Bir IL-8 Geçici Transgenize Edilmiş Fare Modeli<emIn vivo</em&gt; İnflamatuvar Yanıtların Uzun Vadeli İzlenmesi

Özet

Burada açıklanan yöntem, non-invaziv biyolüminesans görüntüleme (BLI) yoluyla farelerin akciğerlerinde IL-8 promotöre bağlı inflamasyon aktivasyonunun görselleştirilmesine olanak tanır. Aynı hayvan lusiferaz muhabiri yapısının teslim edildiği andan itibaren iki aya kadar birden fazla kez BLI'ye tabi tutulabilir.

Özet

Hava yolu inflamasyonu genellikle bakteriyel enfeksiyonlarla ilişkilidir ve akciğer hastalığının önemli bir belirleyicisini temsil eder. Çeşitli faktörlerin iltihap önleyici yeteneklerinin in vivo olarak belirlenmesi zor ve bronkoalveoler lavaj ve in situ analiz için akciğerlerin çıkarılması gibi terminal prosedürleri gerektirir ve aynı farede uzunlamasına görselleştirme önlenir. Burada, akciğer iltihabı, heterolog bir IL-8 sığır promoterinin kontrolü altındaki lusiferaz raportör genini eksprese eden geçici olarak transgenize edilmiş farelerde Pseudomonas aeruginosa kültür süpernatantının (SN) intratrakeal instilasyonu yoluyla indüklenir. Akciğerdeki lusiferaz ifadesi, instilasyondan sonra 2,5 ila 48 saatlik bir zaman aralığında in vivo biyolüminesan görüntü (BLI) analizi ile izlenir. Prosedür 2 - 3 ay içinde birden fazla kez tekrar edilebilir, böylece aynı farelerde inflamatuvar yanıtı değerlendirmek mümkün olurHayvanları yok etme ihtiyacı var. Bu yaklaşım akciğerde etkili olan pro ve antiinflamatuvar faktörleri gerçek zamanlı olarak izlemeye ve fonksiyonel ve farmakolojik araştırmalara uygun görünmektedir.

Giriş

Astım, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), kistik fibroz (KF) ve bronşektazi gibi kronik akciğer hastalıkları hava yolu inflamasyonu ile karakterizedir. Hava yolu inflamasyonu ödem, hücresel infiltrasyon, T lenfosit ve mast hücresi aktivasyonu, artmış havayolu salgıları ve aşırı kollajen depozisyonu ile karakterizedir. CF çok sistemli bir hastalıktır ve mortalite ve morbiditenin başlıca nedeni akciğer bakteriyel enfeksiyonudur ve pulmoner alevlenme artar. Akciğer fonksiyonundaki azalma, ^{1 , 2 , 3 , 4} nispeten daha fakir sonuçlara yol açar.

Solunum yollarının iltihaplanma durumu genellikle, balgam gibi alt ve üst hava yollarından türetilmiş materyalde inflamatuar süreç sırasında işe alınan immünolojik belirteçlerin değerlendirilmesiyle gözlemlenir ve değişken reska bul etmez. Bronkoskopiler de yapılır ⁵ . Murin modelleri, hava yolu inflamasyonu ile karakterize olan ve etkili tedaviler veya tedaviler henüz tanımlanmamış olan hastalıkların patogenezini ve evrimini araştırmak için değerli araçlardır. Akciğer enfeksiyonu ve enflamasyonunun hayvan modelleri, insan koşullarını taklit eden kimyasalların rolü ( örn., Sigara dumanı maruziyeti, LPS, elastaz, ovalbümin, poli I: C vb. De dahil olmak üzere astım ve konakçı-patojen etkileşimlerini incelemek için kullanılmıştır Yukarıdaki kombinasyonlar gibi) ⁶ . İnflamasyonla ilgili parametrelerin ölçümü, bakteriyel yük, akciğerlerdeki sitokinler ve toplanan bronkoalveoler lavaj (BAL) sıvı gibi faktörleri ölçmek için invaziv yaklaşımlar gerektirdiğinden, hayvanların feda edilmesini gerektirir. Ayrıca, genellikle histolojik incelemeler gereklidir. Enflamatuar yanıt kinetiği hakkında bilgi edinme imkanı numErous fareler. Bu nedenle, hayvanları feda etmeye gerek duymadan bu tür bilgileri elde etmeye yarayan bir teknik, teknik, etik, ekonomik ve operasyonel üsler için değerlidir.

IL-8 iltihaplanma sürecinde lökositleri iltihaplı dokuya sokmak için gerekli bir oyuncudur. Enflamatuar yol aktivasyonunun çalışması için moleküler okuma yazısıdır. MIP-2 ve KC, farelerde insan IL-8'in işlevsel homologları olabilir. Fareler, insan CXCR2 7,8'in bir homologu olan sadece bir potansiyel IL-8 reseptörünü ifade eder, ancak bir raportör geni tahrik eden bir heterolog IL-8 gen promotörünü modüle edebilmektedirler. Bir sığır IL-8 promotör / lusiferaz raportör yapısının farelerde transaktive edilebileceği gözleminden sonra yakın zamanda bir akciğer iltihabı murin modeli geliştirildi. Bu özellik, canlı yaşamda inflamatuvar cevabı izlemek için biyolüminesans görüntülemenin (BLI) kullanılmasına olanak tanırNimals ⁹ .

Bu model bakteri exoproducts ( örneğin, LPS veya bakteri suşları tarafından salınan ürünler) veya TNFalpha ^{10 , 11} tarafından tetiklenen iltihap incelemek için uyarlanmıştır. İlaç keşfi süreci, CF, astım ve KOAH gibi akciğer hastalıklarını tedavi edebilen eski ve yeni anti-inflamatuar moleküllerin geliştirilmesi ve optimizasyonu üzerine odaklanmıştır. Bu yeni kimyasal varlıklar, akıllı klinik deneylerin tasarımını kolaylaştırmak için belirli klinik fenotiplerle bağlantılı olabilen hayvan modellerinde hızlı ve rahat bir şekilde test edilmelidir.

Protokol

Tarif edilen hayvan deneyleri, Verona Üniversitesinde Deneysel Araştırmalar Servisi Dairelerarası Merkezi tarafından hayvan deneyleri için yerel hayvan refahı komitesi tarafından onaylandı ve Avrupa Yönergesi 2010/63 UE, İtalyan D.Lgs 26/2014 ve revize edilmiş "Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Rehber", Washington, DC: National Academy Press, 1996. Bu protokol ve deney Ulusal Sağlık Enstitülerince onaylandı (n 273/15). Hayvanlar, standart kemirgen tavuğuna ve yumuşatılmış musluk suyuna serbestçe girdiler ve lokal vivaryum koşullarına (oda sıcaklığı: 20 - 24 ° C, bağıl nem:% 40 - 70, açık-karanlık döngü: 12 saat) en az 5 gün boyunca uyum sağladılar. ) Herhangi bir tedaviden önce.

1. In Vivo Gen Dağıtımı

1. İn vivo dağıtım reaktifi / nükleik asit komplekslerini hazırlamak için bir laminer akış başlığı kullanın.
2. Deney protokolünü a veNd parametreler üreticinin in vivo talimatlarını izleyerek.
   1. Fare başına toplam 200 μL kompleks enjeksiyon hacmi kullanın.
   2. Endotoksin içermeyen suya asılı 40 μg DNA ile başlayın; Optimizasyon aralığı 60 μg'a ulaşabilir.
      NOT: Enjeksiyon hacmindeki nükleik asidin nihai konsantrasyonu üreticinin talimatlarına göre 0.5 μg / μL'yi geçmemelidir.
   3. 6 - 8 N / P oranı kullanın (nükleik asit μg başına 0,12 - 0,16 μL iletim reaktifı). İlgili reaktif miktarını hesaplayın.
      NOT: Etkili hücre girişi için kompleksler katyonik olmalıdır. N / P oranı, nükleik asit fosfat (P) başına in vivo doğum reaktifi üzerindeki nitrojen artıkları sayısı (N) olarak tanımlanır ve kompleksler içindeki iyonik denge ölçüsünü temsil eder.
3. % 5 glukoz (nihai konsantre) içindeki nükleik asidin hesaplanan miktarını (adım 1.2.1'e bakınız) sulandırınızRasyon)% 10 glukoz stok solüsyonu (sağlandı) ve steril su kullanılarak yapıldı. Seyreltme hacminin, son enjeksiyon hacminin yarısı olduğundan emin olun. Yavaşça girinti yapın veya aşağı yukarı pipet ile karıştırın.
4. Hesaplanan miktarı (bkz. Adım 1.2.3)% 10 glukoz stok solüsyonu (sağlanan) ve steril su kullanarak% 5 glikozun enjeksiyon hacminin yarısına (son konsantrasyon) seyreltin. 15 saniye boyunca 13.000 xg hızla girdaplayın ve döndürün.
5. Seyreltilmiş nükleik aside yukarıdaki seyreltilmiş dağıtım reaktiflerini bir kerede ekleyin. Onları hafifçe vorteksleyerek karıştırın ve 15 saniye süreyle 13.000 xg hızla bastırın.
6. Karışımı, adım 1.5'deki oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
   NOT: Bu noktadan itibaren, kompleksler oda sıcaklığında 4 saat ve 4 ° C'de saklandığında 7 gün boyunca stabildir.
7. Oda sıcaklığında dengelenmiş kompleksleri kullanarak kuyruk-damar enjeksiyonları uygulayın. Damar genişlemesine izin vermek için fare kuyruğu sıcak suya (50 - 53 ° C) 30 saniye boyunca yerleştirilir.
   1. Fare tutucu cihazın içine yerleştirin. Kuyruk damarına 20-30 ° açı ile 27-30 gauge iğne yerleştirin ve yavaşça 200 mcL enjekte edin. Tamamlandıktan sonra, iğneyi çıkarın ve enjeksiyon bölgesine baskı uygulayın.
      NOT: Enjeksiyon esnasında kuyrukta hafif bir çıkıntı, hatalı konumlamayı belirtir. Bu gerçekleşirse, iğneyi çıkarın ve prosesi bir önceki bölgeye yakın bir yerde tekrarlayın.
8. İntravenöz enjeksiyondan 24 ve 48 saat sonra in vivo BLI (adım 2'ye bakınız) uygulayarak gen ekspresyonunu görselleştirin.

2. In Vivo BLI

NOT: Önceden, DPBS'de 15 mg / mL D-luciferin içeren taze bir stok solüsyonu hazırlayın, 0.22 μm filtreleme birimi kullanarak filtre sterilize edin ve -20 ° C'de saklayın.

1. Fareleri açık pleksiglas anestezi odasına yerleştirin. İzofloran bölmesinin dolu olduğundan emin olun. Hayvanları anestezi etmeye hazır olduğunuzda, pompanın (lEft) ve oda (sağ) anahtarları açıktır. İndüksiyon için izofluran kadranını% 2.5'e ve bakım için% 2'ye çevirin. IVIS odasındaki hayvanlar, görüntü alımı sırasında% 2.5 izofluoran anestezisi altında tutulmaktadır.
2. Fareler tamamen anestezi edildikten sonra, görüntülemeden 15 dakika önce intraperitoneal bir yolla D-luciferase solüsyonundan 10 mL / kg vücut ağırlığı enjekte edin.
   NOT: D-luciferase uygulanmasından sonra sinyal tepe noktasının zamanını belirlemek için D-luciferase üzerinde kinetik bir çalışma yapılmalıdır.
3. In vivo görüntüleme sistemini açın ve bir siyah kart stoğu ile astarlayarak görüntüleme haznesini hazırlayın (tamamlandıktan sonra atın). Doğru anestezi için burun konilerini yerleştirin (fare başına bir koni kullanın).
   NOT: Anestezi cihazına besleyen tüp bölünür ve böylece aynı konsantrasyonda anestezi görüntüleme sistemi içerisindeki anestezi manifoldlarına bağlanır.
4. Farelerden (5'e kadar) b'denÖküzün görüntü sistemindeki manifolda bağlanan burun kozlarına sokun ve kapıyı kapatın. Görüntü alımı 5 dakika sürer.
5. Üreticinin yazılımını kullanarak aşağıdaki gibi bir BLI edinin.
   1. Yazılımı başlat. In vivo görüntüleme sistemi edinme kontrol panelinde Lüminescent'ın yanında bir onay işareti koyun. Uyarıcı Filtresi ayarının Blok olduğunu ve Emisyon Filtresi ayarının Açık olduğunu doğrulayın.
   2. Okları tıklatın: Lüminesans Görüntüleme Modu için, 5 dk. Pozlama süresi, Binning 8 ve F / Stop 1; Fotoğraf Görüntüleme Modu için Binning 4 ve F / stop 8'i seçin.
   3. Alan Görünümü açılır listesinden, D, 19 cm ve 1.5 cm'lik bir Konu Yüksekliği seçin. Görüntüyü elde etmeye hazır olduğunda Kazanın'ı tıklayın.
6. Görüntü alımı tamamlandığında, fareleri tekrar kafeslerine yerleştirin.
7. Üreticinin yazılımını kullanarak belirli bölgelerden gelen fotonları nicelleştirin.
   1. Click ROI Araçları'nı seçin. ROI Tools'da , Type açılır listesinden Measurement ROI'yi seçin.
   2. Kare simgesini tıklayın ve bir hayvanın göğüs ağzını kapatacak uygun boyutlara sahip bir Kare ROI çizin. Aynı boyutlara sahip ROI'ler edinmek için her bir hayvanın ROI'sını kopyalayıp yapıştırın. ROI Tools panelinde, ROI'lerdeki toplam yoğunluğun ölçümlerini elde etmek için ROI Ölçümünü tıklayın.
   3. Bir oturum sırasında görüntüler veya dizilerde yaratılan tüm ROI'ler için ROI Ölçümleri verilerine (bir satır başına bir ROI) dikkat edin. Dışa Aktar'ı tıklayın ve dosyanın kaydedileceği klasörü seçin.

3. Pro-Inflamatuar Stimuliler ile Fare Mücadelesi

NOT: Pro-inflamatuar uyaranlarla fare meydan okumadan önce, i n vivo BLI ile bazal aktivasyonu kontrol edin (bkz. Adım 2). İn vivo gen aktarımı ve mous arasında en az 7 gün geçmesi gerekirHafif ve geçici inflamasyonun ortadan kalkmasına izin vermek için meydan okumak.

1. Ekipmanı intrakrakeal instilasyon için hazırlayın ( Şekil 1 ve Şekil 2'ye bakın ).
   1. 5 ml tek kullanımlık şırıngayı yay (C, E), 100 mcL'lik bir şırınga (B) ve tek kullanımlık bir gösterge (D) ile 3 yönlü durdurma musluğuna (A) bağlayın. Sistemi desteği (H) üzerine yerleştirin. Sistemi desteği (H) üzerine yerleştirin.
   2. PE190 mikro tıbbi tüpünü (F) tek kullanımlık gösterge (D) ve kalem yüzyılı (G) arasına bağlayın.
   3. 5 mL'lik şırıngayı 800 mcL hava ile doldurun ve 3 yönlü durdurma kancasını çevirin.
      NOT: 100 ul'lik şırıngada 50 ul aspirasyon yapılarak tüp Pseudomonas aeruginosa kültür süpernatanı ile doldurulmalıdır .

Şekil 1: Şematik Temsilİntratrakeal Cihazın Tek Bir Bileşeninin Belirlenmesi.
( B) 100-μL Hamilton şırınga, (C) tek kullanımlık 5-mL şırınga, (D) tek kullanımlık gösterge, (E) yay ile tek kullanımlık 5-mL şırınga, (F) PE190 mikro tıbbi tüp , (G) kalem yüzyıl ve (H) destek. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 2: Birleştirilen İntrakrakel Cihazın Temsili.
Tanımlar Şekil 1'deki ile aynıdır. lütfen tıklayınBu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayın.

2. Farelerde oksijen ile karıştırılmış% 2.5 izofluran ayarlanmış bir izofluran gazı bölmesini kullanarak anestezi uygulayın.
3. Anesteziklerin etkilerini 3-5 dakika sonra değerlendirmek için hayvanı izleyin.
   NOT: Farenin tamamen uyuşturulduğunu doğrulamak için aşağıdaki işaretleri dikkatli bir şekilde izleyin: yavaşlayan solunum hızı yavaşlar, boyun tarafından kaldırıldığında kol gerilmesi eksikliği ve arka bacaklar uyarıldığında tepki vermez. Birkaç dakika daha bekleyin ve bu ölçütler karşılanmazsa bir sonraki adıma geçmeden önce tekrar kontrol edin.
4. Anestezi uygulanmış fareyi pleksiglas entübasyon platformuna yerleştirin, telin üzerine yerleştirilmiş dişleri ile asın.
5. Laringoskopu sol eliyle açın (sağdan araştırmacılar için) ve bir çift küt uçlu forseps alın. Laringoskop ucunu ve forsepsi kullanarak ağzını hafifçe kaldırın.
6. Dili dışarı çekin ve saatlerce çekin.Forseps kullanarak yanlara doğru kaldırın. Laringoskop bıçağını ağzın arkasına doğru yönlendirin. Trakea açılıncaya kadar laringoskopu 90 derecelik açıyla hafifçe bastırın. Laringoskopu yerine tutun.
7. Diğer eli kullanarak, PE borusunun ucuna bağlı olan iletim borusunu alıp trakea sokun. İnokulumu sağlamak için üç yönlü valfi döndürün. Tüpü trakea mümkün olduğunca çabuk çekin. Akciğerlere inokulumun inhale edilmesini sağlamak için fareyi birkaç saniye dik tutun.
   NOT: Trakea çok uzun süre engellenirse fare boğar ve ölür.
8. Fareyi platformdan çıkarın. İyileşme süresi suşlara göre değişebilir; İşlemden sonra 30 dakika içinde hayvanın tamamen uyanık olduğundan emin olarak fareyi dikkatlice izleyin.
9. Intraperitoneal olarak 150 mg / kg D-luciferase enjekte edin ve akciğerleri in vivo bir görüntüleme sistemi kullanarak intratrakeal'den 4, 24 ve 48 saat sonra görüntüleyinUyarıcıların aşılanması. Üreticinin yazılımını kullanarak belirli bölgelerden gelen fotonları nicelleştirin.

Sonuçlar

BIL-8-Luc geçici transjenik fare modeli, salgılatılmış virülans faktörleri içeren konsantre bakteriel süpernatant (30x) ile uyarılan farelerde akciğer iltihaplanmasının in vivo olarak izlenmesi için kullanıldı. İndüklenen enflamatuar yanıt, in vivo görüntüleme ile BLI sinyalindeki bir artış olarak saptanabilirdi. Pro-inflamatuar aktivite instilasyondan 2.5 saat sonra açıkça saptanabilirken, BLI sinyali 5 ila 24 saat arasında en yüksek paya u...

Tartışmalar

Önceki bir çalışmada ¹¹ , bIL-8-Luc'a bağlı BLI ve BAL işaretleyicileri arasında bir kontrast gösterildi. Fare suşları ¹² içindeki duyarlılığın diferansiyel derecesine dayanırdı. Bu nedenle, bIL-8-Luc modelinin farklı bir fare suşuna uygulanması için, hem BLI hem de daha standart hale getirilmiş inflamatuvar belirteçler açısından inflamatuvar yanıta ilişkin ilk çalışma gereklidir.

Fare transfeksiyonu hafif ak...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
FMT 2500 Fluorescence Tomography System	Perkin Elmer Inc.	Experimental Builder
IVIS Lumina serie II Pre-clinical In Vivo; Imaging System	Perkin Elmer Inc.	Experimental Builder
MMPsense 750 FAST	Perkin Elmer Inc.	NEV10001EX	Protect from light, store the probe at 4 °C
Female inbred BalbC	Harlan Laboratories Italy		Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions
bIL-8-Luc plasmid	Department of Medical Veterinary Science, University of Parma, Italy		Store the plasmid at -20 °C
pGL3basic vector	Promega	E1751	Store the vector at -20 °C
JetPEI DNA transfection reagent	Polyplus transfection	201B-001G	The DNA and JetPEI mix was formulated with a final N/P ratio of 7
D-luciferin potassium salt 1 g	Perkin Elmer Inc.	122796	Protect from light, store at -20 °C
Living Image software	Caliper Life Sciences,	Experimental Builder
Isoflurane	ESTEVE spa	571329.8	Do not inhale
Bio-Plex Cytokine Assay Kit	Bio-Rad Laboratories	M60-009RDPD	Store the unopened kit at 4 °C
Automated cell counter	Dasit XT 1800J	Experimental Builder
Penn-century model DP-4M Dry power insufflator	Penn-century	DPM-EXT
Gas anesthesia system XGI-8	Perkin Elmer Inc.	Experimental Builder
PE190 micro medical tubing	2biological instruments snc	BB31695-PE/8
Syringe without needle 5 mL	Terumo	SS*05SE1	Cut the boards of the piston by a scissors
Hamilton 0,10 mL (model 1710)	Gastight	81022
Discofix 3-way Stopcock	Braun	4095111
Syringe with needle 1 mL	Pic solution	3,071,260,300,320	Use without needle
Plastic feeding tubes 18ga x 50 mm	2biological instruments snc	FTP-18-50	Cut obliquely the tip