דגם IL-8 עכבר transgenized חולף עבור<em&gt; בויבו</emמעקב ארוך טווח אחר תגובות דלקתיות

Summary

השיטה המתוארת כאן מאפשרת הדמיה של IL- 8 האמרגן תלוי דלקת ההפעלה הריאות של עכברים באמצעות הדמיה פליטת אור לא פולשני (BLI). אותו בעל חיים יכול להיות נתון BLI מספר פעמים במשך עד חודשיים מזמן המסירה של הכתב לוציפראז לבנות.

Abstract

דלקת בדרכי הנשימה קשורה לעיתים קרובות לזיהומים חיידקיים ומייצגת גורם עיקרי למחלת ריאות. קביעת in vivo של היכולות הפרו דלקתיות של גורמים שונים הוא מאתגר ומחייב נהלים מסוף, כגון שטיפת ברונכואלוואלית והסרת הריאות לניתוח באתר , מונע הדמיה האורך באותו עכבר. הנה, דלקת ריאות הוא המושרה באמצעות החדרת intratracheal של Pseudomonas aeruginosa תרבות supernatant (SN) בעכברים transgenized חולף להביע את הגן הכתב בלוציפראז תחת שליטה של ​​האמרגן heterologous IL-8 בקר. ביטוי לוציפראז בריאה הוא פיקוח על ידי in vivo bioluminescent תמונה (BLI) ניתוח מעל מסגרת זמן של 2.5-48 שעות לאחר הטעם. ההליך יכול לחזור על עצמו מספר פעמים בתוך 2 - 3 חודשים, ובכך לאפשר את הערכת התגובה הדלקתית בעכברים אותו עםהצורך לסיים את בעלי החיים. גישה זו מאפשרת מעקב אחר גורמים פרו-אנטי-דלקתיים הפועלים בזמן הריאה בזמן אמת ונראית מתאימה למחקרים פונקציונליים ופרמקולוגיים.

Introduction

מחלות ריאות כרוניות, כגון אסתמה, מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), סיסטיק פיברוזיס (CF) וברונכיקטסיס, מאופיינים בדלקת דרכי הנשימה. דלקת בדרכי הנשימה מאופיינת בצקת, חדירת תאים, לימפוציטים מסוג T ותאי תא של תורן, הפרשות בדרכי הנשימה, ותצהיר קולגן מוגזם. CF הוא הפרעה רב-מערכתית, והסיבה העיקרית לתמותה ולתחלואה היא זיהום חיידקית ריאה עם הגברת החרפת הריאות. הירידה בתפקוד הריאות מנבאת תוצאה נמוכה יותר באופן משמעותי ^{1 , 2 , 3 , 4} .

מצב הדלקת של דרכי הנשימה נמדד בדרך כלל באמצעות הערכה של סמנים אימונולוגיים שגויסו במהלך התהליך הדלקתי בחומר הנגזר מדרכי הנשימה התחתונות והתחתונות, כגון כיח, המספק res משתנה. Bronchoscopies מבוצעות גם ⁵ . מודלים Murine הם כלים חשובים לחקר הפתוגנזה ואבולוציה של מחלות המאופיינות דלקת דרכי הנשימה ואשר טיפולים יעילים או תרופות עדיין לא זוהו. מודלים של בעלי חיים של דלקת ריאות ודלקת שימשו כדי לחקור אסטמה אינטראקציות מארח פתוגן, כולל התפקיד של כימיקלים המדמים את התנאים האנושיים ( למשל, חשיפה עשן סיגריה, LPS, elastase, ovalbumin, פולי אני: C, וכו ' , כמו כמו גם שילובים של לעיל) ⁶ . המדידה של הפרמטרים הקשורים לדלקת דורשת את ההקרבה של החיות, כאשר נדרשות גישות פולשניות למדידת גורמים כגון עומס חיידקי, ציטוקינים בריאות, ואספקה ​​של נוזל שטיפה bronchoalveolar (BAL). כמו כן, בדיקות היסטולוגית נדרשים לעתים קרובות. האפשרות של קבלת מידע על קינטיקה התגובה דלקתית דורש שימוש של numעכברים. לכן, טכניקה שתאפשר קבלת מידע כזה ללא צורך להקריב את בעלי החיים היא בעלת ערך על בסיס טכני, אתי, כלכלי ותפעולי.

IL-8 הוא שחקן חיוני בתהליך הדלקת, לגייס לויקוציטים לרקמה דלקתית. הוא מייצג קריאה מולקולארית לחקר הפעלת מסלול דלקתית. MIP-2 ו KC עשוי להיות homologs תפקודית של IL-8 האנושי בעכברים. עכברים מבטאים רק קולטן פוטנציאלי אחד של IL-8, הומולוג של CXCR2 ^{7 , 8} , אך הם מסוגלים לשנות את מקדם הגן heterologous IL-8 המניע גן של הכתב. דלקת ריאות מודל Murine לאחרונה פותחה לאחר התצפית כי מקדם IL-8 האמרגן / בלוציפראז לכתב יכול להיות transactivated בעכברים. תכונה זו מאפשרת ניצול של הדמיה פליטת אור (BLI) כדי לפקח על התגובה דלקתיים לחיות⁹ .

מודל זה הותאם כדי לחקור דלקת מופעלות על ידי exoproducts חיידקי ( למשל, LPS או מוצרים שפורסמו על ידי זנים חיידקים) או TNFalpha ^{10 , 11} . תהליך גילוי התרופה מתמקד בפיתוח ואופטימיזציה של מולקולות אנטי-דלקתיות ישנות וחדשות, אשר יכולות לטפל במחלות ריאה, כגון CF, אסטמה ו- COPD. יש לבחון במהירות ובנוחות את המרכיבים החומריים החדשים הללו במודלים של בעלי חיים, שיכולים להיות קשורים לפנוטיפים קליניים ספציפיים על מנת להקל על תכנון ניסויים קליניים חכמים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל ניסויים בבעלי חיים שתוארו אושרו על ידי הוועדה לרווחת בעלי חיים בין-חושיים לניסויים בבעלי חיים על ידי המרכז הבינמשרדתי של שירות המחקר הניסויי באוניברסיטת ורונה ועמדו בדרישות האירופיות Directive 2010/63 UE, האיטלקית D.Lgs 26/2014 והמתוקן "מדריך לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה", וושינגטון, הוצאת האקדמיה הלאומית, 1996. פרוטוקול זה וניסויים אושרו על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (n 273/15). לבעלי חיים היתה גישה חופשית למים סטנדרטיים של מיץ סטנדרטי של מיץ צ'או ומים מתוקים, והתאקלמו לפחות 5 ימים לתנאי הוויבריום המקומיים (טמפרטורת החדר: 20 - 24 ° C, לחות יחסית: 40-70%, מחזור כהה בהיר: 12 שעות ) לפני כל טיפול.

1. ב ויוו ג 'ין משלוח

1. השתמש מכסה המנוע זרימה למינרית להכין את vivo משלוח מגיב / מתחמי חומצה גרעין.
2. הגדר את פרוטוקול הניסוי אNd הפרמטרים הבאים של היצרן ב vivo ההוראות.
   1. השתמש בהיקף הזרקת הכולל של 200 μL של קומפלקסים לכל עכבר.
   2. התחל עם 40 מיקרוגרם של DNA תלוי במים ללא אנדוטוקסין; טווח האופטימיזציה יכול להגיע 60 מיקרוגרם.
      הערה: הריכוז הסופי של חומצת גרעין בנפח ההזרקה לא יעלה על 0.5 מיקרוגרם / μL, בהתאם להוראות היצרן.
   3. השתמש N / P יחס של 6 - 8 (0.12 - 0.16 μL של מגיב משלוח לכל μg של חומצה גרעין). חישוב נפח המתאים של מגיב משלוח.
      הערה: מתחמי צריך להיות קטיוני עבור כניסה תא יעיל. יחס N / P מוגדר כמספר שאריות החנקן (N) על מגיב המסירה ב vivo לכל פוספט חומצות גרעין (P) ומייצג את האיזון של האיזון היוני בתוך המתחם.
3. לדלל את הסכום המחושב (ראה שלב 1.2.1) של חומצה גרעין ב 5% גלוקוז (ריכוז סופיRation) באמצעות 10% גלוקוז פתרון המניות (בתנאי) ומים סטריליים. ודא כי נפח דילול הוא חצי נפח הזרקה הסופי. וורטקס בעדינות או לערבב על ידי pipetting מעלה ומטה.
4. לדלל את הסכום המחושב (ראה שלב 1.2.3) של מגיב משלוח למחצית נפח ההזרקה של 5% גלוקוז (ריכוז סופי) באמצעות 10% גלוקוז פתרון המניות (בתנאי) ומים סטריליים. וורטקס בעדינות ספין על 13,000 XG במשך 15 s.
5. הוסף את ריאגנטים משלוח מדולל לעיל חומצה גרעין מדולל בבת אחת. מערבבים אותם על ידי vortexing עדין ספין למטה ב 13,000 XG במשך 15 s.
6. דגירה את התערובת מ 1.5 שלב במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: מנקודה זו ואילך, מתחמי הם יציבים במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר למשך עד 7 ימים, כאשר מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס.
7. ביצוע זריקות הזנב וריד באמצעות מתחמי equilibrated בטמפרטורת החדר. מניחים את זנב העכבר במים חמים (50 - 53 מעלות צלזיוס) במשך 30 s כדי לאפשר התרחבות וריד.
   1. מניחים את העכבר בתוך המכשיר מרסן. הכנס מחט 27 עד 30 מד בזנב הזנב ב 20 - 30 זווית זווית לאט לאט להזריק 200 μL. עם השלמת, להסיר את המחט ולהפעיל לחץ על אתר ההזרקה.
      הערה: בליטה קלה בזנב במהלך ההזרקה מציינת מיקום שגוי. אם זה קורה, להסיר את המחט לחזור על התהליך הפרוקסימלי לאתר הקודם.
8. דמיינו ביטוי גנים על ידי ביצוע in vivo BLI (ראה צעד 2) ב 24 ו - 48 שעות לאחר הזרקה תוך ורידי.

2. בויבו BLI

הערה: מראש, להכין פתרון מלאי טרי של 15 מ"ג / מ"ל ​​D-luciferin ב DPBS, מסנן לעקר אותו באמצעות יחידת סינון 0.22 מיקרומטר, ולאחסן אותו ב -20 מעלות צלזיוס.

1. מניחים את העכברים לתוך חדר הרדמה ברורה plexiglass. ודא כי החדר isoflurane מלא. כאשר מוכנים להרדים את החיות, להבטיח כי המשאבה (lEft) ו קאמרית (מימין) מתגים מופעלים. הפעל את החוגה isoflurane ל 2.5% עבור אינדוקציה ו 2% עבור תחזוקה. בעלי חיים בתוך החדר IVIS נשמרים תחת הרדמה isofluorane 2.5% במהלך רכישת התמונה.
2. לאחר העכברים הם הרדים לחלוטין, להזריק 10 מ"ל / ק"ג bodyweight של פתרון D- luciferin על ידי מסלול intraperitoneal 15 דקות לפני הדמיה.
   הערה: מחקר קינטי על D-luciferin צריך להתבצע כדי לקבוע את הזמן של שיא האות לאחר הממשל של D- לוציפרין.
3. פתח את מערכת ההדמיה vivo ולהכין את החדר הדמיה ידי רירית אותו עם חתיכת שחור cardstock (להשליך עם השלמת). מניחים את האצטרובלים האף לפי הצורך עבור הרדמה נכונה (להשתמש קונוס אחד לכל עכבר).
   הערה: הצינור המספק את ההרדמה למכשיר מחולק כך שריכוז זהה של הרדמה הוא צנרת אל סעפת הרדמה הממוקם בתוך מערכת ההדמיה.
4. מעבירים את העכברים (עד 5) מן bשור על קונוסים האף מחוברת סעפת במערכת הדמיה לסגור את הדלת. רכישת תמונות נמשך 5 דקות.
5. לרכוש BLI באמצעות התוכנה של היצרן, כדלקמן.
   1. אתחל את התוכנה. ב vivo מערכת הדמיה רכישת לוח הבקרה, לשים סימן ביקורת ליד זוהר . אשר כי ההגדרה Excitation Filter (חסימת מסננים) היא Block (חסימה) והגדרה Emission Filter (מסנן פליטה) היא Open (פתח).
   2. לחץ על החצים: עבור מצב הדמיה זוהרת, בחר זמן חשיפה של 5 דקות, Binning 8, ו- F / Stop 1; עבור מצב צילום הדמיה, בחר Binning 4 ו- F / stop 8.
   3. מהרשימה הנפתחת שדה שדה, בחר D, 19 ס"מ וגובה נושא של 1.5 ס"מ. לחץ על רוכשת כאשר אתה מוכן לרכוש את התמונה.
6. כאשר רכישת התמונה הושלם, מניחים את העכברים בחזרה לתוך הכלובים שלהם.
7. לכמת את הפוטונים הנפלט מאזורים ספציפיים באמצעות התוכנה של היצרן.
   1. נְקִישָׁה ROI כלים בלוח הכלים. בכלי החזר ROI , בחר החזר ROI של מדידה מהרשימה הנפתחת סוג.
   2. לחץ על סמל הריבוע וצייר ROI מרובע עם המידות המתאימות כדי לכסות את בית החזה של בעל חיים אחד. העתק והדבק את החזר ה- ROI עבור כל בעל חיים כדי לקבל החזר ROI עם אותם מימדים. בחלונית 'כלים של החזר ROI', לחץ על מדידת החזר ROI כדי לקבל את המידות של העוצמה הכוללת של החזרים להשקעה .
   3. צפה בנתונים של ROI מדידות עבור כל החזרים להשקעה שנוצרו בתמונות או ברצפים במהלך הפעלה (החזר ROI אחד לשורה). לחץ על ייצוא ובחר את התיקייה שבה הקובץ יישמר.

3. עכבר אתגר עם גירויים Pro-Inflammatory

הערה: לפני אתגר העכבר עם גירויים פרו דלקתיים, לבדוק את ההפעלה הבסיסית על ידי אני vivo BLI (ראה שלב 2). לפחות 7 ימים חייב לעבור בין משלוח vivo גן מוסE כדי לאפשר את דלקת קלה ו חולפת להיעלם.

1. הכן את הציוד עבור intratracheal להחדיר (ראה איור 1 ו איור 2 ).
   1. חבר את 5 מזרקים חד פעמי מ"ל עם האביב (C, E), מזרק 100 μL (B), ואת מד חד פעמיות (D) כדי 3-way דרך שסתום (A). מניחים את המערכת על התמיכה (H). מניחים את המערכת על התמיכה (H).
   2. חבר את PE190 מיקרו צינור רפואי (F) למדוד חד פעמיות (D) ו למאה העט (G).
   3. ממלאים את המזרק 5 מ"ל עם 800 μL של אוויר ולהפוך את השסתום 3-way.
      הערה: למלא את הצינור עם supernatant pseudomonas superugatas aeruinosa ידי aspirating 50 μl מזרק 100 μl.

איור 1: Represe סכמטיNtation של רכיב יחיד של המכשיר Intratracheal.
(א) 3-דרך שסתום, (ב) מזרק המילטון 100-μL, (ג) מזרק 5-mL חד פעמיות, (ד) מד חד פעמיות, (ה) מזרק 5-mL חד פעמית עם האביב, (F) PE190 צינורות רפואיים מיקרו , (G) עט המאה, ו (H) תמיכה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור מס '2: ייצוג של מכשיר Intrachecheal התאספו.
ההזדהויות זהות לאלו שבאיור 1 . בבקשה תלחץכאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

2. להרדים את העכברים באמצעות תא מאדה isoflurane להגדיר 2.5% isoflurane מעורבב עם חמצן.
3. צג החיה כדי להעריך את ההשפעות של ההרדמה לאחר 3 - 5 דקות.
   הערה: כדי לוודא כי העכבר הוא הרדים לחלוטין, לפקח על השלטים הבאים בזהירות: קצב הנשימה מואט צריך להאט, חוסר זרוע מתיחה כאשר הרים על ידי הצוואר, וחוסר תגובה כאשר הגפיים האחוריות הם מגורה. המתן מספר דקות נוספות ובדוק שוב לפני שתמשיך לשלב הבא אם קריטריונים אלה אינם מתקיימים.
4. מניחים את העכבר הרדים על פלטפורמת אינטובציה פרספקס, לתלות אותו על ידי החותכות שלו, אשר ממוקמים על חוט.
5. הפעל את laryngoscope עם יד שמאל (עבור חוקרים ימניים) ותופס זוג מלקחיים קהה סיים. השתמש קצה laryngoscope ואת מלקחיים בעדינות לפתוח את הפה.
6. משוך את הלשון החוצה ו- hישן זה בצד באמצעות מלקחיים. מדריך את להב laryngoscope לכיוון החלק האחורי של הפה. שמור את laryngoscope לחוץ בעדינות מאוד בזווית של 90 ° עד פתיחת קנה הנשימה גלוי. החזק את laryngoscope במקום.
7. באמצעות היד השנייה, לקחת את צינור המשלוח מחובר סוף צינורות PE להכניס אותו לתוך קנה הנשימה. סובבו את השסתום הדו-כיווני כדי לספק את המשחה. משוך את הצינור מתוך קנה הנשימה בהקדם האפשרי. החזק את העכבר זקוף במשך כמה שניות כדי לאפשר את inoculum להיות inhaled לתוך הריאות.
   הערה: עכברים יחנקו וימותו אם קנה הנשימה נחסם זמן רב מדי.
8. הסר את העכבר מהפלטפורמה. זמן ההחלמה עשוי להשתנות בהתאם לזנים; לפקח על העכבר בחריצות, להבטיח כי החיה ער לחלוטין בתוך 30 דקות לאחר ההליך.
9. Intraperitoneally להזריק 150 מ"ג / ק"ג D-luciferin ותמונה הריאות באמצעות in vivo מערכת הדמיה 4, 24, ו 48 שעות לאחר intratrachealהחדרת הגירויים. לכמת את הפוטונים הנפלט מאזורים ספציפיים באמצעות התוכנה של היצרן.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

BIL-8-Luc חולפת מודל עכבר מהונדס שימש לניטור in vivo של דלקת ריאות בעכברים לערער עם supernatant חיידקים מרוכזים (30x) המכילים גורמים ארס מופרש. תגובה דלקתית המושרה היה לזיהוי על ידי הדמיה vivo כמו עלייה האות BLI. פעילות Pro-inflammatory היה ברור לזיהוי 2.5 שעות שלאחר ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

בעבודה קודמת ¹¹ , הוצג ניגוד בין BLI תלוי ב- bil-8-Luc ו- BAL. היא הסתמכה על מידת ההפרש של רגישות בתוך זנים העכבר ¹² . מסיבה זו, היישום הראשון של המודל BIL-8-Luc לזן עכבר שונה מחייב מחקר ראשוני של התגובה הדלקתית, הן במונחים של BLI והן סמנים דלקתיים סטנדרטיים יות...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FMT 2500 Fluorescence Tomography System	Perkin Elmer Inc.	Experimental Builder
IVIS Lumina serie II Pre-clinical In Vivo; Imaging System	Perkin Elmer Inc.	Experimental Builder
MMPsense 750 FAST	Perkin Elmer Inc.	NEV10001EX	Protect from light, store the probe at 4 °C
Female inbred BalbC	Harlan Laboratories Italy		Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions
bIL-8-Luc plasmid	Department of Medical Veterinary Science, University of Parma, Italy		Store the plasmid at -20 °C
pGL3basic vector	Promega	E1751	Store the vector at -20 °C
JetPEI DNA transfection reagent	Polyplus transfection	201B-001G	The DNA and JetPEI mix was formulated with a final N/P ratio of 7
D-luciferin potassium salt 1 g	Perkin Elmer Inc.	122796	Protect from light, store at -20 °C
Living Image software	Caliper Life Sciences,	Experimental Builder
Isoflurane	ESTEVE spa	571329.8	Do not inhale
Bio-Plex Cytokine Assay Kit	Bio-Rad Laboratories	M60-009RDPD	Store the unopened kit at 4 °C
Automated cell counter	Dasit XT 1800J	Experimental Builder
Penn-century model DP-4M Dry power insufflator	Penn-century	DPM-EXT
Gas anesthesia system XGI-8	Perkin Elmer Inc.	Experimental Builder
PE190 micro medical tubing	2biological instruments snc	BB31695-PE/8
Syringe without needle 5 mL	Terumo	SS*05SE1	Cut the boards of the piston by a scissors
Hamilton 0,10 mL (model 1710)	Gastight	81022
Discofix 3-way Stopcock	Braun	4095111
Syringe with needle 1 mL	Pic solution	3,071,260,300,320	Use without needle
Plastic feeding tubes 18ga x 50 mm	2biological instruments snc	FTP-18-50	Cut obliquely the tip