精密切割的小鼠肺切片可视化现场肺树突状细胞

摘要

我们描述了用于产生精密切割肺片（PCLS）和免疫它们以显现各种免疫细胞类型的定位在肺中的方法。我们的协议可以扩展在各种条件下可视化的位置和许多不同细胞类型的功能。

摘要

过敏原和病原体的吸入引起的各种肺免疫细胞类型的多个变化。流式细胞术是用于在免疫细胞上的细胞表面蛋白的定量分析的强大技术，但它提供对肺中这些细胞的定位和迁移模式的信息。类似地，趋化实验可以被执行以研究细胞的潜力， 在体外趋化因子反应，但是这些测定法不再现完整肺的复杂的环境。相对于这些前述技术中，肺中的个别细胞类型的位置可以容易地通过产生精确切割肺片（PCLS）中，用商购的，荧光标记的抗体染色它们，并通过共聚焦显微镜可视化部分可视化。 PCLS可以用于活的和固定的肺组织，和片可以涵盖区域一样大的整个叶的横截面。我们已经使用该协议成功地可视化的各种各样的肺细胞类型，包括不同类型的树突状细胞的巨噬细胞，嗜中性粒细胞，T细胞和B细胞，以及结构的细胞，例如淋巴，内皮的位置，和上皮细胞。可视化细胞相互作用，如树突状细胞和T细胞，在活的，三维的肺组织之间的能力，可以揭示细胞肺内如何移动，并与在稳定状态下和在炎症期间彼此相互作用。因此，与其他的方法，例如流式细胞术和定量PCR组合使用时，PCLS可以向背后肺的变应性和炎症性疾病的细胞事件的全面理解。

引言

以下促炎性刺激物的吸入，如脂多糖（LPS），有免疫细胞的协调运动成，内，并从肺。例如，嗜中性粒细胞迅速募集至肺实质及气道。此外，被称为常规树突细胞（cDC上）的一些专门的抗原呈递细胞进行相对复杂的迁移模式^1，2。 cDC上可以使用流式细胞术来鉴定，部分地基于它们的表面标记的显示，CD11c的上。 DC的不同子集可以通过CD103和CD11b ³的差动表面表达来区分。当获取吸入抗原，一些cDC上退出肺并通过淋巴管迁移到肺引流淋巴结（LN中），其中它们呈现的肽抗原特异性T细胞^4。这是在适应性免疫R的起始的关键早期事件esponses。不知什么原因，然而，并非收购吸入抗原所有cDC上离开肺，和许多这些细胞保持在该机构数月^5，6。该观察可以通过将这些细胞的发育祖先可以部分地解释，因为单核细胞衍生的CD11c ⁺缺乏趋化因子受体，CCR7的细胞，无法迁移到区域性淋巴结^7,8。这很可能是疾病预防控制中心迁移潜力还确定，至少部分地由肺内的解剖位置。然而，在肺cDC上的这些不同的群体的精确定位不是完全表征。免疫细胞定位的肺中，并引导其分子的一种改进的知识，是需要更好地了解肺的免疫系统变得如何激活。

PCLS正在增加LY用来作为显现细胞的定位和细胞-细胞相互作用的离体方法中，同时维持肺结构^9，10的结构完整性。 PCLS已用于研究许多物种，包括老鼠，牛，猴，羊，马和人¹¹的肺。该技术的主要优点是，大约20片可以从小鼠肺的单个叶来制备，由此减少所需要的个体实验动物的数量。实际上，所有的免疫细胞类型（包括DC），巨噬细胞，中性粒细胞和T细胞，存在于PCLS和维持其正常结构。

PCLS也可以用来研究钙信号传导与气道和平滑肌细胞收缩与乙酰胆碱¹²或乙酰甲胆碱¹³处理之后。在这种方法中，只有肺的一小部分是一个微观alyzed，但一个研究报告指出，在PCLS气管收缩的测量从片仅改变约10％至切片，并且该差异是比得上在完整动物¹⁴使用肺功能测试看出。其他研究者使用PCLS作为离体方法用LPS ¹⁵温育后，研究在细胞因子的表达和细胞表面标志物的变化。 PCLS也已在小腺泡内动脉缺氧性肺血管收缩的离体模型中使用。这些容器位于不能使用其它的程序，包括从解剖动脉区段或胸膜下的血管¹⁶的分析记录到达肺的一部分。我们的实验室已主要用于PCLS可视化在稳定状态中活肺组织免疫细胞定位和以下的体内炎症刺激。这些都是我们的这个发展的过程如下。

研究方案

本文中所描述的动物实验过程由NIEHS动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1.肺制备

1. 6和12周龄无特定病原体条件之间家鼠按照机构动物护理和使用委员会提供的指导原则。
   注:成像小鼠可以是天真的，或经处理的，这取决于每个研究人员的具体利益。在这里，我们描述了在天真的小鼠和在用100μg卵清蛋白（OVA）和0.1微克的脂多糖（LPS）处理的小鼠中的免疫细胞定位，使用磷酸盐缓冲盐水（PBS）在50微升的总体积的车辆。到oropharyngeally灌输OVA / LPS进入气道，将动物用异氟烷麻醉，吸入并通过用橡胶带齿垂直悬挂。舌头轻轻地用钳子抓住并持有偏向一侧，防止吞咽和50＆＃181;保藏在口腔后部的OVA / LPS溶液的L，以先前描述的^17。
2. 安乐死用戊巴比妥钠（100毫克/千克）的腹膜内注射小鼠，并钉住动物对于聚苯乙烯基。
3. 通过从腹部到颚的中间切开皮肤和腹膜打开用剪刀腹腔。用钳子或剪刀的钝边一边拉肠，和剪断下腔静脉从肺部排出血液程。穿刺用剪刀的尖端隔膜以允许所述左肋膨胀，小心不要切断肺部。
4. 清除唾液腺和通过抓住组织并手动从与钳子底层气管拉动远离其它组织从气管程。使使用细镊子或剪刀软骨厚带的前侧气管一小切口，小心不要一路砍虽然TRA谢。该切口将只是大到足以让一个20号针通过。
5. 滑动的1.5英寸，20号针上的聚乙烯管的截面，留下约1cm管超过针的端部。切管以大约45°的角度通过拉伸0.8毫升热水（40℃）2％低熔点琼脂糖向上穿过针斜面端部，附接针1mL注射器，并加载注射器。
6. 将管的一端插入气管的切口，并缓缓注入琼脂糖进入肺部。而无需移动针或注射器，用胶带将注射器的聚苯乙烯基础，以确保针头留在气管中。
   注意:注射后，肺部将胸腔内较大和充气。右叶首先展开，然后左叶。如果只有一个叶扩大，针已经插入过深（过去支气管），而且有必要在继续之前把它拉出来咯。的这部分过程需要相对较快地完成，琼脂糖开始凝固之前。
7. 将鼠标，与基座和在气管仍插注射器，在冷室或冰箱中至少10分钟。如果有必要，动物可以在那里保存长达几个小时，即使通过视频显微镜在进行图像细胞迁移。
8. 一旦鼠标是冷的，用剪刀仔细切除琼脂糖充气肺，并将它们放置在一个3 cm培养皿用冰冷的PBS。在冰上保持。
9. 选择用于组织切片所需的波瓣（ 例如 ，右上叶）。确保肺（它连接到气管）的内饰部分是面朝下的菜。
   注:所用的叶和活塞上的取向将决定血管和气管，这将是可见的大小。这里所描述的方位非常适合大型航空公司的可视化和实质。老鼠有一个大的左叶和右四个小瓣。对于以下介绍过敏原成通过口咽或鼻内抽吸肺PCLS成像，右上叶通常剖开，部分是因为它是一种方便的大小，而且还因为吸入剂在其内均匀地分散。然而，其他叶，尤其是左叶，也可以研究。当比较小鼠品系或治疗，它可以比较同叶是很重要的。

2.肺切片

注意:请用自动切片机，金属冷却块，柱塞和注射器金属片，根据制造商的说明。

1. 放的所有目的的小滴，没有润凝胶强力胶到柱塞和散布胶水的圆周运动，同时注意不要让胶水接触金属注射器的侧面。如果胶水接触到注射器的两侧，将胶针筒和柱塞在一起。
2. 覆盖用胶水活塞后，立即轻轻抓住用与气管侧朝下钳子切叶，DAB它上的组织，以除去过量的液体，然后小心地将其放置在柱塞的顶部。剪掉延伸超出所述柱塞的边缘的任何额外的组织。
3. 向下移动柱塞，使得金属注射器的侧面向上移动，并通过组织，从而形成井在底部胶合，不超过几个厘米深肺。周围的金属注射器的底部胶带举行的地方这个位置。
4. 小心倾2％低熔点琼脂糖在40℃下到井中以便它只是覆盖波瓣的顶部。
5. 包围与冰冷的冷却块中的金属注射器和冷却叶和琼脂糖为1 - 2分钟。
   注:周围组织中的琼脂糖的更短的时间冷却可以切片，这可能会导致切割不均匀PCLS期间导致琼脂糖的崩解。
6. 加载样品注射器到自动限幅器和填充用冰冷的PBS缓冲罐。对齐步骤与试样注射器马达驱动，并从底部移除胶带片。转切换到快进（FF）的位置，直到所述步进电机驱动器刚好接触到柱塞的背面。
7. 对齐与样品注射器新的刀片。集合组织厚度，连续/单切片，振荡和速度在限幅器。例如，组织厚度:150微米，连续切削（续），振荡:9，和速度:3 - 4.按开始。通过以上的设置需要调整到特定的自动切片机规格。
8. 使用薄的抹刀或画笔，收集PCLS一次一个，因为它们落入缓冲罐和将它们放置在含有冰冷的PBS 24孔板中。
   注:保持片，以保持实验之间的一致性是非常重要的。虽然每个肺是根据年龄，性别和重量不同，则10 ^个切片，例如，通常能产生类似大小的气道。

ove_title"> 3。抗体染色

1. 设计基于对感兴趣的细胞类型的荧光标记抗体的面板中，考虑到潜在的荧光光谱重叠和显微镜的检测能力。
   注意:作为一个例子，对于DC子集检测一个面板是如下:的CD11c /α-X整 - BrilliantViolet（BV）605（激发:405纳米，峰值发射:605纳米），CD324 / E-钙粘蛋白 - 的Alexa 488（AF488 ）（激发:488纳米，峰值发射:519纳米），CD88 / C5Ra1 - 藻红蛋白（PE）（激发:561纳米，峰值发射:578纳米），CD103 /α-ë整 - 别藻蓝蛋白（APC）（激发:633纳米，峰值发射:660纳米）。荧光光谱查看器工具（参阅材料清单）是设计的面板非常有用。
2. 使含有所需抗体的抗体混合物。
   1. 对于静态PCLS成像，添加800μL的染色缓冲液，100微升弗克·布洛克，50μL正常小鼠血清，和50μL正常大鼠血清到1.5mL microcentrifugation管1毫升的总体积。活细胞成像，使用含有10％FBS（的Leibovitz-10）代替染色缓冲液800μL的Leibovitz培养基（1×）。
   2. 添加抗体来调节每种抗体的所期望的终浓度。转移抗体溶液到3cm的盘，并保持在黑暗中待用。
      注:（ - 5微克/毫升通常1种）的最终浓度需要为每个单独的抗体进行优化。
3. 选择与所述兴趣，如大气道或肺的周围的解剖区域中的PCLS，并在含有1种毫升抗体溶液中的3-cm培养皿放置。
4. 污点PCLS在黑暗中，在冰上，慢慢摇动30或60分钟。
5. 对于静态PCLS成像，进行到该部分4。对于活细胞成像，则继续执行第5节。

4. PCLS的静态影像

1. 后用抗体PCLS的60分钟温育后，除去从培养皿抗体溶液和冲洗吨他用1个毫升冰冷的PBS切片两次。
2. 移液管加入50μLPBS涂到3厘米的圆形玻璃底培养皿中。使用刮刀或画笔，染色PCLS转移到滴，轻轻操纵切片，直到它是平坦的并且展开。用吸管取出PBS。切片应位于尽可能平坦。上述程序需要快速执行，以避免光漂白。
3. 放置室温下的安装介质1滴置于该片中，轻轻地滴在玻璃盖玻片到板的孔中。保持PCLS在黑暗中在4℃下最多成像前一个小时。
4. 当共焦显微镜下观察，使用20X物镜（参见材料列表 ）。使用"瓦片"工具中的"凸包"的设置来定位和标记组织的边缘。这将有助于减少瓷砖扫描的时间。
5. 而设置的z堆栈范围，验证在切片的多个区域，特别是沿着边缘，该组范围是合适的。
   注:Z-范围将可能需要比组织本身的厚度更大，因为它是很难得到的组织奠定完全平坦。例如，具有150微米厚的PCLS中，z堆栈范围将可能需要被设置为200 - 250微米，以适应切片凸点和曲线。取决于Z-堆叠范围和组织的尺寸，每个全肺扫描将需要7之间 - 12小时用20X物镜。每个肺是唯一的，并且设置必须进行调整，每个实验。

PCLS 5.活细胞成像

1. PCLS的30分钟温育的抗体后，从培养皿的抗体溶液中，用1毫升冷的Leibovitz-10冲洗切片两次。
2. 移液管50的新鲜的LeibovitzμL-10成一个一个腔玻璃罩（8个时隙）的时隙。用铲子将PCLS转印至介质，轻轻地操纵它，直到片是扁平的而展开。上述程序需要迅速执行，以避免光漂白。
3. 除去使用移液管的50μL的平台。切片要被躺在尽可能平坦。
   注意:如果切片的边缘抵靠腔室的壁垂直向上翻转这是可接受的。此外，如果可用的话，金属铂的重量可用于在进行下一步骤之前，以锚定条带。见所附的材料清单为铂线的一个例子，可以被切割和弯曲成小的权重。
4. 在4℃冷室中，混合100微升生长因子减少，用100μL的Leibovitz-10不含酚红的细胞外基质的。使用预冷的吸头用于此，或细胞外基质将在尖端凝固。
   注:基质和介质的这一比率（1:1）产生足够的致密保持PCLS下在组织培养条件的凝胶。
5. 轻轻吸取基质混合，并认真吸取在PCLS的顶部，确保凝胶那张露顶纳克片，并且所述片不会在凝胶的顶部上浮。凝胶应该工作作为权重，下锚定PCLS到板的底部。
6. 小心地将腔玻璃罩转移到37℃培养箱并让基质固化〜5分钟。
7. 传送整个腔室盖玻片到共焦显微镜的预热阶段。保持在整个成像37℃的室中。使用Leibovitz的介质时，不将细胞培养过程中所需的CO ₂的供应。
8. 设定基于帧之间的所需间隔的z堆栈范围和瓦范围内。当共焦显微镜下观察，使用20X物镜（参见材料列表）。使用"瓦片"工具来表示的在组织中感兴趣的区域，使用"中心网格"设置（ 例如 ，2×2网格为中心的）。
9. 而设置的z堆栈范围，验证在切片所设置的范围是适当的多个区域。
   注:ZR安格将可能等于组织的厚度。每个肺是唯一的，并且设置必须进行调整，每个实验。 2×2的瓷砖和10的z堆叠通常将导致〜1帧/ 2分钟。确保自动对焦功能开始在实验过程中成像期间以最小化的xy和z漂移之前被激活。

结果

为了识别两个DC亚群从C57BL / 6小鼠中的位置，CD11b的^喜 cDC上和CD103 ⁺ cDC上，PCLS切下并用特异于的CD11c单克隆抗体（mAb）染色，CD88，CD103，CD324和（E-钙粘蛋白）。抗体染色CD324气道上皮细胞，和CD88显示在巨噬细胞和嗜中性粒细胞，但不是cDC上^8。这使我们能够从表面CD11c ⁺巨噬细胞区分cDC上，并观察各细胞类型的气道（ 图1）

讨论

这里描述的协议最初开发可视化肺内疾病预防控制中心两个子集的位置。然而，该协议可以很容易地适合于研究许多不同细胞类型，同时保持细胞活力和肺的三维结构。后者的特征是一个重要的优点在细胞培养系统，并促进稀有细胞类型的标识。该方法依赖于从肺PCLS的产生，和抗体的适当组合，以确定特定的细胞类型，同时最小化背景染色。在很大程度上，这是一个经验的运动，因为，在其他应...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	000664
Prox1-TdTomato transgenic mice	Jackson Laboratory	018128	B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J
OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice	Jackson Laboratory	004194, 016617	B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J
Rag1 knock-out mice	Jackson Laboratory	002216	B6.129S7-Rag1tm1Mom/J
Ovalbumin, Low Endo, Purified	Worthington Biochemical Corporation	LS003059
Lipopolysaccharides from Escherichia coli	Sigma-Aldrich Co.	L2630-25MG
Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft	BD Diagnostic Systems	427421	0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter
GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose	BioExpress	E-3112-125	2% solution dissolved in PBS at 70 °C and held at 40 °C.
Compresstome VF-300	Precisionary Instruments, Inc.	VF-300
Double Edge Stainless Razor Blade	Electron Microscopy Sciences	72000	Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung.
Krazy Glue All Purpose Instant Gel	VWR	500033-484	Commonly available for $3/tube in local drugstores
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red	ThermoFisher Scientific	21083027
Normal Rat Serum (NRS)	Jackson ImmunoResearch Inc.	012-000-120
Normal Mouse Serum (NMS)	Jackson ImmunoResearch Inc.	015-000-120
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03HI
Staining Buffer	Made in House	N/A	PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4
Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies)	Made in House	N/A	Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2
Anti-mouse CD11b eFluor 450	eBioscience	48-0112-80	Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70)
Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605	BioLegend	101237	Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70)
Anti-mouse CD11c Phycoerythrin	eBioscience	12-0114-82	PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418)
Anti-mouse CD11c Allophycocyanin	BD Phamingen	550261	APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3)
Anti-mouse CD88 Phycoerythrin	BioLegend	135806	PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70)
Anti-mouse CD103 Allophycocyanin	eBioscience	17-1031-82	Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7)
Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450	eBioscience	48-0902-82	Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1)
Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin	eBioscience	17-1721-82	Anti-mouse CD172a APC (clone: P84)
Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421	BD Horizon	564188	BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4)
Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488	eBioscience	53-3249-82	Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1)
Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647	eBioscience	51-3249-82	Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1)
Glass Bottom Microwell Dishes 35 mm petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 coverglass	MatTek Corperation	P35G-1.5-14-C
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	ThermoFisher Scientific	155411PK	Pack of 16
15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness	MatTek Corperation	PCS-1.5-15
Bare Platinum Wire	World Precision Instruments	PTP201	0.020" (0.5 mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an "L" shape
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher Scientific	P36934	Keep at 4 °C, warm to room tempterature before use.
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free	Corning	356231
Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope	Carl Zeiss		Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss)
Plan-Apochromat 20X/0.8 M27 objective lends	Carl Zeiss	420650-9901-000