Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Guanosine triphosphate (GTP) מחייב הוא אחד האירועים המוקדמים G-Protein-Coupled קולטן (GPCR) ההפעלה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לאפיין באופן פרמקולוגי אינטראקציות ספציפיות GPCR-ligand על ידי ניטור מחייב של אנלוגי GTP, שכותרתו רדיו, [ 35 S] guanosine-5'-O- (3-thio) triphosphate ([ 35 S] GTPγS), in תגובה ליגנד של עניין.

Abstract

קולטני G-Protein-Coupled (GPCRs) הם משפחה גדולה של קולטני טרנסממברנים, הממלאים תפקידים קריטיים בפיזיולוגיה הסלולרית הרגילה ומהווים יעד פרמקולוגי חשוב לאינדיקציות מרובות, כולל כאבים, ויסות לחץ דם והטיפול במחלות פסיכיאטריות. עם ליגנד מחייב, GPCRs מזרז את ההפעלה של חלבונים G תאיים על ידי גירוי שילוב של trianosphate guanosine (GTP). G- חלבונים מופעלים מכן לעורר נתיבי איתות המעורר תגובות הסלולר. ניתן לפקח על איתות GPCR על-ידי מדידת שילוב של רדיופלאד ולא-הידרוליזה של GTP, [ 35 S] ganosine-5'-O- (3-thio) triphosphate ([ 35 S] GTPγS), לתוך חלבונים G. שלא כמו שיטות אחרות המעריכות תהליכי איתות נוספים במורד הזרם, [ 35 S] מחייב GTPγS מודד אירוע פרוקסימלי בסימון GPCR, וחשוב מכך, ניתן להבחין בין agonisטס, אנטגוניסטים, אגוניסטים הפוכה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה רגישה וספציפית לחקר איתות GPCR תוך שימוש בהכנות ממברנות גולמיות של GPCR ארכיטיפי, הקולטן מסוג אופיואיד (MOR1). למרות גישות חלופיות לתאים ורקמות מופרדים קיימים, רבים הם עלות אוסרני, מייגע, ו / או דורשים ציוד מעבדה לא סטנדרטית. השיטה הנוכחית מספקת הליך פשוט המעשיר קרום גולמי תפקודי. לאחר בידוד MOR1, תכונות פרמקולוגיות שונות של אגוניסט, [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -נקפאלין (DAMGO), ואנטגוניסט, naloxone, נקבעו.

Introduction

G-RPRs (GPCRs) הם משפחה גדולה של קולטני שטח התא האחראים על מגוון מדהים של תהליכים פיזיולוגיים, כולל שיכוך כאבים, ריפוי והתנהגות 1 . GPCRs לפעול על ידי חישה אותות חיצוניים ספציפיים ולאחר מכן מגרה איתות תאיים. לכן הם מציינים צומת מפתח בין הסביבות החיצוניות והפנימיות של התא. בשל התפקיד הקריטי GPCRs לשחק בביולוגיה, הם הפכו מטרות מרכזיות הן במחקר בסיסי גילוי סמים 2 , 3 .

בניגוד למשפחות קולטן אחרות המחברות ליגנים נפרדים, GPCRs יכול לקשור סוגים שונים מאוד של מולקולות. בעוד אחד GPCR עשוי אינטראקציה עם פפטידים, אחר עשוי לחוש פוטונים, מולקולות קטנות, או יונים 1 , 4 . בעוד ligands שלהם הם מגוונים, GPCRs מאוחדים האדריכל הכולל שלהםUre ו פונקציה. GPCRs בודדים מורכבים של שבעה חלבונים טרנסממברניים α-הסליל עם מסופי אמינו תאיים מסופי carboxyl תאיים 5 , 6 . GPCRs מצמידים אל חלבונים G תאיים-קומפלקסים חלבונים הטרוטרימריים המורכבים α, β, ו γ יחידות משנה, אשר מתווך מסלולים איתות שונים 7 . G α יחידת משנה הוא חלבון נוקליאוטיד גוואנין מחייב כי הוא לא פעיל כאשר קשורה diphosphate guanosine (תוצר) ופעילה כאשר קשורה כדי triphosphate guanosine (GTP) 8 , 9 . כאשר GPCRs לאגד ligands שלהם, הם עוברים שינוי קונפורמציה המאפשר G α לנתק מ G βγ , ובכך מאפשר G α להחליף התמ"ג עבור GTP 7 . הקולטן עצמו הוא phosphorylated במסוף carboxyl שלה על ידי serine / threon שוניםIne קינאזות 10 , 11 ו מופנם להפחתת קולטן איתות 12 , 13 , 14 . בינתיים, מופעל מונומר G α ו G βγ dimer להמשיך להפעיל נתיבי איתות שונים 7 . ישנם מספר איזופורמים של כל יחידת משנה של חלבונים, וכל איזופורם מכוון למסלולים במורד הזרם ובמערכות שליחים משניות. האיזופורמים העיקריים של G α כוללים G, G q , G / i , ו- G 12-13 . בדרך כלל, GPCRs בודדים מקשרים עם איזופורם G α מסוים , ובכך מקשרים גירוי חיצוני לתגובה תאית ספציפית 1 .

אפיון אינטראקציה GPCR-ligand הוא קריטי להבנת הביולוגיה של הקולטן. כמו התמ"ג / חילופי GTP הוא אחד הראשונים ערבNts כי בעקבות ליגנד מחייב, ניטור GTP מחייב יכול למדוד הפעלה GPCR או עיכוב. Assaying יותר אירועים במורד GPCR איתות הוא לעתים קרובות לא כמותי או stoichiometric, לא יכול להבחין אגוניסטים מלאים מחלקיקים, והוא יכול לדרוש ריאגנטים יקר. יתר על כן, הגדלת GTP מחייב חלבונים G α הוא אירוע כמעט אוניברסלי לאחר ההפעלה GPCR, כלומר מדידה GTP מחייב הוא assay ישים נרחב לניטור הפעילות של GPCRs ביותר. מדידת GTP מחייב היא גישה פשוטה ומהירה לפקח איתות GPCR בתאים overexpressing קולטן של עניין או רקמות הילידים. בפרוטוקול הנוכחי פרטים assay פונקציונלי GTP מחייב באמצעות GPCR ארכיטיפי, קולטן μ אופיואידים (MOR1), כדי לקבוע כמותית את הפעילות של אגוניסט אנטגוניסט על GPCR איתות.

פרוטוקול זה מתאר תחילה כיצד לבודד ממברנות גסות של תאים overexpressing MOR1. הערה thaלא פרוטוקול זה אינו מוגבל מערכות overexpression והוא יכול להיות מיושם על מקורות רבים של הממברנה, כולל רקמה מקומית או תכשירים המבטאים קולטנים מרובים חלבונים G 15 . לאחר מכן, הפרוטוקול מפרט כיצד למדוד את הכריכה של אנלוגי GTP רדיואקטיבי לממברנות אלה בתגובה לריכוזים שונים של [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] - אנקפאלין (DAMGO) או נלוקסון, אגוניסט ואנטגוניסט MOR1, בהתאמה. האנלוגי של ה- GTP, [ 35 S] ganosine-5'-O- (3-thio) triphosphate ([ 35 S] GTPγS), הוא לא hydrolyzable. תכונה זו היא קריטית כי G α יחידות משנה התערוכה פעילות GTPase מהותי 7 יבטלו את הפוספט גמא שכותרתו על רדיואקטיבי GTP hydrolyzable. ממברנות נלכדים מכן על גבי מסנני סיבי זכוכית ושטף, לאחר מכן את gTP radiolabeled הוא לכמת על ידי ספירת הנוזל scintillation. הפרמטרים הפרמקולוגיים מרובים ניתן לגזור characterizE אינטראקציה קולטן ליגנד, כולל תגובה חצי מקסימלית (EC 50 ) ואת מקדם היל (n) עבור אגוניסטים ואת ריכוז מעכב מקסימלי חצי (IC 50 ) ו שיווי המשקל דיסוציאציה קבוע (K ב ) עבור אנטגוניסטים 16 , 17 , 18 .

Protocol

1. ביטוי של רקומביננטי HA-MOR1 בתאים תרבותיים

הערה: בצע את כל פרוטוקולי תרבות התא בתא המנוע סטרילי זרימה למינרית.

  1. לעקר את תא התרבות למינרית זרימה למינרית עם אתנול 70% ולשמור על טכניקה סטרילית בכל תרבות התא.
  2. הכנת תאים כליים עובריים 293 (HEK293) תרבית תאים בינוני, שלם Dulbecco's שונה Eagle בינוני (DMEM): DMEM, pH 7.4, בתוספת 2 מ"מ L- גלוטמין, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, ו 10% בסרום שור עוברית (FBS ).
  3. צלחת 2.5 x 10 6 תאים HEK293 על גבי 10 ס"מ צלחת רקמה תרבות 10 מ"ל של DMEM מלאה ו דגירה ב 37 ° C ו 5% CO 2 עד 70-80% confluency הוא הגיע (O / N).
    הערה: כדי לאסוף מספיק חלבון לניסוי מלא GTP מחייב, צלחת לפחות 3 x 10 ס"מ צלחות של תאים.
  4. Transfect התאים עם HA-MOR1 באמצעות מגיב transfection של בחירה על ידי ביצוע "; לדגור על 36-48 ח.
    הערה: האדם MOR-1 cDNA (NCBI הפניה רצף: NM_000914.4) היה מתנה נדיבה של Gavril Pasternak ו היה משובטים לתוך pCMV-HA.

2. פיצול תאים אוסף ממברנה

  1. הכן את המאגרים תמוגה הבאה:
    1. מאגר 1: 10 מ"מ -4 (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES), pH 7.4; 1 mM אתילן glycol-bis (β-aminoethyl אתר) -N, N, N ', N- tetraacetic חומצה (EGTA); סוכרוז 10%; קוקטייל מעכב פרוטאז; ו 1 mith dithiothreitol (DTT). מוסיפים את DTT טרי ביום הבידוד ממברנה.
    2. מאגר 2: 10 מ"מ HEPES, pH 7.4; 1 מ"מ EGTA; 1 מ"מ MgCl 2 ; ו 1 מ"מ DTT. מוסיפים את DTT טרי ביום הבידוד ממברנה.
  2. הסר את התאים transfected מן החממה (שלב 1.4), לשאוב את המדיום, ולשטוף את התאים עם 5 מ"ל של קר כקרח פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). לשאוב את PBS ונוזל עודף מהצלחת.
  3. הוסף 600 μL של הצפת 1 לתאים. באמצעות מגרד תא, לעקור את התאים מן משטח צלחת פיפטה ההשעיה התא לתוך צינור microcentrifuge 1.6 מ"ל.
  4. מיד הצמד להקפיא את הצינור microcentrifuge בחנקן נוזלי. לאחר דגימות קפואים, להפשיר את lysates על קרח או למקם אותם ב -80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.
  5. חזור על שלבים 2.3 ו -2.4 עם כל צלחות של תאים.
  6. לאחר lysates יש מופשר, להשתמש יחיד הדופק microogenizer צינור מיקרו כדי לשבור את התאים. הדופק homogenizer 3-5 פעמים במשך 10 שניות, הצבת צינור בחזרה על קרח במשך 30 שניות בין הפולסים.
    1. איסוף 20 μL כמו שבר התא כולו.
  7. צנטריפוגה המדגם הנותר במשך 10 דקות ב 1000 xg ו 4 ° C. לאסוף את supernatant במקום צינור חדש microcentrifuge 1.6 מ"ל על הקרח.
  8. Resuspend גלולה μL 100 של מאגר 1 ו rehomogenize עם העלי. דופק את ההומוגניזר 3-5 פעמים במשך 5 שניות, הצבת הצינור בחזרה על הקרח במשך 30 שניות בין הפולסים.
    1. צנטריפוגה המדגם בפעם השנייה במשך 10 דקות ב 1000 xg ו 4 ° C. שלב את supernatant עם supernatant משלב 2.7.
      הערה: יתרת גלולה מכיל חלבונים גרעיניים וממברנה.
  9. צנטריפוגה supernatants בשילוב במשך 20 דקות ב XG 11,000 ו 4 ° C. להפריד את supernatant (החלק cytosolic) לתוך צינור חדש microcentrifuge 1.6 מ"ל.
  10. Resuspend גלולה μL 200 של המאגר 2. homogenize את גלולה על ידי triturating אותו 3-5 פעמים. צנטריפוגה המדגם במשך 20 דקות ב 21,100 xg ו 4 ° C. לשאוב את supernatant. Resuspend גלולה המכילה את שבר הממברנה הגולמי μL 50 של מאגר 2.
  11. מיד להמשיך את הניסויים GTPγS מחייב (סעיף 3) או הצמד להקפיא חנקן נוזלי בחנות ב -80 מעלות צלזיוס.

3. [ 35 S] GTPγS מחייב

הערה: השתמש בפרוטוקול בטיחות רדיואקטיבי סטנדרטי בעת טיפול ב- [ 35 S] GTPγS וכאשר מניבים ניסויים מחייבים של [ 35 S] GTPγS. ללבוש כפפות מגן מעיל מעבדה בכל עת. בדוק את חומר האריזה עבור דליפות או סדקים. להשליך פסולת ריאגנטים עודפים על פי פרוטוקולים מוסדיים.

  1. הכן לא מחייב מחייב מאגר (IBB) על ידי ערבוב 50 מ"מ HEPES, pH 7.4; 5 מ"מ MgCl2; 100 מ"מ NaCl; ו 1 mM ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) במים מזוקקים.
  2. דילול המניות [ 35 S] GTPγS ל 50 ננומטר ב 10 מ"מ Tris-HCl, pH 7.6, ו 10 מ"מ DTT. הפוך 500 aliquots μL ולאחסן אותם -80 מעלות צלזיוס. השתמש רק aliquot טרי מופנם מיד לפני תחילת הניסוי. להפשיר את aliquots על הקרח.
  3. הכן nonpradio שכותרתו GTPγS על ידי המסת 1 מ"ג של אבקת GTPγS ב 177.62 μL של מים טהורים לריכוז מלאי של 10 מ"מ. הפוך 10-aliquots μL ולאחסן אותם-20 ° C.
  4. הכן חיץ מחייב שלם (CBB) על ידי השלמת IBB לכלול ריכוז סופי של 1 מ"מ DTT, 0.1% (wt / vol) אלבומין בסרום שור (BSA), 10 מיקרומטר התמ"ג, ו 0.1 nM [ 35 S] GTPγS.
    הערה: ה- CBB מכיל כעת את ה- GTP של radiolabeled. נקוט אמצעי זהירות מתאימים תוך כדי עבודה עם פתרונות רדיואקטיביים.
  5. להפשיר את שבר הממברנה משלב 2.11 על הקרח.
  6. לכמת את ריכוז החלבון של חלק הממברנה באמצעות assay חלבון Bradford באמצעות ספקטרופוטומטר ב 595 ננומטר.
    1. הכן סדרה דילול של סטנדרטים BSA חלבון עם מאגר 2, בריכוז הסופי של 0, 250, 500, 750, 1,500, 2,500, ו - 5000 מיקרוגרם / מ"ל.
    2. הוסף 2 μL של כל תקן או קרום ל 1 מ"ל של מגיב Bradford ב קובט. מערבבים היטב על ידי vortexing.
    3. התאם את ספקטרופוטומטר לאורך גל של 595 ננומטר ריק באמצעות קובט עם 0 מיקרוגרם / מ"ל ​​חלבון.
    4. המתן 5 דקות ו- rEad כל אחד הסטנדרטים ואת כל הדגימות באורך גל 595 ננומטר.
    5. מגרש את ספיגת הסטנדרטים לעומת הריכוז. באמצעות חוק באר למברט (ε = εcl, שם ε = מקדם הכחדה, l = אורך קובט, ו- c = ריכוז), לחשב את הריכוז של דגימות הממברנה.
  7. לדלל את שברים הממברנה לריכוז של 100 מיקרוגרם חלבון / מ"ל ​​ב IBB.
    הערה: צלחת אחת 10 ס"מ של HEK293 תאים בדרך כלל התשואות בין 1 & 3 מ"ג חלבון / מ"ל.
  8. הכן את התנאים הניסוייים הבאים צינורות הפרט microcentrifuge 1.6 מ"ל: סדרת דילול ליגנד, מצב הפעילות הבסיסית כדי למדוד מחייב GTP הבסיסית, ואת תנאי מחייב לא ספציפית למדוד מחייבים GTP לא ספציפי.
    1. עבור סדרת דילול ליגנד, להכין סדרה דילול של ליגנד עניין בנפח סופי של 100 μL של CBB. הכן את סדרת ליגנד ב 2x הרצוי הסופי concentratiOns. שטח ריכוז ליגנד כדי לכסות כראוי מגוון של תגובות.
      1. כדי לבדוק את ההשפעה של DAMGO על GTP באמצעות MOR1, להכין דילולים DAMGO של 2 מ"מ, 200 מיקרומטר, 20 מיקרומטר, 200 מיקרומטר, 200 ננומטר, 20 ננומטר, 2 ננומטר, 200 pM, 20 pM, ו 2 pM ב CBB נפח: 100 μL).
        הערה: לדוגמה, אם ליגנד עניין יש ערך EC 50 צפוי של 10 מיקרומטר, להכין דילולים ליגנד של 200 ננומטר, 2 מיקרומטר, 20 מיקרומטר, 200 מיקרומטר, ו 2 מ"מ. אלה חמישה תנאים לכסות מגוון רחב של ריכוזים והם 2x את הריכוז הרצוי assay.
    2. עבור מחייב הבסיס, להכין צינור עם 100 μL של CBB בלבד.
    3. עבור מחייב ספציפי, להכין צינור עם 99 μL של CBB בתוספת 1 μL של 2 mM nonradio שכותרתו GTPγS.
  9. הוסף 100 μL של פתרון ממברנה בדילול (שלב 3.7) על כל תנאי הניסוי.
  10. דגירה את הקרומים עם הניסוי השוניםתנאים ental ב 1.6 צינורות microcentrifuge מ"ל במשך 30 דקות על 25 מעלות צלזיוס thermomixer או על שייקר מסלולית.

4. סינון ממברנה

  1. הכן חיץ לשטוף על ידי שילוב של 50 מ"מ טריס HCl, pH 7.4; 5 מ"מ MgCl 2 ; ו 50 מ"מ NaCl במים מזוקקים.
  2. Presoak סיבי זכוכית מסננים במים במשך 10 דקות.
    הערה: מסננים יש גודל הנקבוביות של 1 מיקרומטר, קוטר של 2.1 ס"מ, ועובי של 675 מיקרומטר.
  3. הסר את דגימות מן thermomixer או שייקר מסלולית (שלב 3.10). בקצרה הדופק ספין דגימות עבור 5 ים לאסוף כל מדגם בתחתית הצינור.
  4. הסר את המכסה של מנגנון סינון ואקום. הנח את מסננים presoaked על יציאות ואקום של המנגנון. Re- לאבטח את המכסה המנגנון כדי ליצור חותמת ואקום. הפעל את הוואקום.
  5. פיפטה 195 μL של כל 200 מצב ניסיוני μL על גבי מסננים כדי למזער את השגיאה מן ספיחה על הקירות של הצינור ו / או מ pipetטינג.
  6. שטפו את המסננים שלוש פעמים עם 1 מ"ל של חיץ כביסה קר כקרח.

5. ספירת נוזלים נוזלית

  1. מקום 5 מ"ל scintillation ספירת בקבוקונים במעמד ספירה. הוסף 5 מ"ל של נוזל נצנץ לכל בקבוקון.
  2. כבה את הוואקום (שלב 4.4). הסר את המכסה של מנגנון סינון ואקום. באמצעות פינצטה, להרים את המסננים מן יציאות ואקום של מנגנון סינון ולשחרר כל מסנן לתוך בקבוק 5 מ"ל scintillation הפרט.
  3. הכנת בקבוקון אחד עם μL 195 של CBB כדי לקבוע את האות המקסימלי.
  4. מכסה כל בקבוקון מאובטח. דגירה את בקבוקונים על שייקר מסלולית ב 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  5. הפעל את הדלפק נצנץ. תכננו את מונה הדגימה למדידה של פליטת איזוטופ S 35 למשך 5 דקות לכל מדגם באמצעות תוכנית scintillation המקובלת.
  6. לחץ על "התחל" כדי לספור.
  7. כאשר הספירה נעשה, להשליך את הבקבוק נספרפסולת מסוכנת.

6. ניתוח נתונים

  1. הזן את הנתונים לתוך נתונים סטטיסטיים וניתוח תוכנה.
    1. הפחת את הלא ספציפית מחייב מכל אחת המדידות האחרות כדי לקבוע את מחייב ספציפי.
      הערה: מידת החיבור לא ספציפי נקבעת על ידי המדגם מודגרות עם gTPγS non-radiolabeled (שלב 3.8.3).
    2. פתח את הנתונים הסטטיסטיים וניתוח התוכנה ובחר ערך נתונים של XY.
    3. הזן את הנתונים המחייבים הספציפיים מתוך הניסויים המחוברים ל- [ 35 S] GTPγS לטבלת נתונים בתוכנת הסטטיסטיקה והניתוח. הזן את ריכוז אגוניסט, כמו ריכוזי טוחנת, בעמודה "X". הזן את הספירות 35 S המשויכות כערכים "Y".
  2. לשנות את הנתונים.
    1. המר את ערכי ה- X ללוגריתם המתאים על ידי לחיצה על "ניתוח". בחר "המרה" מן המובנה iN מנתח.
    2. בתוך תיבת הדו שיח "המרה", בחר "המרה X ערכים באמצעות" ובחר את הפונקציה "X = log (X)". בחר ליצור תרשים חדש של התוצאות.
    3. לחץ על "אישור".
  3. מנרמל את ערכי Y.
    1. עם התוצאות המוצגות המוצגות, לחץ על "ניתוח". בחר "מנרמל" מ המובנית מנתח.
    2. בתיבת הדו-שיח "נרמל", בחר בלחצן הבחירה כדי להגדיר 0% כ"ערך הקטן ביותר בכל קבוצת נתונים "ו- 100% כ"ערך הגדול ביותר בכל קבוצת נתונים". בחר את התיבה כדי להציג את התוצאות כאחוזים. בחר את התיבה כדי ליצור תרשים חדש של התוצאות.
    3. לחץ על "אישור".
  4. להתאים עקומות רגרסיה לא ליניארית לנתונים זממו. בצע ניתוח רגרסיה לא לינארית.
    1. עם התוצאות מנורמל מוצג, לחץ על "ניתוח". מן המובנה מנתח, בחר "רגרסיה לא לינארית (התאמה עקומת)."
    2. אם חוקר אגוניסט, בחר "התחבר (אגוניסט) לעומת תגובה מנורמל - משתנה משתנה" מתיבת הדו שיח.
    3. אם חוקרים אנטגוניסט, "בחר יומן (אנטגוניסט) לעומת תגובה מנורמל - משתנה משתנה" מתיבת הדו שיח.
    4. לחץ על "אישור".
  5. עיין בתרשים ובתוצאות כדי לוודא שההתאמה והנתונים נמצאים בהסכמה סבירה. ודא כי רגרסיה תואמת את התבנית הכללית של נתונים זממו וכי שאריות הם לא כל כך גדול שהם להבהיר את עקומת המינון התגובה שטוח.
    הערה: התוכנה תסכם את תוצאות הרגרסיה הלא לינארית ותפרט את הריכוז שמקבל את התגובה החצי-מקסימלית (EC 50 ), מקדם היל (n) ואת הריכוז המעכב למחצית המקסימלית (IC 50 ).
  6. נגזרות אגוניסט / אנטגוניסט פרמטר עוצמה.
    1. נגזר את אגוניסט שווהElibrium דיסוציאציה קבועים (K ב ) מכל אחד מהניסויים הבאים 16 , 17 , 18
      1. להעריך את השינוי במינון התגובה של אגוניסט בתחרות עם ריכוז קבוע של היריב. כאן, EC 50 '= EC 50 (1 + [antagonist] / אנטגוניסט Kb ), כאשר EC 50 ' הוא EC-shift ימינה 50 .
      2. הערכת [ 35 S] GTPγS מחייב עם ריכוזים שונים של היריב בתחרות עם ריכוז קבוע של אגוניסט. הנה, K b = IC 50 / (2 + [אגוניסט] / אגוניסט EC 50 ) n 1 / n - 1, כאשר n הוא מקדם היל של אגוניסט.
  7. בהתאם לשונות של הנתונים, לחזור על הניסוי (שלבים 3.8-5.6) עבור כל ליגנד כ 3-5 פעמים וממוצע את התוצאות באמצעות סטטיסטיקה וניתוח softwהם.

תוצאות

פיצול תאים ניתן להשתמש כדי לבודד ולהעשיר הקשורים חלבונים הקשורים חלבונים cytosolic ו גרעיני. איור 1 הוא כתם המערבי המדגים את התוכן של שלושת השברים העיקריים שניתן לאסוף במהלך תהליך החלוקה התת-תאית. באופן ספציפי, איור 1 מרא?...

Discussion

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שתי שיטות נפרדות אך משלימות: גישה פשוטה לתאים ורקמות מפוצלות לתאים רחבים אך ברורים ואמצעי לחקור את אותות GPCR על ידי מדידת [ 35 S] GTPγS מחייב.

חלוקה תאית יעילה יש מגוון רחב של יישומים, החל מיצוי והעשרה של חלב?...

Disclosures

המחברים אינם מכריזים על אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק DA-000266 ואת תוכנית מדען רפואי T32 מענק (קורות חיים, NWZ, ו- PCS). המחברים היו רוצים גם להודות somersault18: 24 (somersault1824.com) עבור הספרייה המדעית & איורים רפואיים.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamineThermo Fisher Scientific10313021Warm in 37°C water bath before use
L-glutamineThermo Fisher Scientific25030081Warm in 37°C water bath before use
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122Warm in 37°C water bath before use
Opti-MEM I Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific31985070Warm in 37°C water bath before use
Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific16000044Warm in 37°C water bath before use
Cell culture 10-cm plateSigma-AldrichCLS430167
Lipofectamine 3000 reagentThermo Fisher ScientificL3000-008
1.6 mL microcentrifuge tubesUSA Scientific1615-5500
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)Sigma-AldrichH3375
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Trizma base)Thermo Fisher ScientificBP152-1
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)Sigma-AldrichE3889
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma-AldrichE9884
SucroseSigma-AldrichS5016
cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor CocktailSigma-Aldrich2900
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma-AldrichDO632
Sodium chloride (NaCl)Thermo Fisher ScientificBP358-1
Magnesium chloride (MgCl2)Sigma-AldrichM1028-1
Pellet pestles motorSigma-AldrichZ359971
PestlesBel ArtF19923-0001
Bovine serum albumin (BSA)Affymetrix10857
[35S]guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTPγS) Perkin ElmerNEG030H
non-radiolabeled guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate (GTPγS) Sigma-Aldrich89378
guanosine diphosphate (GDP)Sigma-Aldrich51060
Bradford reagentBio-Rad5000006
UV/VIS spectrophotometerBeckman CoulterDU640
spectrophotometer cuvettesUSA Scientific9090-0460
orbital shakerThermo Fisher Scientific2314
thermomixerEppendorf535027903
glass fiber filters GE Healthcare Life Sciences1821-021
vacuum filtration apparatusMillipore CorporationXX2702550
desktop microcentrifugeEppendorf65717
Scintillation counterBeckman CoulterLS6500
scintillation fluid Ecoscint ALS-273
scintillation counter vialsBeckman Coulter592690
scintillation vial lidsBeckman Coulter592928
Prism 6GraphPad SoftwarePRISM 6
ATP1A1 antibodyDevelopmental Studies Hybridomaa6F1:1000 in 3% BSA
GAPDH antibodyEMD MilliporeCB10011:5000 in 3% BSA
H2B antibodyCell Signaling2934S1:2500 in 3% BSA
PDI antibodyCell Signaling3501S1:1000 in 3% BSA
HA antibodyRoche118674230011:2000 in 3% BSA

References

  1. Kobilka, B. K. G protein coupled receptor structure and activation. Biochim. Biophys. Acta. 1768 (4), 794-807 (2007).
  2. Neubig, R. R., Siderovski, D. P. Regulators of G-protein signalling as new central nervous system drug targets. Nat. Rev. Drug Discov 1. (3), 187-197 (2002).
  3. Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there?. Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).
  4. Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
  5. Kobilka, B. K., et al. Cloning, sequencing, and expression of the gene coding for the human platelet alpha 2-adrenergic receptor. Science. 238 (4827), 650-656 (1987).
  6. Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289 (5480), 739-745 (2000).
  7. Neer, E. J. Heterotrimeric c proteins: organizers of transmembrane signals. Cell. 80 (2), 249-257 (1995).
  8. Londos, C., Salomon, Y. 5'-Guanylylimidodiphosphate, a Potent Activator of Adenylate Cyclase Systems in Eukaryotic Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71 (8), 3087-3090 (1974).
  9. Ross, E. M., Gilman, A. G. Resolution of Some Components of Adenylate-Cyclase Necessary for Catalytic Activity. J. Biol. Chem. 252 (20), 6966-6969 (1977).
  10. Stadel, J. M., Nambi, P., Shorr, R., Sawyer, D. F., Caron, M. G., Lefkowitz, R. J. Catecholamine-Induced Desensitization of Turkey Erythrocyte Adenylate-Cyclase Is Associated with Phosphorylation of the Beta-Adrenergic-Receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80 (11), 3173-3177 (1983).
  11. Wilden, U., Kuhn, H. Light-Dependent Phosphorylation of Rhodopsin - Number of Phosphorylation Sites. Biochemistry. 21 (12), 3014-3022 (1982).
  12. Lohse, M., Benovic, J., Codina, J., Caron, M., Lefkowitz, R. beta-Arrestin: a protein that regulates beta-adrenergic receptor function. Science. 248 (4962), 1547-1550 (1990).
  13. Leftowitz, R. J., Shenoy, S. K. Transduction of receptor signals by beta-arrestins. Science. 308 (5721), 512-517 (2005).
  14. Lefkowitz, R. J. Historical review: a brief history and personal retrospective of seven-transmembrane receptors. Trends Pharmacol. Sci. 25 (8), 413-422 (2004).
  15. Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological assessment of m1 muscarinic acetylcholine receptor-gq/11 protein coupling in membranes prepared from postmortem human brain tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).
  16. Yung-Chi, C., Prusoff, W. H. Relationship between the inhibition constant (K1) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (I50) of an enzymatic reaction. Biochem. Pharmacol. 22 (23), 3099-3108 (1973).
  17. Lazareno, S., Birdsall, N. Estimation of competitive antagonist affinity from functional inhibition curves using the Gaddum, Schild and Cheng-Prusoíf equations. Br. J. Pharmacol. 109 (4), 1110-1119 (1993).
  18. Maréchal, E. Chapter 5, Measuring Bioactivity: KI, IC50 and EC50. Chemogenomics and Chemical Genetics. , 55-65 (2011).
  19. Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological Assessment of M1 Muscarinic Acetylcholine Receptor-Gq/11 Protein Coupling in Membranes Prepared from Postmortem Human Brain Tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).
  20. Milligan, G. Principles: extending the utility of [35S]GTP gamma S binding assays. Trends. Pharmacol. Sci. 24 (2), 87-90 (2003).
  21. Harrison, C., Traynor, J. R. The [35S]GTPgammaS binding assay: approaches and applications in pharmacology. Life Sci. 74 (4), 489-508 (2003).
  22. Traynor, J. R., Nahorski, S. R. Modulation by mu-opioid agonists of guanosine-5'-O-(3-[35S]thio)triphosphate binding to membranes from human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Mol. Pharmacol. 47 (4), 848-854 (1995).
  23. Sittampalam, G. S., et al. GTPγS Binding Assays. Assay Guidance Manual. , (2004).
  24. Strange, P. G. Use of the GTPγS ([35S]GTPγS and Eu-GTPγS) binding assay for analysis of ligand potency and efficacy at G protein-coupled receptors. Br. J. Pharmacol. 161 (6), 1238-1249 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

124GPCRGTP S

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved