Precisión de corte pulmón de ratón Rebanadas para visualizar las células en vivo pulmonar dendríticas

Resumen

Se describe un método para generar la precisión de corte de pulmón rebanadas (PCLS) y la inmunotinción ellos para visualizar la localización de diversos tipos de células inmunes en el pulmón. Nuestro protocolo se puede extender a visualizar la ubicación y la función de muchos tipos celulares diferentes bajo una variedad de condiciones.

Resumen

La inhalación de alérgenos y patógenos provoca múltiples cambios en una variedad de tipos de células inmunes en el pulmón. La citometría de flujo es una técnica poderosa para el análisis cuantitativo de proteínas de superficie celular sobre las células inmunes, pero no proporciona información sobre los patrones de localización y migración de estas células dentro del pulmón. Del mismo modo, los ensayos de quimiotaxis se pueden realizar para estudiar el potencial de las células para responder a factores quimiotácticos in vitro, pero estos ensayos no reproducen el complejo entorno del pulmón intacto. En contraste con estas técnicas antes mencionadas, la ubicación de distintos tipos de células dentro del pulmón puede ser visualizado fácilmente mediante la generación de corte de precisión de pulmón rebanadas (PCLS), la tinción con anticuerpos disponibles comercialmente, marcado con fluorescencia, y la visualización de las secciones por microscopía confocal. PCLS se pueden utilizar tanto para vivir y fijan el tejido pulmonar, y las rodajas pueden abarcar áreas tan grandes como una sección transversal de un lóbulo completo. Hemos utilizado este protocolo para visualizar correctamente la localización de una amplia variedad de tipos de células en el pulmón, incluyendo distintos tipos de células dendríticas, macrófagos, neutrófilos, células T y células B, así como células estructurales tales como linfático, endotelial, y células epiteliales. La capacidad de visualizar las interacciones celulares, tales como las que existen entre las células dendríticas y las células T, en el tejido pulmonar en vivo, tridimensional, puede revelar cómo las células se mueven dentro del pulmón e interactúan uno con el otro en el estado estacionario y durante la inflamación. Por lo tanto, cuando se utiliza en combinación con otros procedimientos, como la citometría de flujo y la PCR cuantitativa, PCLS puede contribuir a una comprensión global de eventos celulares que subyacen en las enfermedades alérgicas e inflamatorias del pulmón.

Introducción

Tras la inhalación de los estímulos pro-inflamatorias tales como lipopolisacárido (LPS), hay un movimiento coordinado de las células inmunes en, dentro de, y desde el pulmón. Por ejemplo, los neutrófilos se reclutan rápidamente en el parénquima pulmonar y de las vías respiratorias. Además, algunas células presentadoras de antígeno profesionales conocidas como células dendríticas convencionales (CDC) se someten a un patrón de migración relativamente complejo ^{1, 2.} CDC se pueden identificar utilizando la citometría de flujo, basadas en parte en su pantalla del marcador de la superficie, CD11c. Subconjuntos distintos de DCs se pueden distinguir por la expresión en la superficie diferencial de CD103 y CD11b ^3. Al adquirir antígeno inhalado, algunos CDCs salen del pulmón y migran a través de los vasos linfáticos a los nodos linfáticos pulmonares de drenaje (LNS) donde presentan péptidos de antígeno específico de células T ^4. Este es un evento temprano crítico en la iniciación de r inmune adaptativaesponses. Por razones desconocidas, sin embargo, no todos los CDCs que adquieren antígenos inhalados salen del pulmón, y muchas de estas células permanecen en ese órgano durante varios meses ^{5, 6.} Esta observación puede explicarse en parte por la ascendencia de desarrollo de estas células porque CD11c derivadas de monocitos ⁺ células que carecen del receptor de quimioquinas, CCR7, son incapaces de migrar a los LN regionales ^{7, 8.} Parece probable que el potencial de migración de los CDC también está determinada, al menos en parte, por su posición anatómica dentro del pulmón. Sin embargo, la localización precisa de estas diferentes poblaciones de CDC en el pulmón no se caracteriza completamente. Un mejor conocimiento de la localización de las células inmunes en el pulmón, y de las moléculas que lo dirigen, es necesaria para una mejor comprensión de cómo se activa el sistema inmunológico del pulmón.

PCLS se están aumentandoly utiliza como un enfoque ex vivo para visualizar posicionamiento celular y interacciones célula-célula, mientras se mantiene la integridad estructural de la arquitectura pulmonar ^{9, 10.} PCLS se han utilizado para estudiar los pulmones de muchas especies, incluyendo ratones, vacas, monos, ovejas, caballos y seres humanos ^11. Una ventaja principal de esta técnica es que aproximadamente 20 rebanadas se pueden preparar a partir de un único lóbulo de un pulmón de ratón, lo que reduce el número de animales necesarios para los experimentos individuales. Prácticamente todos los tipos de células inmunes, incluyendo DCs, macrófagos, neutrófilos y células T, están presentes en PCLS y mantener sus estructuras normales.

PCLS también se puede utilizar para estudiar la señalización del calcio y de la contractilidad de las células de las vías respiratorias y el músculo liso después del tratamiento con la acetilcolina ¹² o metacolina ^13. En este enfoque, sólo una pequeña porción del pulmón es unaalyzed microscópicamente, pero un estudio informó que las mediciones de contracción de las vías respiratorias en PCLS varían sólo alrededor del 10% a partir de la rebanada de cortar, y esta variación es comparable a la observada usando pruebas de función pulmonar en animales intactos ^14. Otros investigadores han utilizado PCLS como un enfoque ex vivo para estudiar los cambios en la expresión de citocinas y marcadores de la superficie celular después de la incubación con LPS ^15. PCLS también se han utilizado en un modelo ex vivo de la vasoconstricción pulmonar hipóxica en pequeñas arterias intra-acinares. Estos vasos se encuentran en la parte del pulmón que no puede ser alcanzado mediante otros procedimientos, incluyendo las grabaciones de segmentos o análisis de los vasos subpleurales ¹⁶ arteriales diseccionados. Nuestro laboratorio ha utilizado principalmente PCLS para visualizar la localización de células inmunes en el tejido pulmonar en vivo en estado estacionario, y tras un estímulo inflamatorio in vivo. Los procedimientos que hemos desarrollado para esto son las siguientes.

Protocolo

procedimientos experimentales con animales descritos en este documento fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de NIEHS (IACUC).

1. Pulmón Preparación

1. Los ratones domésticos entre 6 y 12 semanas de edad en condiciones libres de patógenos específicos, de acuerdo con las directrices establecidas por los Comités de Cuidado y Uso de Animales institucional.
   NOTA: Imaged ratones pueden ser ingenuo, o tratada, dependiendo de los intereses específicos de cada investigador. A continuación, describimos la localización de células inmunes en los ratones no tratados previamente y en ratones tratados con 100 mg de ovoalbúmina (OVA) y 0,1 g de lipopolisacárido (LPS), utilizando solución salina tamponada con fosfato (PBS) como vehículo en un volumen total de 50! L. Para inculcar oropharyngeally OVA / LPS en las vías respiratorias, los animales fueron anestesiados con inhalación de isoflurano y verticalmente suspendidas por sus dientes con una banda de goma. La lengua se agarró suavemente con fórceps y se mantuvo a un lado para evitar que tragar, y 50 & #181; L de la solución de OVA / LPS depositado en la parte posterior de la cavidad oral como se describió anteriormente ^17.
2. La eutanasia del ratón con inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (100 mg / kg), y el pin del animal a una base de poliestireno.
3. Abra la cavidad abdominal con tijeras cortando la piel y el peritoneo desde la mitad del abdomen hasta la mandíbula. Tirar de los intestinos a un lado con fórceps o el borde romo de las tijeras y cortar la vena cava inferior para drenar la sangre desde los pulmones. Perforar el diafragma con la punta afilada de las tijeras para permitir la expansión de la caja torácica, teniendo cuidado de no cortar los pulmones.
4. glándulas salivares y otros tejidos claros lejos de la tráquea por el acaparamiento y el tejido manualmente tirando de él lejos de la tráquea subyacente con unas pinzas. Hacer una pequeña incisión en la tráquea en la cara anterior de la banda gruesa de cartílago utilizando unas pinzas finas o tijeras, teniendo cuidado de no cortar todo el camino a través de la traChea. La incisión será lo suficientemente grande como para permitir que una aguja 20 G pase a través.
5. Deslizar un 1,5 pulgadas, 20 aguja G sobre una sección de tubo de polietileno, dejando aproximadamente 1 cm de tubo más allá del extremo de la aguja. Corte el tubo en un ángulo de aproximadamente 45 ° para biselar el extremo, conecte la aguja a una jeringa de 1 ml, y la carga de la jeringa mediante la elaboración 0,8 ml de tibia (40 ° C) 2% de bajo punto de fusión de agarosa a través de la aguja.
6. Coloque el extremo del tubo en la incisión de la tráquea e inyectar lentamente la agarosa en los pulmones. Sin mover la aguja o jeringa, la cinta de la jeringa a la base de poliestireno para asegurar la aguja permanece en la tráquea.
   NOTA: Después de la inyección, los pulmones será más grande y se infla dentro del pecho. Los lóbulos derechos expanden primero, luego el lóbulo izquierdo. Si sólo hay un lóbulo se expande, la aguja se ha insertado demasiado profundamente (pasado el bronquio), y será necesario para tirar de él hacia fuera ligeramente antes de proceder. Esta parte de laprocedimiento que hay que hacer con relativa rapidez, antes de que la agarosa comienza a solidificarse.
7. Coloque el ratón, con la base y la jeringa aún insertada en la tráquea, en una habitación fría o en el refrigerador durante al menos 10 min. Si es necesario, el animal puede mantenerse allí por hasta varias horas, incluso si proceder a la migración de células de imagen por microscopía de vídeo.
8. Una vez que el ratón es frío, escindir cuidadosamente los pulmones de agarosa-inflado con unas tijeras, y colocarlos en una placa de 3 cm con PBS enfriado en hielo. Mantener en hielo.
9. Elige el lóbulo deseada para cortar en rodajas de tejido (por ejemplo, el lóbulo superior derecho). Asegúrese de que la parte interior de los pulmones (donde se conecta a la tráquea) está boca abajo en el plato.
   NOTA: El lóbulo utiliza y su orientación en el émbolo determinará el tamaño de los vasos y las vías respiratorias que serán visibles. La orientación se describe aquí es ideal para la visualización de las vías respiratorias grandes, y el parénquima. Los ratones tienen un gran lóbulo izquierdo y cuatro lóbulos más pequeños de la derecha. porformación de imágenes PCLS después de la introducción de los alergenos en los pulmones a través de la orofaringe o aspiración intranasal, el lóbulo superior derecho está típicamente seccionado, en parte debido a que es un tamaño conveniente, pero también porque los agentes inhalados dispersar uniformemente dentro de ella. Sin embargo, otros lóbulos, especialmente el lóbulo izquierdo, también pueden ser estudiados. Al comparar las cepas de ratón o tratamientos, es importante comparar el mismo lóbulo.

2. Pulmón rebanar

NOTA: rebanadas utilizando una máquina de cortar automatizado, metal de refrigeración de bloque, el émbolo y la jeringa de metal, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

1. Ponga una pequeña gota de todo uso, sin plazo pegamento gel sobre el émbolo y separar el pegamento en un movimiento circular, teniendo cuidado de no dejar que el pegamento toque los lados de la jeringa de metal. Si el pegamento toca los lados de la jeringa, se pega la jeringa y el émbolo juntos.
2. Inmediatamente después de cubrir el émbolo con pegamento, agarre suavemente ellóbulo extirpado con pinzas con el lado tráquea hacia abajo, DAB en un tejido para eliminar el exceso de líquido, y que lo coloque en la parte superior del émbolo. Se quita tejido adicional que se extiende más allá del borde del émbolo.
3. Mover el émbolo hacia abajo de manera que los lados de la jeringa de metal se mueven hacia arriba y sobre el tejido, creando un bien con el de pulmón, pegada en la parte inferior, no más de varios centímetros de profundidad. Cinta alrededor de la parte inferior de la jeringa de metal para mantener esta posición en su lugar.
4. Con cuidado, vierta 2% de agarosa de baja fusión a 40 ° C en el pozo por lo que sólo cubre la parte superior del lóbulo.
5. Rodea la jeringa de metal con el bloque de refrigeración enfriado con hielo y enfriar el lóbulo y agarosa para 1 - 2 min.
   NOTA: Un enfriamiento de tiempo más corto de la agarosa que rodea el tejido podría conducir a la desintegración de la agarosa durante el corte, lo que podría resultar en un PCLS desigual cortar.
6. Cargar la jeringa ejemplar en la máquina de cortar automatizado y llene el tanque tampón con PBS enfriado en hielo. alinear el el paso de accionamiento del motor con la jeringa de muestra y retirar el trozo de cinta de la parte inferior. Coloque el interruptor en la posición de avance rápido (FF) hasta que la unidad de motor paso a paso que toque la parte posterior del émbolo.
7. Alinear la hoja fresca con la jeringa de la muestra. espesor Set tejido, continua / rebanada única, la oscilación y la velocidad en la máquina de cortar. Por ejemplo, el espesor del tejido: 150 m, corte continuo (cont.), La oscilación: 9, y la velocidad: 3 - 4. Pulse comienzo. Los ajustes anteriores necesitan ser ajustados a las especificaciones máquina de cortar automatizados específicos.
8. Usando una espátula fina o pincel, recoger el PCLS uno a la vez a medida que caen en el tanque tampón y los colocan en una placa de 24 pocillos que contenía PBS enfriado en hielo.
   NOTA: Es importante mantener las rebanadas con el fin de mantener la coherencia entre los experimentos. Aunque cada pulmón es diferente dependiendo de la edad, sexo y peso, el 10 ^de rebanada, por ejemplo, generalmente rendimientos de tamaño similar vías respiratorias.

ove_title "> 3. tinción de anticuerpos

1. Diseño de un panel de anticuerpos marcados con fluorescencia en función del tipo de célula de interés, teniendo en cuenta el potencial solapamiento espectral fluorescente y las capacidades de detección del microscopio.
   NOTA: Como un ejemplo, un panel para la detección subconjunto DC es el siguiente: CD11c / alfa X integrina - BrilliantViolet (BV) 605 (Excitación: 405 nm, pico de emisión: 605 nm), CD324 / E-cadherina - Alexa 488 (AF488 ) (excitación: 488 nm, emisión de pico: 519 nm), CD88 / C5Ra1 - ficoeritrina (PE) (excitación: 561 nm, emisión de pico: 578 nm), CD103 / alfa E integrina - aloficocianina (APC) (excitación: 633 nm , pico de emisión: 660 nm). Fluorescencia herramientas de visualización espectrales (ver Lista de Materiales) son útiles para diseñar paneles.
2. Hacer una cóctel de anticuerpos que contiene los anticuerpos deseados.
   1. Para imágenes PCLS estático, añadir 800 l de tampón de tinción, 100! L Fc blocker, 50! L de suero de ratón normal, y 50! L de suero de rata normal a un ml microcentrifu 1,5tubo gación para un volumen total de 1 ml. Para imágenes de células vivas, utilice 800 medio de l Leibovitz (1x) que contiene 10% de FBS (Leibovitz-10) en lugar de tampón de tinción.
   2. Añadir anticuerpos para ajustar una concentración final deseada de cada anticuerpo. Transferir la solución de anticuerpo a un plato de 3 cm, y mantener en la oscuridad hasta que esté listo para su uso.
      NOTA: Las concentraciones finales necesitan ser optimizados para cada anticuerpo individuo (por lo general de 1 - 5 mg / ml).
3. Elegir un PCLS con un área anatómica de interés, tales como las vías respiratorias grandes o periferia del pulmón, y el lugar en el plato 3-cm que contiene 1 ml solución de anticuerpo.
4. PCLS la mancha en la oscuridad, en el hielo, mecedoras lentamente durante 30 o 60 min.
5. Para la imagen PCLS estática, vaya a la sección 4. Para imágenes de células vivas, pase a la sección 5.

4. estática de imagen de PCLS

1. Después de 60 min de incubación de PCLS con anticuerpos, eliminar la solución de anticuerpo a partir del plato y enjuague tque rebana dos veces con 1 ml de hielo frío PBS.
2. Pipetear 50 l de PBS en un 3 cm plato de fondo redondo de vidrio. Usando una espátula o pincel, transferir la PCLS manchadas a la baja, manipular con cuidado el corte hasta que quede plano y hacia fuera. Retire el PBS con una pipeta. El corte debe estar lo más plana posible. Los procedimientos anteriores deben realizarse rápidamente para evitar photobleaching.
3. Colocar 1 gota de medio de montaje temperatura ambiente sobre la rebanada y soltar suavemente un cubreobjetos de vidrio en el pozo de la placa. Mantenga PCLS en la oscuridad a 4 ° C durante hasta una hora antes de formación de imágenes.
4. Cuando se ve bajo un microscopio confocal, utilice un objetivo 20X (ver Lista de Materiales). Utilice la herramienta de "baldosas" para localizar y marcar los bordes del tejido en el ajuste "casco convexo". Esto ayudará a reducir el tiempo de la exploración del azulejo.
5. Durante el ajuste del rango de z-stack, verificar en múltiples áreas de la rebanada, especialmente a lo largo de los bordes, que los intervalosson apropiados.
   NOTA: El Z-rango probable tendrá que ser mayor que el espesor del tejido en sí, ya que es muy difícil conseguir que el tejido se encontraba completamente plana. Por ejemplo, con un PCLS gruesa 150! M, probablemente tendrá que ser fijado a 200 el rango z-stack - 250 micras para acomodar los golpes y las curvas de la rebanada. Dependiendo del rango de z-pila y el tamaño del tejido, cada exploración de pulmón completo tomará entre 7-12 h con un objetivo 20X. Cada pulmón es único y la configuración se debe ajustar para cada experimento.

5. Imágenes de células vivas de PCLS

1. Después de 30 min de incubación de PCLS con anticuerpos, eliminar la solución de anticuerpo a partir del plato y enjuagar las rodajas dos veces con 1 ml fríos Leibovitz-10.
2. Pipeta fresco 50 l Leibovitz-10 en una ranura de un cubreobjetos cámaras (8 ranuras). Use una espátula para transferir la PCLS al medio, manipular con cuidado hasta que el corte es plana y extenderse. Los procedimientos anterioresnecesario llevar a cabo rápidamente para evitar photobleaching.
3. Eliminar el medio 50 l usando una pipeta. El corte está mintiendo a ser lo más plana posible.
   NOTA: Es aceptable si los bordes de la rodaja estén levantados verticalmente contra la pared de la cámara. Además, si está disponible, un peso de platino metal puede ser utilizado para anclar la rebanada antes de proceder al siguiente paso. Ver la Lista de materiales adjunta de un ejemplo de alambre de platino que se puede cortar y doblar en pequeñas pesas.
4. En un 4 ° C habitación fría, mezclar 100 l de crecimiento reducido factor, fenol matriz extracelular libre de rojo con 100! L Leibovitz-10. Utilice puntas de pipeta preenfriados para esto, o la matriz extracelular se solidificará en la punta.
   NOTA: Esta proporción de matriz y medio (1: 1) crea un gel suficientemente denso para mantener los PCLS en condiciones de cultivo de tejidos.
5. pipetear suavemente la matriz para mezclar, y la pipeta con cuidado en la parte superior de la PCLS, asegurándose de que el gel va en la parte superior de la lung rebanada, y que la rebanada no flota en la parte superior del gel. El gel debe trabajar como un peso, el anclaje de los PCLS hacia abajo sobre la parte inferior de la placa.
6. transferir con cuidado el cubreobjetos con cámaras a una incubadora a 37 ° y dejar que la matriz se solidifique durante ~ 5 min.
7. Transferir todo el cubreobjetos de cámara en la etapa de pre-calentado de un microscopio confocal. Mantener la cámara a 37 ° C en toda la imagen. No se requiere suministro de CO ₂ durante la incubación de células cuando se utiliza medio de Leibovitz.
8. Establecer el rango de gama Z-pila y el azulejo basado en el intervalo deseado entre bastidores. Cuando se ve bajo un microscopio confocal, utilice un objetivo 20X (ver Lista de Materiales). Utilice la herramienta de "baldosas" para denotar el área de interés en el tejido, usando el ajuste "rejilla centrada" (por ejemplo, una cuadrícula de 2x2 centrada).
9. Durante el ajuste del rango de z-stack, verificar en múltiples áreas de la rebanada que los intervalos son apropiados.
   NOTA: El zrange probable será igual al espesor del tejido. Cada pulmón es único y la configuración se debe ajustar para cada experimento. azulejos 2x2 y 10 z-pilas generalmente resultará en ~ 1 marco / 2 min. Asegúrese de que la función de enfoque automático se activa antes de iniciar el experimento para minimizar xy y z-deriva durante el período de formación de imágenes.

Resultados

Para identificar la ubicación de dos subconjuntos de DC, CD11b CDCs ^hi y CD103 ⁺ CDC, PCLS de ratones C57BL / 6 fueron cortadas y teñidas con anticuerpos monoclonales (mAbs) específicos para CD11c, CD88, CD103, y CD324 (E-cadherina). Los anticuerpos frente a células epiteliales de las vías respiratorias mancha CD324, CD88 y se visualiza en los macrófagos y neutrófilos, pero no CDCs ^8. Esto nos permitió distinguir CDCs de CD11c ^+<...

Discusión

El protocolo descrito aquí fue desarrollado originalmente para visualizar las ubicaciones de dos subconjuntos de CDC dentro del pulmón. Sin embargo, este protocolo se puede adaptar fácilmente para estudiar muchos tipos de células diferentes, mientras que el mantenimiento de la viabilidad celular y la arquitectura tridimensional de los pulmones. Esta última característica es una ventaja importante sobre los sistemas de cultivo celular y facilita la identificación de tipos de células raras. El método se basa en l...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	000664
Prox1-TdTomato transgenic mice	Jackson Laboratory	018128	B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J
OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice	Jackson Laboratory	004194, 016617	B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J
Rag1 knock-out mice	Jackson Laboratory	002216	B6.129S7-Rag1tm1Mom/J
Ovalbumin, Low Endo, Purified	Worthington Biochemical Corporation	LS003059
Lipopolysaccharides from Escherichia coli	Sigma-Aldrich Co.	L2630-25MG
Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft	BD Diagnostic Systems	427421	0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter
GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose	BioExpress	E-3112-125	2% solution dissolved in PBS at 70 °C and held at 40 °C.
Compresstome VF-300	Precisionary Instruments, Inc.	VF-300
Double Edge Stainless Razor Blade	Electron Microscopy Sciences	72000	Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung.
Krazy Glue All Purpose Instant Gel	VWR	500033-484	Commonly available for $3/tube in local drugstores
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red	ThermoFisher Scientific	21083027
Normal Rat Serum (NRS)	Jackson ImmunoResearch Inc.	012-000-120
Normal Mouse Serum (NMS)	Jackson ImmunoResearch Inc.	015-000-120
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03HI
Staining Buffer	Made in House	N/A	PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4
Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies)	Made in House	N/A	Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2
Anti-mouse CD11b eFluor 450	eBioscience	48-0112-80	Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70)
Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605	BioLegend	101237	Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70)
Anti-mouse CD11c Phycoerythrin	eBioscience	12-0114-82	PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418)
Anti-mouse CD11c Allophycocyanin	BD Phamingen	550261	APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3)
Anti-mouse CD88 Phycoerythrin	BioLegend	135806	PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70)
Anti-mouse CD103 Allophycocyanin	eBioscience	17-1031-82	Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7)
Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450	eBioscience	48-0902-82	Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1)
Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin	eBioscience	17-1721-82	Anti-mouse CD172a APC (clone: P84)
Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421	BD Horizon	564188	BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4)
Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488	eBioscience	53-3249-82	Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1)
Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647	eBioscience	51-3249-82	Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1)
Glass Bottom Microwell Dishes 35 mm petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 coverglass	MatTek Corperation	P35G-1.5-14-C
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	ThermoFisher Scientific	155411PK	Pack of 16
15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness	MatTek Corperation	PCS-1.5-15
Bare Platinum Wire	World Precision Instruments	PTP201	0.020" (0.5 mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an "L" shape
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher Scientific	P36934	Keep at 4 °C, warm to room tempterature before use.
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free	Corning	356231
Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope	Carl Zeiss		Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss)
Plan-Apochromat 20X/0.8 M27 objective lends	Carl Zeiss	420650-9901-000