追加1 mLの総容量のためgation管。生細胞イメージングのため、代わりに染色緩衝液の10％FBS（リーボビッツ-10）を含有する800μLリーボビッツ培地（1X）を使用します。
   2. 各抗体の所望の最終濃度を調整するために抗体を加えます。 3センチメートル皿に抗体溶液を移し、使用する準備ができるまで暗所に保管してください。
      注：（ - 5μg/ mlの通常1）の最終濃度は、個々の抗体のために最適化される必要があります。
3. このような大規模な気道または肺の周辺のような関心の解剖学的領域とPCLSを選択し、1 mLの抗体溶液を含有する3 cmのディッシュに入れます。
4. 30または60分間ゆっくりとロッキング氷上で暗闇の中でステインPCLS、、。
5. 静的PCLSイメージングのため、セクション5に進んで、生細胞イメージングのため部4に進んでください。

PCLS 4.静的イメージング

1. 抗体とPCLSの60分間のインキュベーション後、T皿から抗体溶液を除去し、リンス彼は、1 mLの氷冷PBSで二回スライス。
2. 3センチメートル丸ガラス底の皿にピペットで50μLのPBS。スパチュラ又は絵筆を使用して、ドロップに染色PCLSを転送する、それが平坦になるまで穏やかにスライスを操作すると広がります。ピペットでPBSを削除します。スライスは、できるだけ平らにする必要があります。上記の手順は、光退色を避けるために、迅速に実行する必要があります。
3. スライス上に室温封入剤1滴を置き、静かにプレートのウェルにカバーガラスをドロップ。イメージングの前に時間まで4℃で暗所にPCLSを保管してください。
4. 共焦点顕微鏡下で見たときに、（ 材料のリストを参照）20X対物レンズを使用します。 「凸包」設定で組織のエッジを見つけてマークする「タイル」ツールを使用してください。これは、タイルスキャンの時間を減らすのに役立ちます。
5. zスタック範囲を設定して、特にエッジに沿って、スライスの複数の領域で確認し、設定された範囲であることが適切です。
   注：完全に平らにするための組織を得ることは非常に困難であるため、Z-範囲は、おそらく組織自体の厚さよりも大きくする必要があります。スライスにおけるバンプと曲線を収容するために250ミクロン - 例えば、厚さ150μmPCLSと、zスタックの範囲は、おそらく200に設定する必要があります。 20X対物レンズを用いて12時間 - Zスタックの範囲と組織の大きさに応じて、各フル肺スキャンは7との間がかかります。それぞれの肺は一意であり、設定はすべての実験のために調整しなければなりません。

PCLS 5.ライブセルイメージング

1. 抗体とPCLSの30分間のインキュベーション後、皿から抗体溶液を除去し、1mLの冷リーボビッツ-10で二回スライスをすすぎます。
2. チャンバーカバーガラス（8つのスロット）のいずれかのスロットに新鮮な50μLリーボビッツ-10ピペット。 、メディアにPCLSを転送するためにヘラを使ってスライスが平らになるまでゆっくりと操作して広がります。上記の手順光退色を避けるために迅速に実行する必要があります。
3. ピペットを用いて50μL媒体を削除します。スライスは、できるだけ平らにすることです。
   注：スライスのエッジは、チャンバの壁に対して垂直に跳ね上げている場合、それが許容されます。また、可能な場合、金属白金の量は、次のステップに進む前に、スライスを固定するために使用することができます。小さな重みに切断し、曲げることができる白金線の一例として添付資料の一覧を参照。
4. 4℃の低温室では、因子低減成長、100μLリーボビッツ-10フェノールレッドを含まない細胞外マトリックスの100μLを混合します。このため、予冷ピペットチップを使用し、または細胞外マトリックスは、先端に固化します。
   注：マトリックス及び培地のこの比率（1：1）組織培養条件下でPCLSを押したままにするのに十分稠密なゲルを生成します。
5. 穏やかに混合するために行列をピペット、そして慎重にゲルがLUの上に行くことを確認し、PCLSの上にピペットスライスをngの、そしてスライスは、ゲルの上に浮き上がらないこと。ゲルは、プレートの底にダウンPCLSを固定、重みとして働くべきです。
6. 慎重に37℃のインキュベーターにチャンバーカバーガラスを転送し、マトリックスは、約5分間固化しましょう。
7. 共焦点顕微鏡の予め温めたステージ上に全体的チャンバカバーガラスを転送します。イメージングを通して37℃でチャンバを維持します。ライボビッツメディアを使用するときにCO ₂供給は、細胞のインキュベーション中に必要とされていません。
8. フレーム間の所望の間隔に基づいてZスタック範囲およびタイル範囲を設定します。共焦点顕微鏡下で見たときに、（材料のリストを参照）20X対物レンズを使用します。 （ 例えば 、2x2の中心グリッド）「を中心とグリッド」の設定を使用して、組織内の関心領域を示すために、「タイル」ツールを使用してください。
9. zスタック範囲を設定して、設定された範囲が適切であるスライスの複数の領域で確認。
   注：ZRANGEは、組織の厚さを等しくする可能性があります。それぞれの肺は一意であり、設定はすべての実験のために調整しなければなりません。 2×2のタイル10のzスタックは、一般的に/ 2分〜1つのフレームをもたらすであろう。オートフォーカス機能は、撮像期間中に、XYおよびZドリフトを最小限に抑えるために、実験を開始する前に活性化されていることを確認します。

結果

C57BL / 6マウス由来の2つのDCサブセットの位置、のCD11b ^HI cDCを及びCD103 ⁺ cDCを、PCLSを識別するために切断およびCD11cに特異的なモノクローナル抗体（mAb）で染色し、CD88、CD103、およびCD324（Eカドヘリン）。 CD324染色気道上皮細胞に対する抗体、およびCD88は、マクロファージおよび好中球ではなく、cDCを⁸に表示されます。これは、私た?...

ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、もともと肺内cDCをの2つのサブセットの位置を視覚化するために開発されました。しかしながら、このプロトコルは、容易に細胞の生存率および肺の三次元構造を維持しながら、多くの異なる細胞型を研究するために適合させることができます。後者の特徴は、細胞培養システムを超える重要な利点であり、希少細胞タイプの識別を容易にします。この方法は、...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	000664
Prox1-TdTomato transgenic mice	Jackson Laboratory	018128	B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J
OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice	Jackson Laboratory	004194, 016617	B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J
Rag1 knock-out mice	Jackson Laboratory	002216	B6.129S7-Rag1tm1Mom/J
Ovalbumin, Low Endo, Purified	Worthington Biochemical Corporation	LS003059
Lipopolysaccharides from Escherichia coli	Sigma-Aldrich Co.	L2630-25MG
Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft	BD Diagnostic Systems	427421	0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter
GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose	BioExpress	E-3112-125	2% solution dissolved in PBS at 70 °C and held at 40 °C.
Compresstome VF-300	Precisionary Instruments, Inc.	VF-300
Double Edge Stainless Razor Blade	Electron Microscopy Sciences	72000	Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung.
Krazy Glue All Purpose Instant Gel	VWR	500033-484	Commonly available for $3/tube in local drugstores
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red	ThermoFisher Scientific	21083027
Normal Rat Serum (NRS)	Jackson ImmunoResearch Inc.	012-000-120
Normal Mouse Serum (NMS)	Jackson ImmunoResearch Inc.	015-000-120
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03HI
Staining Buffer	Made in House	N/A	PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4
Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies)	Made in House	N/A	Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2
Anti-mouse CD11b eFluor 450	eBioscience	48-0112-80	Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70)
Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605	BioLegend	101237	Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70)
Anti-mouse CD11c Phycoerythrin	eBioscience	12-0114-82	PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418)
Anti-mouse CD11c Allophycocyanin	BD Phamingen	550261	APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3)
Anti-mouse CD88 Phycoerythrin	BioLegend	135806	PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70)
Anti-mouse CD103 Allophycocyanin	eBioscience	17-1031-82	Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7)
Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450	eBioscience	48-0902-82	Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1)
Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin	eBioscience	17-1721-82	Anti-mouse CD172a APC (clone: P84)
Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421	BD Horizon	564188	BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4)
Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488	eBioscience	53-3249-82	Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1)
Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647	eBioscience	51-3249-82	Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1)
Glass Bottom Microwell Dishes 35 mm petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 coverglass	MatTek Corperation	P35G-1.5-14-C
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	ThermoFisher Scientific	155411PK	Pack of 16
15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness	MatTek Corperation	PCS-1.5-15
Bare Platinum Wire	World Precision Instruments	PTP201	0.020" (0.5 mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an "L" shape
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher Scientific	P36934	Keep at 4 °C, warm to room tempterature before use.
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free	Corning	356231
Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope	Carl Zeiss		Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss)
Plan-Apochromat 20X/0.8 M27 objective lends	Carl Zeiss	420650-9901-000