و إيل-8 عابر نموذج الماوس المعدلة وراثيا ل<em&gt; في فيفو</em&gt; رصد طويل الأمد للردود الالتهابية

Summary

الطريقة الموصوفة هنا يسمح لتصور إيل-8 المروج التي تعتمد على تنشيط التهاب في الرئتين من الفئران من خلال التصوير تلألؤ بيولوجي غير الغازية (بلي). نفس الحيوان يمكن أن يتعرض إلى بلي عدة مرات لمدة تصل إلى شهرين من وقت تسليم بناء مراسل لوسيفيراس.

Abstract

غالبا ما يرتبط التهاب مجرى الهواء مع الالتهابات البكتيرية ويمثل عاملا رئيسيا محددا لأمراض الرئة. في الجسم الحي تحديد القدرات المؤيدة للالتهابات من العوامل المختلفة هو التحدي ويتطلب إجراءات المحطة، مثل غسل القصبات وإزالة الرئتين لتحليل في الموقع ، مما يمنع التصور الطولي في نفس الماوس. هنا، يتسبب التهاب الرئة من خلال تقطير داخل القصبة الهوائية من الزائفة الزنجارية ثقافة طاف (سن) في الفئران المعدلة وراثيا عابرة معربا عن الجينات مراسل لوسيفيراس تحت سيطرة غير متجانسة إيل-8 المروج البقري. يتم رصد التعبير لوسيفيراس في الرئة بواسطة في صورة الجسم الحي بيولومينسنت تحليل (بلي) على الإطار الزمني 2.5- إلى 48 ساعة بعد تقطير. ويمكن تكرار هذا الإجراء عدة مرات في غضون 2-3 أشهر، مما يسمح بتقييم الاستجابة الالتهابية في نفس الفئران ويثووالحاجة إلى إنهاء الحيوانات. يسمح هذا النهج رصد العوامل المؤيدة للالتهابات التي تعمل في الرئة في الوقت الحقيقي، ويبدو مناسبا للدراسات الوظيفية والدوائية.

Introduction

أمراض الرئة المزمنة، مثل الربو، مرض الانسداد الرئوي المزمن (كوبد)، التليف الكيسي (سف)، توسع القصبات، تتميز بالتهاب مجرى الهواء. يتميز التهاب مجرى الهواء من وذمة، تسلل الخلوية، T الليمفاوية وتنشيط الخلايا البدينة، وزيادة إفرازات مجرى الهواء، وترسب الكولاجين المفرط. سف هو اضطراب متعدد الأنظمة، والسبب الرئيسي للوفاة والمراضة هو العدوى البكتيرية الرئة مع زيادة تفاقم الرئوي. ويتوقع الانخفاض في وظائف الرئة نتائج أقل فقرا ^{1 و 2 و 3 و 4} .

وعادة ما يلاحظ حالة التهاب الجهاز التنفسي من خلال تقييم علامات المناعية تجنيد خلال العملية الالتهابية في المواد المستمدة من الخطوط الجوية السفلى والعلوية، مثل البلغم، الذي يوفر متغير ريسults. كما يتم تنفيذ القصبات ⁵ . نماذج الفئران هي أدوات قيمة للتحقيق في التسبب وتطور الأمراض التي تتميز التهاب المسالك الهوائية والتي لم يتم بعد تحديد العلاجات الفعالة أو العلاجات. وقد استخدمت نماذج حيوانية من التهابات الرئة والالتهاب لدراسة الربو والتفاعلات الممرضة المضيف، بما في ذلك دور المواد الكيميائية التي تحاكي الظروف البشرية (على سبيل المثال، التعرض لدخان السجائر، لس، إلاستاز، البيضاوي، بولي I: C، وما إلى ذلك ، كما وكذلك مجموعات من ما سبق) ⁶ . قياس المعلمات المرتبطة بالتهاب يتطلب التضحية من الحيوانات، كما هي مطلوبة النهج الغازية لقياس عوامل مثل الحمل البكتيري، السيتوكينات في الرئتين، وجمع السائل القصبي (بال) السائل. أيضا، غالبا ما تكون هناك حاجة لفحوص النسيجية. إمكانية الحصول على معلومات عن حركية الاستجابة الالتهابية يتطلب استخدام الأسطواناتالفئران. ولذلك، فإن التقنية التي تسمح للحصول على مثل هذه المعلومات دون الحاجة للتضحية بالحيوانات قيمة على الأسس التقنية والأخلاقية والاقتصادية والتشغيلية.

إيل-8 هو لاعب أساسي في عملية الالتهاب، وتجنيد الكريات البيض إلى الأنسجة الملتهبة. وهو يمثل قراءة الجزيئية لدراسة تنشيط مسار التهابات. ميب-2 و كك قد يكون مثلي وظيفية من إيل-8 البشري في الفئران. الفئران تعبر عن مستقبل واحد فقط إيل-8 المحتملة، وهو مثلي من CXCR2 الإنسان ^{7 ، 8} ، لكنها قادرة على تحوير المروج الجيني إيل-8 غير المتغير الذي يدفع الجينات مراسل. وقد تم مؤخرا تطوير نموذج الفئران التهاب الرئة بعد ملاحظة أن البقر إيل-8 المروج / لوسيفيراس مراسل مراسل يمكن أن ترانزاكتيفيزاتد في الفئران. هذه الميزة تسمح للاستفادة من تلألؤ بيولوجي التصوير (بلي) لرصد الاستجابة الالتهابية في العيشنيمالس ⁹ .

وقد تم تكييف هذا النموذج لدراسة الالتهاب الناجم عن إكسوبرودوكتس البكتيريا (على سبيل المثال، لس أو المنتجات الصادرة عن سلالات بكتيرية) أو تنفالفا ^{10 ، 11} . وتركز عملية اكتشاف المخدرات على تطوير وتحسين الجزيئات القديمة والجديدة المضادة للالتهابات التي يمكن علاج أمراض الرئة، مثل سف والربو، ومرض الانسداد الرئوي المزمن. هذه الكيانات الكيميائية الجديدة يجب اختبارها بسرعة وسهولة في النماذج الحيوانية التي يمكن ربطها إلى المظاهر السريرية محددة من أجل تسهيل تصميم التجارب السريرية الذكية.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات الموصوفة من قبل لجنة رعاية الحيوان الداخلية للتجارب الحيوانية من قبل المركز المشترك بين الإدارات لخدمة البحوث التجريبية في جامعة فيرونا والامتثال للتوجيه الأوروبي 2010/63 إي، الإيطالية D.Lgs 26/2014 والمنقحة "دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية"، واشنطن العاصمة: مطبعة الأكاديمية الوطنية، 1996. تمت الموافقة على هذا البروتوكول والتجريب من قبل المعاهد الوطنية للصحة (ن 273/15). كان للحيوانات حرية الوصول إلى قوارض القوارض القياسية ومياه الصنبور المخففة، وتأقلت لمدة 5 أيام على الأقل إلى الظروف النباتية المحلية (درجة حرارة الغرفة: 20 - 24 درجة مئوية؛ الرطوبة النسبية: 40 - 70٪؛ دورة ضوء الظلام: 12 ساعة ) قبل أي علاج.

1. في فيفو جين التسليم

1. استخدام غطاء تدفق الصفحي لإعداد في الجسم الحي تسليم كاشف / مجمعات الحمض النووي.
2. تعريف بروتوكول تجريبي أالمعلمات الثانية بعد تعليمات الشركة المصنعة في الجسم الحي .
   1. استخدام حجم حقن الكلي من 200 ميكرولتر من المجمعات في الماوس.
   2. تبدأ مع 40 ميكروغرام من الحمض النووي معلقة في المياه الخالية من الذيفان مجانا؛ يمكن أن يصل نطاق التحسين إلى 60 ميكروغرام.
      ملاحظة: يجب ألا يتجاوز التركيز النهائي للحمض النووي في حجم الحقن 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
   3. استخدام نسبة N / P من 6 - 8 (0.12 - 0.16 ميكرولتر من كاشف التسليم لكل ميكروغرام من الحمض النووي). حساب حجم المقابلة من كاشف التسليم.
      ملاحظة: يجب أن تكون المجمعات الموجبة لدخول الخلية فعالة. وتعرف نسبة N / P على أنها عدد بقايا النيتروجين (N) على كاشف تسليم الجسم الحي لكل فوسفات الحمض النووي (P) ويمثل مقياس التوازن الأيوني داخل المجمعات.
3. تمييع المبلغ المحسوب (انظر الخطوة 1.2.1) من الحمض النووي في 5٪ الجلوكوز (التركيز النهائيالحصص التموينية) باستخدام 10٪ محلول مخزون الجلوكوز (المقدمة) والمياه المعقمة. تأكد من أن حجم التخفيف هو نصف حجم الحقن النهائي. دوامة بلطف أو مزيج بيبتينغ صعودا وهبوطا.
4. تمييع المبلغ المحسوب (انظر الخطوة 1.2.3) من كاشف التسليم إلى نصف حجم حقن 5٪ الجلوكوز (التركيز النهائي) باستخدام 10٪ محلول مخزون الجلوكوز (المقدمة) والمياه المعقم. دوامة بلطف وتدور في 13000 x ج لمدة 15 ثانية.
5. إضافة الكواشف تسليم المخفف أعلاه إلى حمض النووي المخفف في كل مرة. مزجها من قبل فورتيكسينغ لطيف وتدور باستمرار في 13،000 x ج لمدة 15 ثانية.
6. احتضان الخليط من الخطوة 1.5 لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: من هذه النقطة على، المجمعات مستقرة لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة، وتصل إلى 7 أيام عند تخزينها في 4 درجات مئوية.
7. أداء الحقن الذيل الوريد باستخدام المجمعات معايرتها في درجة حرارة الغرفة. وضع ذيل الماوس في الماء الدافئ (50 - 53 درجة مئوية) لمدة 30 ثانية للسماح لتمدد الوريد.
   1. ضع الماوس داخل جهاز التقييد. إدراج إبرة 27- إلى 30 قياس في الوريد الذيل في زاوية 20-30 درجة وببطء حقن 200 ميكرولتر. عند الانتهاء، وإزالة الإبرة وتطبيق الضغط على موقع الحقن.
      ملاحظة: انتفاخ طفيف في الذيل أثناء الحقن يشير إلى وضع غير صحيح. إذا حدث هذا، إزالة الإبرة وتكرار العملية القريبة إلى الموقع السابق.
8. تصور التعبير الجيني عن طريق أداء في الجسم الحي بلي (انظر الخطوة 2) في 24 و 48 ساعة بعد الحقن في الوريد.

2. في فيفو بلي

ملاحظة: مسبقا، إعداد حل الأسهم الطازجة من 15 ملغ / مل D- لوسيفيرين في دبس، تصفية تعقيم باستخدام وحدة تصفية 0.22 ميكرون، وتخزينها في -20 درجة مئوية.

1. وضع الفئران في غرفة التخدير شبكي واضح. تأكد من أن غرفة الأيزوفلورين ممتلئة. عندما تكون جاهزة لتخدير الحيوانات، تأكد من أن مضخة (لإفت) وغرفة (يمين) مفاتيح على. تحويل الطلب إيسوفلوران إلى 2.5٪ للتحريض و 2٪ للصيانة. يتم الاحتفاظ الحيوانات داخل غرفة إيفيس تحت 2.5٪ التخدير إيسوفلوران أثناء الحصول على الصور.
2. بعد تخدير الفئران بشكل كامل، وحقن 10 مل / كجم من وزن الجسم من حل D- لوسيفيرين طريق داخل الصفاق 15 دقيقة قبل التصوير.
   ملاحظة: ينبغي إجراء دراسة حركية على D- لوسيفيرين لتحديد وقت الذروة إشارة بعد إدارة D- لوسيفيرين.
3. فتح نظام التصوير في الجسم الحي وإعداد غرفة التصوير عن طريق بطانة مع قطعة من البطاقات السوداء (تجاهل عند الانتهاء). وضع المخاريط الأنف حسب الحاجة للتخدير الصحيح (استخدام مخروط واحد في الماوس).
   ملاحظة: يتم تقسيم الأنبوب الذي يزود التخدير إلى الصك بحيث يتم تركيز نفس تركيز التخدير إلى الفتحات التخدير الموجود داخل نظام التصوير.
4. نقل الفئران (تصل إلى 5) من بالثور إلى المخاريط الأنفية تعلق على مشعب في نظام التصوير وإغلاق الباب. اكتساب صورة يستمر 5 دقائق.
5. الحصول على بلي باستخدام برنامج الشركة المصنعة، على النحو التالي.
   1. تهيئة البرنامج. في الجسم الحي نظام التصوير الحصول على لوحة التحكم، ووضع علامة الاختيار بجانب الانارة . تأكد من أن إعداد "فلتر الإثارة" هو "كتلة" وإعداد "تصفية الانبعاثات" مفتوح.
   2. انقر على الأسهم: لوضع التصوير الانارة، حدد وقت التعرض 5 دقائق، بينينغ 8، و F / إيقاف 1؛ لوضع التصوير الفوتوغرافي، حدد بينينغ 4 و F / ستوب 8.
   3. من القائمة المنسدلة حقل عرض، حدد D، 19 سم، وارتفاع الموضوع من 1.5 سم. انقر على اكتساب عندما تكون جاهزة للحصول على الصورة.
6. عندما اكتساب الصورة كاملة، ضع الفئران مرة أخرى في أقفاصهم.
7. تحديد الفوتونات المنبعثة من مناطق معينة باستخدام برنامج الشركة المصنعة.
   1. انقر روي أدوات في لوحة الأدوات. في أدوات عائد الاستثمار ، حدد قياس عائد الاستثمار من القائمة المنسدلة النوع.
   2. انقر على أيقونة مربع ورسم عائد الاستثمار مربعة مع الأبعاد المناسبة لتغطية الصدر من حيوان واحد. نسخ ولصق عائد الاستثمار لكل حيوان للحصول على روي مع نفس الأبعاد. في لوحة روي تولس، انقر على قياس عائد الاستثمار للحصول على قياسات شدة إجمالي في عائد الاستثمار .
   3. لاحظ بيانات قياس عائد الاستثمار لجميع عوائد الاستثمار التي تم إنشاؤها في الصور أو التسلسلات أثناء الجلسة (عائد استثمار واحد لكل صف). انقر على تصدير وحدد المجلد الذي سيتم حفظ الملف فيه.

3. تحدي الماوس مع المحفز المؤيد للالتهابات

ملاحظة: قبل تحدي الماوس مع المحفزات المؤيدة للالتهابات، والتحقق من تفعيل خط الأساس من قبل ن فيفو بلي (انظر الخطوة 2). 7 أيام على الأقل يجب أن تمر بين في الجسم الحي تسليم الجينات وموسه التحدي للسماح للالتهاب خفيفة وعابرة لتختفي.

1. إعداد المعدات للتقطير داخل الرغامى (راجع الشكل 1 والشكل 2 ).
   1. ربط 5 مل المحاقن القابل للتصرف مع الربيع (C، E)، حقنة 100 ميكرولتر (B)، وقياس المتاح (D) إلى محبس 3 في اتجاه (A). وضع النظام على الدعم (H). وضع النظام على الدعم (H).
   2. ربط PE190 أنابيب الطبية الصغيرة (F) إلى مقياس المتاح (D) وإلى القرن القلم (G).
   3. ملء حقنة 5 مل مع 800 ميكرولتر من الهواء وتحويل محبس 3 في اتجاه.
      ملاحظة: ملء أنبوب مع الزائفة الزنجارية ثقافة طاف عن طريق الشفط 50 ميكرولتر في حقنة 100 ميكرولتر.

الشكل 1: التخطيطي ريبريزناتيون من مكون واحد من الجهاز داخل الرغامى.
(A) 3-طريقة محبس، (B) 100-ميكرولتر حقنة هاميلتون، (C) المتاح حقنة 5 مل، (D) قياس القابل للتصرف، (E) حقنة 5 مل مع المتاح الربيع، (F) PE190 أنابيب الطبية الصغيرة ، (G) القلم القرن، و (H) الدعم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تمثيل جهاز داخل الرغامى تجميعها.
هويات هي نفسها كما هو الحال في الشكل 1 . من فضلك اضغطهنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. تخدير الفئران باستخدام غرفة المرذاذ إيسوفلوران مجموعة في 2.5٪ إيسوفلوران مختلطة مع الأكسجين.
3. مراقبة الحيوان لتقييم آثار مخدر بعد 3-5 دقائق.
   ملاحظة: للتأكد من أن الماوس هو تخدير كامل، ومراقبة العلامات التالية بعناية: تباطؤ معدل التنفس يجب أن تبطئ، وعدم وجود الذراع تمتد عندما التقطت من الرقبة، وعدم الاستجابة عند تحفيز أطرافه الخلفية. انتظر بضع دقائق إضافية ثم تحقق مرة أخرى قبل المتابعة إلى الخطوة التالية إذا لم يتم استيفاء هذه المعايير.
4. وضع الماوس تخدير على منصة التنبيب شبكي، معلقة من القواطع لها، والتي يتم وضعها على السلك.
5. بدوره على منظار الحنجرة مع اليد اليسرى (للباحثين اليمنى) والاستيلاء على زوج من ملقط حادة المنتهية. استخدام غيض من منظار الحنجرة وملقط بلطف نقب فتح الفم.
6. سحب اللسان خارج و hالقديم إلى الجانب باستخدام ملقط. توجيه شفرة المنظار نحو الجزء الخلفي من الفم. الحفاظ على منظار الحنجرة الضغط أسفل بلطف جدا في زاوية 90 درجة حتى افتتاح القصبة الهوائية مرئية. عقد منظار الحنجرة في مكان.
7. باستخدام اليد الأخرى، واتخاذ أنبوب تسليم متصلة بنهاية أنابيب بي وإدراجه في القصبة الهوائية. تدوير صمام ثلاثي الاتجاه لتقديم اللقاح. سحب أنبوب من القصبة الهوائية في أقرب وقت ممكن. عقد الماوس تستقيم لبضع ثوان إلى السماح اللقاح إلى أن يتم استنشاقها في الرئتين.
   ملاحظة: سوف تخنق الفئران وتموت إذا تم حظر القصبة الهوائية لفترة طويلة جدا.
8. أزل الماوس من المنصة. قد تختلف فترة الانتعاش بناء على السلالات. ورصد الماوس بجد، وضمان أن الحيوان مستيقظا تماما في غضون 30 دقيقة بعد الإجراء.
9. حقن داخل الصفاق 150 ملغ / كغ D- لوسيفيرين وصورة الرئتين باستخدام نظام التصوير في الجسم الحي 4 و 24 و 48 ساعة بعد داخل الرغامىتقطير من المحفزات. تحديد الفوتونات المنبعثة من مناطق معينة باستخدام برنامج الشركة المصنعة.

النتائج

تم استخدام بيل-8-لوك نموذج الماوس المعدلة وراثيا عابرة لمراقبة الجسم الحي من التهاب الرئة في الفئران تحدى مع طاف البكتيرية المركزة (30X) تحتوي على عوامل الفوعة يفرز. وكانت الاستجابة الالتهابية الناجم عن الكشف عن طريق التصوير في الجسم الحي كز...

Discussion

في عمل سابق ¹¹ ، تم عرض تباين بين بيل-8-لوك تعتمد بلي وعلامات بال. واعتمدت على درجة التفاضلية من الحساسية داخل سلالات الفأر ¹² . لهذا السبب، فإن التطبيق الأول للنموذج بيل-8-لوك لسلالة فأر مختلفة يتطلب دراسة أولية للاستجابة الالتهابية، سواء من حي?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FMT 2500 Fluorescence Tomography System	Perkin Elmer Inc.	Experimental Builder
IVIS Lumina serie II Pre-clinical In Vivo; Imaging System	Perkin Elmer Inc.	Experimental Builder
MMPsense 750 FAST	Perkin Elmer Inc.	NEV10001EX	Protect from light, store the probe at 4 °C
Female inbred BalbC	Harlan Laboratories Italy		Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions
bIL-8-Luc plasmid	Department of Medical Veterinary Science, University of Parma, Italy		Store the plasmid at -20 °C
pGL3basic vector	Promega	E1751	Store the vector at -20 °C
JetPEI DNA transfection reagent	Polyplus transfection	201B-001G	The DNA and JetPEI mix was formulated with a final N/P ratio of 7
D-luciferin potassium salt 1 g	Perkin Elmer Inc.	122796	Protect from light, store at -20 °C
Living Image software	Caliper Life Sciences,	Experimental Builder
Isoflurane	ESTEVE spa	571329.8	Do not inhale
Bio-Plex Cytokine Assay Kit	Bio-Rad Laboratories	M60-009RDPD	Store the unopened kit at 4 °C
Automated cell counter	Dasit XT 1800J	Experimental Builder
Penn-century model DP-4M Dry power insufflator	Penn-century	DPM-EXT
Gas anesthesia system XGI-8	Perkin Elmer Inc.	Experimental Builder
PE190 micro medical tubing	2biological instruments snc	BB31695-PE/8
Syringe without needle 5 mL	Terumo	SS*05SE1	Cut the boards of the piston by a scissors
Hamilton 0,10 mL (model 1710)	Gastight	81022
Discofix 3-way Stopcock	Braun	4095111
Syringe with needle 1 mL	Pic solution	3,071,260,300,320	Use without needle
Plastic feeding tubes 18ga x 50 mm	2biological instruments snc	FTP-18-50	Cut obliquely the tip