قياس إشارة مستقبلات G- البروتينات عبر الملزمة غتب المسمى راديو

Summary

غوانوسين ثلاثي الفوسفات (غتب) ملزمة هي واحدة من الأحداث المبكرة في G- البروتينات مستقبلات (غر) تفعيل. يصف هذا البروتوكول كيفية وصف فارماكولوجيكال التفاعلات غر-يجند محددة عن طريق رصد ربط التناظرية غتب التناظرية، [ ³⁵ S] غوانوسين-5'- O- (3-ثيو) ثلاثي الفوسفات ([ ³⁵ S] غتبس)، في استجابة ل يجند من الفائدة.

Abstract

مستقبلات G- البروتين المقترنة (غكرز) هي عائلة كبيرة من مستقبلات الغشاء التي تلعب أدوارا حاسمة في علم وظائف الأعضاء الخلوية الطبيعية وتشكل هدفا رئيسيا الدوائية لعدة مؤشرات، بما في ذلك تسكين، وتنظيم ضغط الدم، وعلاج الأمراض النفسية. على يجند ملزمة، غكرز تحفيز تفعيل الخلايا G- البروتينات من خلال تحفيز دمج غوانوزين ثلاثي الفوسفات (غتب). تنشيط البروتينات G ثم تحفيز مسارات الإشارات التي تثير الاستجابات الخلوية. يمكن رصد إشارات غر عن طريق قياس دمج شكل راديولبلد وغير قابل للتحلل من غتب، [ ³⁵ S] غوانوسين-5'- O- (3-ثيو) ثلاثي الفوسفات ([ ³⁵ S] غتبس)، في G- البروتينات. وخلافا للأساليب الأخرى التي تقيم المزيد من عمليات التشوير المصب، [ ³⁵ S] غتبس ملزمة يقيس حدث داني في إشارات غر، والأهم من ذلك، يمكن أن يميز أغونيستيسي، المضادات، و منبهات معكوس. ويوضح هذا البروتوكول طريقة حساسة ومحددة لدراسة إشارات غكر باستخدام الاستعدادات الغشاء الخام من غر نموذجية، مستقبلات μ- الأفيونية (MOR1). على الرغم من وجود نهج بديلة لكسر الخلايا والأنسجة موجودة، وكثير منها باهظة التكلفة، مملة، و / أو تتطلب معدات المختبرات غير القياسية. توفر الطريقة الحالية إجراء بسيط يثري الأغشية الخام الوظيفية. بعد عزل MOR1، تم تحديد الخصائص الدوائية المختلفة من ناهض لها، [D-ألا، N-ميف، غلي-أول] -enkephalin (دامجو)، ومضاد، نالوكسون.

Introduction

مستقبلات G- البروتين المقترنة (غكرز) هي عائلة كبيرة من مستقبلات سطح الخلية المسؤولة عن مجموعة ملحوظة من العمليات الفسيولوجية، بما في ذلك تسكين، والشم، والسلوك ¹ . غرس تعمل عن طريق الاستشعار عن إشارات خارجية محددة وتحفيز في وقت لاحق إشارات الخلايا. وبالتالي فإنها تمثل مفترقا رئيسيا بين البيئات الخارجية والداخلية للخلية. ونظرا للدور الحاسم الذي تلعبه غرس في علم الأحياء، فقد أصبحت أهدافا رئيسية لكل من البحث الأساسي واكتشاف العقاقير ^{2 ، 3} .

وخلافا لأسر المستقبلات الأخرى التي تربط بروابط منفصلة، ​​غرس يمكن ربط أنواع مختلفة جدا من الجزيئات. في حين أن واحد غر قد تتفاعل مع الببتيدات، وآخر قد يشعر الفوتونات، جزيئات صغيرة، أو الأيونات ^{1 ، 4} . في حين أن بروابطها متنوعة، غرس موحدة في معماريتها العامةأور وظيفة. تتكون غرس الفردية تتكون من سبعة البروتينات α حلزونية الغشاء مع المحطات الأمينية خارج الخلية ومحطات الكربوكسيل داخل الخلايا ^{5 ، 6} . يقترن غرس إلى البروتينات G- البروتينات-هيتيروتريمريك المجمعات البروتين تتألف من α، β، و γ الوحدات الفرعية التي تتوسط مسارات الإشارات المختلفة ⁷ . الوحدة الفرعية G _α هو بروتين ملزم من النيوكليوتيدات غوانين وهو غير نشط عندما تكون ملزمة لغوسين ثنائي الفوسفات (غب) ونشطة عندما تكون ملزمة ل غوانوسين ثلاثي الفوسفات (غتب) ^{8 ، 9} . عندما ترتبط غكرز بروابطها، فإنها تخضع لتغيير تراكمي يسمح G _α للفصل من G _βγ ، مما يسمح G _α لتبادل الناتج المحلي الإجمالي ل غتب ⁷ . فوسفهوريلاتد نفسها في محطة الكربوكسيل من قبل مختلف سيرين / ثريونفي كيناز ^{10 ، 11} واستيعابها لتخفيف إشارات مستقبلات ^{12 ، 13 ، 14} . وفي الوقت نفسه، يتم تنشيط المونومر G _α و G _βγ ديمر لتنشيط مسارات الإشارات المميزة ⁷ . هناك العديد من الأشكال الإسوية لكل وحدة فرعية من البروتينات G، ويهدف كل شكل إسوي مسارات معينة في اتجاه المصب ونظم رسول ثانوية. وتشمل الأشكال الشكلية G _α الرئيسية G _s و G _q و G _{i / o} و G _12-13 . عادة، غرس الفردية المرتبطة مع إيسوفورم G _{α معينة} ، وبالتالي ربط حافز خارجي لاستجابة الخلوية محددة ¹ .

توصيف التفاعل غر-يجند أمر بالغ الأهمية لفهم البيولوجيا للمستقبلات. كما الناتج المحلي الإجمالي / تبادل غتب هو واحد من عشية أقربنتس يلي يجند ملزمة، ورصد غتب ملزمة يمكن قياس تنشيط غر أو تثبيط. إن فحص المزيد من أحداث المصب في إشارات غكر غالبا ما لا يكون كمي أو متكافئ، قد لا يميز منبهات كاملة من تلك الجزئية، ويمكن أن يتطلب الكواشف باهظة الثمن. وعلاوة على ذلك، زيادة غتب ملزمة للبروتينات G _α هو حدث شبه عالمي بعد تفعيل غر، وهذا يعني أن قياس غتب ملزمة هو مقايسة قابلة للتطبيق على نطاق واسع لرصد نشاط معظم غرس. قياس غتب ملزمة هو نهج بسيط وسريع لرصد الإشارات غر في الخلايا أوفيركسريسينغ مستقبلات من الفائدة أو في الأنسجة المحلية. هذا البروتوكول تفاصيل مقايسة ملزمة غتب وظيفية باستخدام غر النموذجية، مستقبلات μ- الأفيونية (MOR1)، لتحديد كميا نشاط ناهض ومضاد على إشارات غر.

يوضح هذا البروتوكول أولا كيفية عزل الأغشية الخام من الخلايا أوفيركسريسينغ MOR1. ملاحظة ثار هذا البروتوكول لا يقتصر على أنظمة أوفيركسريسيون ويمكن تطبيقها على العديد من مصادر الغشاء، بما في ذلك الأنسجة الأصلية أو الاستعدادات معربا عن مستقبلات متعددة والبروتينات G ¹⁵ . بروتوكول ثم تفاصيل كيفية قياس ملزم غتب التناظرية إلى هذه الأغشية ردا على تركيزات مختلفة من [D-ألا، N-ميف، غلي-أول] -enkephalin (دامجو) أو نالوكسون، ناهض MOR1 ومضاد، على التوالي. و غتب التناظرية، [ ³⁵ S] غوانوسين-5'- O- (3-ثيو) ثلاثي الفوسفات ([ ³⁵ S] غتبس)، غير قابلة للتحلل. هذه الخاصية أمر بالغ الأهمية لأن G _α الوحدات الفرعية تظهر النشاط غتباس جوهري ⁷ ، والقضاء على فوسفات غاما المسمى على مادة كيميائية غتب هدروليزابل. ثم يتم حبس الأغشية على مرشحات الألياف الزجاجية وغسلها، وبعد ذلك يتم تحديد غتب راديولبلد بواسطة العد التلألؤ السائل. يمكن اشتقاق المعلمات الدوائية متعددة إلى تشاراكتريزه التفاعل المستقبلي-يجند، بما في ذلك الاستجابة نصف القصوى (إيك ₅₀ ) ومعامل هيل (ن _H ) للالمضادات والتركيز مثبط نصف القصوى (إيك ₅₀ ) والتوازن التفكك ثابت (K _ب ) للمضادات ^{16 و 17 ، 18} .

Protocol

1. التعبير عن ريكومبينانت ها-MOR1 في الخلايا المستزرعة

ملاحظة: اتبع جميع بروتوكولات ثقافة الخلية في غطاء تدفق الصفحي العقيمة.

1. تعقيم ثقافة الخلية الصفحي تدفق غطاء محرك السيارة مع الايثانول 70٪ والحفاظ على تقنية معقمة في جميع أنحاء ثقافة الخلية.
2. إعداد خلايا الكلى الجنينية البشرية 293 (HEK293) خلية استزراع المتوسطة، كاملة دولبيكو المعدلة النسر المتوسطة (دمم): دمم، ودرجة الحموضة 7.4، تستكمل مع 2 ملي L- الجلوتامين، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين، و 10٪ مصل بقري الجنين (فبس ).
3. لوحة 2.5 × 10 ⁶ HEK293 الخلايا على 10 سم لوحة زراعة الأنسجة في 10 مل من دمم كاملة واحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ كو ₂ حتى 70-80٪ يتم التوصل كونفلنسي (O / N).
   ملاحظة: لجمع ما يكفي من البروتين لتجربة كاملة ملزمة غتب، لوحة لا يقل عن 3 × 10 سم لوحات من الخلايا.
4. ترانسفيكت الخلايا مع ها-MOR1 باستخدام كاشف ترنسفكأيشن من الاختيار وباتباع الشركة المصنعة "؛ المبادئ التوجيهية. احتضان لمدة 36-48 ساعة.
   ملاحظة: الإنسان مور-1 [كدنا (نسبي مرجع تسلسل: NM_000914.4) كان هدية سخية من غافريل باسترناك واستنسخت في بمف-ها.

2. تجزئة الخلية وجمع الغشاء

1. إعداد مخازن تحلل التالية:
   1. العازلة 1: 10 ملم 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبيرازينيثانسولفونيك حمض (هيبيس)، ودرجة الحموضة 7.4. 1 ملي إثيلين غليكول-بيس (β-أمينو إيثيل إيثر) -N، N، N '، N'-تيتراسيتيك أسيد (إغتا)؛ 10٪ السكروز. بروتيز المانع كوكتيل. و 1 ملي ديثيوثريتول (دت). إضافة دت جديدة في يوم العزلة الغشاء.
   2. العازلة 2: 10 ملي هيبيس، ودرجة الحموضة 7.4. 1 ملي إغتا؛ 1 ملي مغكل ₂ ؛ و 1 ملم دت. إضافة دت جديدة في يوم العزلة الغشاء.
2. إزالة الخلايا ترانزفكتد من الحاضنة (الخطوة 1.4)، نضح المتوسطة، وشطف الخلايا مع 5 مل من الجليد الباردة الفوسفات مخزنة المالحة (بس). نضح برنامج تلفزيوني والسائل الزائد منالطبق.
3. إضافة 600 ميكرولتر من العازلة 1 إلى الخلايا. باستخدام مكشطة الخلية، طرد الخلايا من سطح اللوحة وماصة تعليق الخلية في أنبوب ميكروسنتريفوج 1.6 مل.
4. على الفور المفاجئة تجميد أنبوب ميكروسنتريفوج في النيتروجين السائل. مرة واحدة يتم تجميد العينات، ذوبان الجليد المحللة على الجليد أو وضعها في -80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
5. كرر الخطوات 2.3 و 2.4 مع جميع لوحات الخلايا.
6. مرة واحدة قد ذوبان المحللات، واستخدام واحد النبض الجزئي أنبوب الخالط لكسر فتح الخلايا. نبض الخالط 3-5 مرات لمدة 10 ثانية، ووضع أنبوب مرة أخرى على الجليد لمدة 30 ثانية بين البقول.
   1. جمع 20 ميكرولتر كما جزء خلية كاملة.
7. الطرد المركزي العينة المتبقية لمدة 10 دقيقة في 1000 x ج و 4 درجة مئوية. جمع طاف ومكان في 1.6 مل أنبوب ميكروسنتريفوج جديد على الجليد.
8. ريسوسبيند بيليه في 100 ميكرولتر من العازلة 1 و ريهوموجينيز مع مدقة. نبض هوموجينيزر 3-5 مرات لمدة 5 ثوان، ووضع أنبوب مرة أخرى على الجليد لمدة 30 ثانية بين البقول.
   1. أجهزة الطرد المركزي العينة مرة ثانية لمدة 10 دقيقة في 1000 x ج و 4 درجة مئوية. الجمع بين طاف مع طاف من الخطوة 2.7.
      ملاحظة: يحتوي على بيليه المتبقية النووية والبروتينات الغشاء.
9. الطرد المركزي سوبيرناتانتس مجتمعة لمدة 20 دقيقة في 11000 x ج و 4 درجة مئوية. فصل طاف (جزء عصاري خلوي) إلى 1.6 مل أنبوب ميكروسنتريفوج جديد.
10. ريسوسبيند بيليه في 200 ميكرولتر من العازلة 2. تجانس بيليه بواسطة تريتوراتينغ 3-5 مرات. الطرد المركزي العينة لمدة 20 دقيقة في 21،100 زغ و 4 درجة مئوية. نضح طاف. ريسوسبيند الكرية التي تحتوي على جزء غشاء الخام في 50 ميكرولتر من العازلة 2.
11. انتقل فورا إلى التجارب ملزمة غتبس (القسم 3) أو المفاجئة تجميد في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية.

3. [ ³⁵ S] غتبس ملزمة

ملاحظة: استخدام بروتوكول السلامة الكيميائية الإشعاعية القياسية عند التعامل مع [ ³⁵ S] غتبس وعند إجراء [ ³⁵ S] غتبس ملزمة التجارب. ارتد القفازات الواقية ومعطف المختبر في جميع الأوقات. تحقق من مواد التعبئة والتغليف للتسرب أو الشقوق. التخلص من النفايات والكواشف الزائدة وفقا للبروتوكولات المؤسسية.

1. إعداد غير ملزمة ملزمة ملزمة (إب) عن طريق خلط 50 ملي هيبيس، ودرجة الحموضة 7.4. 5 ملي MgCl2؛ 100 ملي كلوريد الصوديوم؛ و 1 ملي إيثيلينديامينتيتراسيتيك حمض (إدتا) في الماء المقطر.
2. تمييع الأسهم [ ³⁵ S] غتبس إلى 50 نانومتر في 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.6، و 10 ملي دت. جعل 500 أليكوتس ميكرولتر وتخزينها في -80 درجة مئوية. استخدام فقط قسامة ذوبان حديثا مباشرة قبل بدء التجربة. ذوبان الجليد، أليكوتس، عن، إكتسى بالجليد.
3. إعداد غتبس نونراديو المسمى عن طريق إذابة 1 ملغ من مسحوق غتبس في 177.62 ميكرولتر من الماء النقي لتركيز الأسهم من 10 ملم. جعل قسامة 10 ميكرولتر وتخزينها في-20 درجة مئوية.
4. إعداد عازلة ملزمة كاملة (مصرف البحرين المركزي) عن طريق تكملة إب لتشمل تركيز النهائي من 1 ملم دت، 0.1٪ (وزن / حجم) ألبومين المصل البقري (بسا)، 10 الناتج المحلي الإجمالي ميكرومتر، و 0.1 نانومتر [ ³⁵ S] غتبس.
   ملاحظة: يحتوي مصرف البحرين المرکزي الآن علی غتب مشع من قبل راديولبلد. اتخاذ احتياطات السلامة المناسبة أثناء العمل مع الحلول المشعة.
5. ذوبان الجليد جزء الغشاء من الخطوة 2.11 على الجليد.
6. تحديد تركيز البروتين من جزء غشاء عن طريق فحص البروتين برادفورد باستخدام الطيفي في 595 نانومتر.
   1. إعداد سلسلة التخفيف من معايير البروتين بسا مع العازلة 2، في تركيزات النهائية من 0، 250، 500، 750، 1،500، 2،500، و 5،000 ميكروغرام / مل.
   2. إضافة 2 ميكرولتر من كل معيار أو غشاء إلى 1 مل من برادفورد كاشف في كوفيت. مزيج دقيق من قبل فورتيكسينغ.
   3. ضبط الطيف إلى الطول الموجي من 595 نانومتر وفراغ باستخدام كوفيت مع 0 ميكروغرام / مل من البروتين.
   4. انتظر 5 دقائق و rإيد كل من المعايير وكل من العينات في الطول الموجي 595 نانومتر.
   5. رسم الامتصاصية للمعايير مقابل التركيز. وباستخدام قانون بير لامبرت (A = εcl، حيث ε = معامل الانقراض، l = طول كوفيت، و c = تركيز)، احسب تركيز عينات الغشاء.
7. تمييع الكسور الغشاء إلى تركيز 100 ميكروغرام من البروتين / مل في إب.
   ملاحظة: واحد 10 سم طبق من خلايا HEK293 ينتج عادة بين 1 و 3 ملغ بروتين / مل.
8. إعداد الظروف التجريبية التالية في الفردية 1.6 مل أنابيب ميكروسنتريفوج: سلسلة التخفيف يجند، شرط النشاط القاعدي لقياس غتب القاعدية ملزمة، وحالة ملزمة غير محددة لقياس غير محددة غتب ملزمة.
   1. لسلسلة التخفيف يجند، وإعداد سلسلة التخفيف من يجند من الفائدة في الحجم النهائي من 100 ميكرولتر من مصرف البحرين المركزي. إعداد سلسلة يجند في 2X كونسنتراتي النهائي المطلوبالإضافات. الفضاء تركيزات يجند لتغطية كافية مجموعة من الردود.
      1. لتقييم تأثير دامجو على غتب ملزمة عبر MOR1، وإعداد التخفيفات دامجو من 2 ملم، 200 ميكرومتر، 20 ميكرومتر، 2 ميكرومتر، 200 نانومتر، 20 نانومتر، 2 نانومتر، 200 ص / ب، 20 م، 2 م في مصرف البحرين المركزي (النهائي حجم: 100 ميكرولتر).
         ملاحظة: على سبيل المثال، إذا كان يجند الفائدة لديه قيمة إيك ₅₀ المتوقعة من 10 ميكرومتر، وإعداد التخفيفات يجند من 200 نانومتر، 2 ميكرومتر، 20 ميكرومتر، 200 ميكرومتر، و 2 ملم. هذه الشروط الخمسة تغطي مجموعة واسعة من تركيزات و 2 X التركيز المطلوب للمقايسة.
   2. للالتزام القاعدي، وإعداد أنبوب مع 100 ميكرولتر من مصرف البحرين المركزي فقط.
   3. لملزم غير محدد، وإعداد أنبوب مع 99 ميكرولتر من مصرف البحرين المركزي تستكمل مع 1 ميكرولتر من 2 ملم غتبس نونراديو المسمى.
9. إضافة 100 ميكرولتر من محلول الغشاء المخفف (الخطوة 3.7) إلى كل حالة تجريبية.
10. احتضان الأغشية مع مختلف إكسيريمالظروف في إنتال 1.6 مل أنابيب ميكروسنتريفوج لمدة 30 دقيقة في 25 درجة مئوية في ثيرموميكسر أو على شاكر المداري.

4. غشاء الترشيح

1. إعداد غسل العازلة من خلال الجمع بين 50 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4. 5 ملي مغكل ₂ ؛ و 50 ملي كلوريد الصوديوم في الماء المقطر.
2. بريسواك مرشحات الألياف الزجاجية في الماء لمدة 10 دقيقة.
   ملاحظة: مرشحات لها حجم المسام من 1 ميكرون، يبلغ قطرها 2.1 سم، وسمك 675 ميكرون.
3. إزالة العينات من ثيرموميكسر أو شاكر المداري (الخطوة 3.10). لفترة وجيزة نبض تدور العينات لمدة 5 ثوان لجمع كل عينة في الجزء السفلي من الأنبوب.
4. إزالة غطاء جهاز الترشيح الفراغ. وضع المرشحات بريسواكيد على منافذ فراغ الجهاز. أعد تأمين غطاء الجهاز لتشكيل ختم فراغ. بدوره على الفراغ.
5. ماصة 195 ميكرولتر من كل 200 ميكرولتر حالة تجريبية على مرشحات لتقليل الخطأ من الامتزاز إلى جدران الأنبوب و / أو من الماصةتينغ.
6. غسل المرشحات ثلاث مرات مع 1 مل من غسل الجليد العازلة الباردة.

5. التلألؤ السائل العد

1. وضع 5 مل تلألؤ العد قارورة في رف العد. إضافة 5 مل من سائل التلألؤ إلى كل قارورة.
2. إيقاف فراغ (الخطوة 4.4). إزالة غطاء جهاز الترشيح الفراغ. باستخدام ملاقط، والتقاط الفلاتر من الموانئ فراغ جهاز الترشيح وإسقاط كل مرشح إلى 5 مل قارورة التلألؤ الفردية.
3. إعداد قارورة واحدة مع 195 ميكرولتر من مصرف البحرين المركزي لتحديد إشارة القصوى.
4. كاب كل قارورة بشكل آمن. احتضان قارورة على شاكر المداري في 25 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
5. قم بتشغيل عداد التلألؤ. برنامج عداد التلألؤ لقياس ³⁵ S نظائر الانبعاثات لمدة 5 دقائق لكل عينة باستخدام برنامج التلألؤ القياسية المرتبطة.
6. اضغط على "ابدأ" لاتخاذ العد.
7. عندما يتم العد، والتخلص من قارورة عدهاك النفايات الخطرة.

6. تحليل البيانات

1. أدخل البيانات في الإحصاءات وتحليل البرمجيات.
   1. طرح ملزمة غير محددة من كل من القياسات الأخرى لتحديد ملزمة محددة.
      ملاحظة: يتم تحديد درجة الارتباط غير محددة من قبل العينة المحتضنة مع غتبس غير راديولبلد (الخطوة 3.8.3).
   2. افتح الإحصاءات وتحليل البرمجيات وحدد إدخال مجموعة بيانات زي.
   3. أدخل بيانات الربط المحددة من تجارب ربط [ ³⁵ S] غتبس في جدول بيانات في برنامج الإحصاءات والتحليل. أدخل تركيزات ناهض، وتركيزات المولي، في العمود "X". أدخل التهم ³⁵ S المرتبطة كقيم "Y".
2. تحويل البيانات.
   1. تحويل القيم X إلى لوغاريتم كل منها عن طريق النقر على "تحليل". حدد "تحويل" من المدمج في طn.
   2. ضمن مربع الحوار "تحويل"، حدد "تحويل القيم X باستخدام" وحدد الدالة "X = لوغ (X)". اختر إنشاء رسم بياني جديد للنتائج.
   3. انقر فوق موافق."
3. تطبيع القيم Y.
   1. عند عرض النتائج المحولة، انقر على "تحليل". حدد "تطبيع" من التحليلات المضمنة.
   2. ضمن مربع الحوار "تطبيع"، حدد زر الاختيار لتحديد 0٪ ك "أصغر قيمة في كل مجموعة بيانات" و 100٪ ك "أكبر قيمة في كل مجموعة بيانات". حدد المربع لعرض النتائج كنسب مئوية. حدد المربع لإنشاء رسم بياني جديد للنتائج.
   3. انقر فوق موافق."
4. تناسب منحنيات الانحدار غير الخطية للبيانات المخططة. إجراء تحليل الانحدار غير الخطية.
   1. مع عرض النتائج المطورة، انقر فوق "تحليل". من التحليلات المضمنة، حدد "الانحدار غير الخطية (منحنى مناسبا)."
   2. إذا كان التحقيق في ناهض، حدد "سجل (ناهض) مقابل استجابة طبيعية - المنحدر متغير" من مربع الحوار.
   3. إذا كان التحقيق في خصم، "حدد سجل (خصم) مقابل استجابة طبيعية - المنحدر متغير" من مربع الحوار.
   4. انقر فوق موافق."
5. راجع الرسم البياني والنتائج لضمان توافق البيانات والبيانات بشكل معقول. تأكد من أن الانحدار يطابق النمط العام للبيانات المرسومة وأن البقايا ليست كبيرة بحيث تجعل منحنى الجرعة والاستجابة مسطح.
   ملاحظة: سيقوم البرنامج تلخيص نتائج الانحدار غير الخطية وتفاصيل التركيز الذي ينبع من استجابة نصف القصوى (إيك ₅₀ )، ومعامل هيل (ن _H )، والتركيز مثبط نصف القصوى (إيك ₅₀ ).
6. مشتق ناهض / مضاد المعلمة قوة.
   1. اشتقاق ناهض إك(K _b ) من أي من التجارب التالية ^{16 ، 17 ، 18}
      1. تقييم التحول في الجرعة والاستجابة من ناهض في المنافسة مع تركيز ثابت من الخصم. هنا، إيك ₅₀ '= إيك ₅₀ (1 + [مضاد] / خصم كب)، حيث إيك ₅₀ ' هو التحول إيك ₅₀ الصحيح.
      2. تقييم [ ³⁵ S] غتبس ملزمة مع تركيزات مختلفة من خصم في المنافسة مع تركيز ثابت من ناهض. هنا، K _b = إيك ₅₀ / (2 + ([أغونيست] / أغونيست إيك ₅₀ ) ⁿ ) ^{1 / n} - 1، حيث n هو معامل هيل للناهض.
7. اعتمادا على تباين البيانات، كرر التجربة (الخطوات 3،3-5،6) لكل يجند حوالي 3-5 مرات ومتوسط ​​النتائج باستخدام إحصاءات وتحليل سوفتول.

النتائج

يمكن استخدام تجزئة الخلية لعزل وإثراء البروتينات المرتبطة بالغشاء من البروتينات الخلوية الخلوية والبروتينات النووية. الشكل 1 هو لطخة غربية مما يدل على محتويات الكسور الأولية الثلاثة التي يمكن جمعها خلال عملية تجزئة تحت الخلوية. عل...

Discussion

يصف هذا البروتوكول طريقتين منفصلتين ولكن تكميليتين: نهج بسيط لتجزئة الخلايا والأنسجة إلى مقصورات واسعة ولكنها متميزة ووسيلة للتحقيق في إشارات غر عن طريق قياس [ ³⁵ S] غتبس ملزمة.

تجزئة الخلوية فعالة لديها مجموعة واسعة من التط?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine	Thermo Fisher Scientific	10313021	Warm in 37°C water bath before use
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081	Warm in 37°C water bath before use
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	Warm in 37°C water bath before use
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985070	Warm in 37°C water bath before use
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16000044	Warm in 37°C water bath before use
Cell culture 10-cm plate	Sigma-Aldrich	CLS430167
Lipofectamine 3000 reagent	Thermo Fisher Scientific	L3000-008
1.6 mL microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma-Aldrich	H3375
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Trizma base)	Thermo Fisher Scientific	BP152-1
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E3889
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E9884
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5016
cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	2900
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	DO632
Sodium chloride (NaCl)	Thermo Fisher Scientific	BP358-1
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M1028-1
Pellet pestles motor	Sigma-Aldrich	Z359971
Pestles	Bel Art	F19923-0001
Bovine serum albumin (BSA)	Affymetrix	10857
[35S]guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTPγS)	Perkin Elmer	NEG030H
non-radiolabeled guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate (GTPγS)	Sigma-Aldrich	89378
guanosine diphosphate (GDP)	Sigma-Aldrich	51060
Bradford reagent	Bio-Rad	5000006
UV/VIS spectrophotometer	Beckman Coulter	DU640
spectrophotometer cuvettes	USA Scientific	9090-0460
orbital shaker	Thermo Fisher Scientific	2314
thermomixer	Eppendorf	535027903
glass fiber filters	GE Healthcare Life Sciences	1821-021
vacuum filtration apparatus	Millipore Corporation	XX2702550
desktop microcentrifuge	Eppendorf	65717
Scintillation counter	Beckman Coulter	LS6500
scintillation fluid	Ecoscint A	LS-273
scintillation counter vials	Beckman Coulter	592690
scintillation vial lids	Beckman Coulter	592928
Prism 6	GraphPad Software	PRISM 6
ATP1A1 antibody	Developmental Studies Hybridoma	a6F	1:1000 in 3% BSA
GAPDH antibody	EMD Millipore	CB1001	1:5000 in 3% BSA
H2B antibody	Cell Signaling	2934S	1:2500 in 3% BSA
PDI antibody	Cell Signaling	3501S	1:1000 in 3% BSA
HA antibody	Roche	11867423001	1:2000 in 3% BSA