Messung der G-Protein-gekoppelten Rezeptorsignalisierung über radioaktiv markierte GTP-Bindung

Zusammenfassung

Guanosintriphosphat (GTP) -Bindung ist eine der frühesten Ereignisse in der G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) -Aktivierung. Dieses Protokoll beschreibt die pharmakologisch charakterisierende spezifische GPCR-Ligand-Wechselwirkungen durch die Überwachung der Bindung des radioaktiv markierten GTP-Analogs [ ³⁵ S] Guanosin-5'-O- (3-thio) triphosphats ([ ³⁵ S] GTPγS) in Antwort auf einen Liganden von Interesse.

Zusammenfassung

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind eine große Familie von Transmembran-Rezeptoren, die in der normalen zellulären Physiologie kritische Rollen spielen und ein großes pharmakologisches Ziel für multiple Indikationen darstellen, einschließlich Analgesie, Blutdruckregulation und Behandlung psychiatrischer Erkrankungen. Nach der Ligandenbindung katalysieren GPCRs die Aktivierung von intrazellulären G-Proteinen durch Stimulierung des Einbaues von Guanosintriphosphat (GTP). Aktivierte G-Proteine ​​stimulieren dann Signalwege, die zelluläre Reaktionen hervorrufen. Die GPCR-Signalisierung kann durch Messung des Einbringens einer radioaktiv markierten und nicht hydrolysierbaren Form von GTP, [ ³⁵ S] Guanosin-5'-O- (3-thio) triphosphat ([ ³⁵ S] GTPγS) in G-Proteine ​​überwacht werden. Im Gegensatz zu anderen Methoden, die mehr nachgeschaltete Signalisierungsprozesse beurteilen, misst [ ³⁵ S] GTPγS-Bindung ein proximales Ereignis in der GPCR-Signalisierung und kann vor allem Agonis unterscheidenTs, antagonisten und inverse agonisten. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine empfindliche und spezifische Methode zum Studieren der GPCR-Signalisierung unter Verwendung von Rohmembranpräparationen eines archetypischen GPCR, des μ-Opioidrezeptors (MOR1). Obwohl alternative Ansätze zur Fraktionierung von Zellen und Geweben existieren, sind viele kostenaufwendig, langwierig und / oder erfordern nicht standardisierte Laborgeräte. Die vorliegende Methode liefert ein einfaches Verfahren, das funktionelle Rohmembranen angereichert. Nach der Isolierung von MOR1 wurden verschiedene pharmakologische Eigenschaften seines Agonisten, [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkephalin (DAMGO) und Antagonist, Naloxon, bestimmt.

Einleitung

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind eine große Familie von Zelloberflächenrezeptoren, die für eine bemerkenswerte Reihe von physiologischen Prozessen verantwortlich sind, einschließlich Analgesie, Olfusion und Verhalten ¹ . GPCRs wirken, indem sie spezifische externe Signale erfassen und anschließend die intrazelluläre Signalisierung stimulieren. Sie markieren daher eine Schlüsselverbindung zwischen den äußeren und inneren Umgebungen einer Zelle. Aufgrund der kritischen Rolle, die GPCRs in der Biologie spielen, sind sie zu Hauptzielen für die Grundlagenforschung und die Wirkstoffforschung geworden ^{2 , 3} .

Im Gegensatz zu anderen Rezeptorfamilien, die diskrete Liganden binden, können GPCRs sehr unterschiedliche Molekülarten binden. Während ein GPCR mit Peptiden interagieren kann, kann ein anderer Photonen, kleine Moleküle oder Ionen ^{1 , 4} feststellen. Während ihre Liganden vielfältig sind, sind GPCRs in ihrem Gesamtarchitekten vereintUnd Funktion. Individuelle GPCRs bestehen aus sieben α-helicalen Transmembranproteinen mit extrazellulären Aminoterminals und intrazellulären Carboxylterminals ^{5 , 6} . GPCRs sind an intrazelluläre G-Proteine-heterotrimere Proteinkomplexe aus α-, β- und γ-Untereinheiten gekoppelt, die verschiedene Signalwege vermitteln ⁷ . Die G _{& agr} ; -Untereinheit ist ein Guanin-Nukleotid-bindendes Protein, das inaktiv ist, wenn es an Guanosindiphosphat (GDP) gebunden ist und aktiv ist, wenn es an Guanosintriphosphat (GTP) ^{8 , 9} gebunden ist. Wenn GPCRs ihre Liganden binden, unterliegen sie einer Konformationsänderung, die es ermöglicht, dass G _{& agr;} von G _{& bgr; &} ggr _{; abtrennt} , wodurch G _{& agr;} das GDP für GTP ⁷ _austauschen kann. Der Rezeptor selbst wird an seinem Carboxylterminal durch verschiedene Serin / Threon phosphoryliertIne-Kinasen ^{10 , 11} und verinnerlicht, um die Rezeptorsignalisierung ^{12 , 13 , 14} zu dämpfen. Mittlerweile verlaufen das aktivierte G _{& agr;} -Monomer und das G _{& bgr; &} ggr _{; -Dimer} , um unterschiedliche Signalwege ⁷ zu aktivieren. Es gibt mehrere Isoformen jeder G-Protein-Untereinheit, und jede Isoform zielt auf bestimmte nachgeschaltete Wege und sekundäre Messenger-Systeme ab. Die Haupt-G _{& agr;} -Isoformen umfassen G _s , G _q , G _{i / o} und G _12-13 . Typischerweise assoziieren einzelne GPCRs mit einer bestimmten G _{& agr;} -Isoform, wodurch ein externer Stimulus mit einer spezifischen zellulären Antwort ¹ verbunden wird.

Die Charakterisierung einer GPCR-Ligand-Interaktion ist entscheidend für das Verständnis der Biologie des Rezeptors. Da der BIP / GTP-Austausch einer der frühesten Vorabend istNts, die der Ligandenbindung folgen, die Überwachung der GTP-Bindung kann die GPCR-Aktivierung oder Hemmung messen. Das Testen von mehr nachgeschalteten Ereignissen in der GPCR-Signalisierung ist oft nicht so quantitativ oder stöchiometrisch, kann nicht vollständige Agonisten von partiellen unterscheiden und kann teure Reagenzien erfordern. Darüber hinaus ist eine erhöhte GTP-Bindung an G _{& agr;} -Proteine ​​ein fast universelles Ereignis nach der GPCR-Aktivierung, was bedeutet, dass die Messung der GTP-Bindung ein weitgehend anwendbarer Assay zur Überwachung der Aktivität der meisten GPCRs ist. Die Messung der GTP-Bindung ist ein einfacher und schneller Ansatz zur Überwachung der GPCR-Signalisierung in Zellen, die den Rezeptor von Interesse oder in nativem Gewebe überexprimieren. Das vorliegende Protokoll beschreibt einen funktionellen GTP-Bindungsassay unter Verwendung eines archetypischen GPCR, des μ-Opioidrezeptors (MOR1), um die Aktivität eines Agonisten und Antagonisten auf GPCR-Signalisierung quantitativ zu bestimmen.

Dieses Protokoll beschreibt zunächst, wie man Rohmembranen aus Zellen, die MOR1 überexprimieren, isoliert. Anmerkung thaDieses Protokoll ist nicht auf Überexpressionssysteme beschränkt und kann auf viele Membranquellen angewendet werden, einschließlich natives Gewebe oder Präparate, die mehrere Rezeptoren und G-Proteine ​​ausdrücken. Das Protokoll beschreibt dann, wie man die Bindung eines radioaktiven GTP-Analogons an diese Membranen in Abhängigkeit von variierenden Konzentrationen von [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -Enkephalin (DAMGO) oder Naloxon, einem MOR1-Agonisten und -Antagonisten, beziehungsweise. Das GTP-Analog-, [ ³⁵ S] Guanosin-5'-O- (3-thio) triphosphat ([ ³⁵ S] GTPγS) ist nicht hydrolysierbar. Diese Eigenschaft ist kritisch, da G _{& agr;} -Untereinheiten eine intrinsische GTPase-Aktivität ⁷ aufweisen und das markierte Gamma-Phosphat auf einer hydrolysierbaren GTP-Radiochemie eliminieren würden. Membranen werden dann auf Glasfaserfilter gefangen und gewaschen, wonach das radioaktiv markierte GTP durch Flüssigszintillationszählung quantifiziert wird. Mehrere pharmakologische Parameter können zu charakterisiert werdenE die Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung, einschließlich der halbmaximalen Antwort (EC ₅₀ ) und des Hill-Koeffizienten (n _H ) für Agonisten und der halbmaximalen Hemmkonzentration (IC ₅₀ ) und der Gleichgewichtsdissoziationskonstante (K _b ) für die Antagonisten ^{16 , 17 , 18}

Protokoll

1. Expression von rekombinantem HA-MOR1 in kultivierten Zellen

HINWEIS: Befolgen Sie alle Zellkulturprotokolle in einer sterilen laminaren Strömungshaube.

1. Sterilisieren Sie die Zellkultur-Laminar-Flow-Kapuze mit 70% Ethanol und halten Sie sterile Technik in der gesamten Zellkultur.
2. Bereiten menschliche embryonale Nierenzellen vor 293 (HEK293) Zellkulturmedium, vollständiges Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium (DMEM): DMEM, pH 7,4, ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 1% Penicillin / Streptomycin und 10% fötalem Rinderserum (FBS ).
3. Platte 2,5 x 10 ⁶ HEK293 Zellen auf eine 10 cm Gewebekulturplatte in 10 ml vollständigem DMEM auftragen und bei 37 ° C und 5% CO ₂ inkubieren, bis 70-80% Konfluenz erreicht sind (O / N).
   ANMERKUNG: Um genug Protein für ein komplettes GTP-Bindungsexperiment zu sammeln, muss mindestens 3 x 10 cm Platten von Zellen platzen.
4. Transformieren Sie die Zellen mit HA-MOR1 mit einem Transfektionsreagenz der Wahl und indem Sie dem Hersteller "Richtlinien. Inkubieren für 36-48 h.
   HINWEIS: Die menschliche MOR-1-cDNA (NCBI-Referenzsequenz: NM_000914.4) war ein großzügiges Geschenk von Gavril Pasternak und wurde in pCMV-HA kloniert.

2. Zellfraktionierung und Membransammlung

1. Vorbereitung der folgenden Lysepuffer:
   1. Puffer 1: 10 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES), pH 7,4; 1 mM Ethylenglykol-bis (β-aminoethylether) -N, N, N ', N'-tetraessigsäure (EGTA); 10% Saccharose; Protease-Inhibitor-Cocktail; Und 1 mM Dithiothreitol (DTT). Füge das DTT frisch am Tag der Membranisolation hinzu.
   2. Puffer 2: 10 mM HEPES, pH 7,4; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl & _sub2 ;; Und 1 mM DTT. Füge das DTT frisch am Tag der Membranisolation hinzu.
2. Entfernen Sie die transfizierten Zellen aus dem Inkubator (Schritt 1.4), saugt das Medium an und spülen Sie die Zellen mit 5 ml eiskalter Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) ab. Aspirieren Sie die PBS und überschüssige Flüssigkeit ausder Teller.
3. Füge 600 μl Puffer 1 zu den Zellen hinzu. Mit einem Zellschaber werden die Zellen von der Plattenoberfläche entfernt und die Zellsuspension in ein 1,6 mL Mikrozentrifugenröhrchen pipettiert.
4. Sofort das Mikrozentrifugenröhrchen in flüssigem Stickstoff einfrieren. Sobald die Proben eingefroren sind, tauen Sie die Lysate auf Eis auf oder legen Sie sie bei -80 ° C für die Langzeitlagerung auf.
5. Wiederholen Sie die Schritte 2.3 und 2.4 mit allen Platten der Zellen.
6. Sobald die Lysate aufgetaut haben, verwenden Sie einen Single-Puls-Mikroröhren-Homogenisator, um die Zellen aufzubrechen. Den Homogenisator 3-5 mal für 10 s anziehen und das Röhrchen für 30 s zwischen den Impulsen auf Eis legen.
   1. Sammle 20 μl als ganze Zellfraktion.
7. Die restliche Probe für 10 min bei 1000 xg und 4 ° C zentrifugieren. Den Überstand sammeln und in ein neues 1,6 mL Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis geben.
8. Das Pellet in 100 μl Puffer 1 resuspendieren und mit einer Pistille rehomogenisieren. Puls den HomoGenizer 3-5 mal für 5 s, Platzierung der Röhre wieder auf Eis für 30 s zwischen Impulsen.
   1. Zentrifugieren Sie die Probe ein zweites Mal für 10 min bei 1000 xg und 4 ° C. Kombinieren Sie den Überstand mit dem Überstand aus Schritt 2.7.
      HINWEIS: Das verbleibende Pellet enthält Kern- und Membranproteine.
9. Zentrifugieren der vereinigten Überstände für 20 min bei 11.000 xg und 4 ° C. Trennen Sie den Überstand (die zytosolische Fraktion) in ein neues 1,6 mL Mikrozentrifugenröhrchen.
10. Das Pellet wird in 200 & mgr; l Puffer 2 resuspendiert. Das Pellet wird durch Triturieren 3-5 mal homogenisiert. Die Probe 20 Minuten lang bei 21.100 xg und 4 ° C zentrifugieren. Sauge den Überstand. Das Pellet, das die Rohmembranfraktion enthält, in 50 & mgr; l Puffer 2 resuspendieren.
11. Verlassen Sie sofort die GTPγS-Bindungsexperimente (Abschnitt 3) oder Snap-Freeze in flüssigem Stickstoff und lagern bei -80 ° C.

3. [ ³⁵ S] GTPγS Bindung

HINWEIS: Bei der Handhabung von [ ³⁵ S] GTPγS und bei der Durchführung von [ ³⁵ S] GTPγS-Bindungsexperimenten ein standardmäßiges radiochemisches Sicherheitsprotokoll verwenden. Tragen Sie Schutzhandschuhe und einen Laborkittel zu jeder Zeit. Überprüfen Sie das Verpackungsmaterial auf Lecks oder Risse. Entsorgung von Abfällen und überschüssigen Reagenzien nach institutionellen Protokollen.

1. Vorbereiten des unvollständigen Bindungspuffers (IBB) durch Mischen von 50 mM HEPES, pH 7,4; 5 mM MgCl & sub2 ;; 100 mM NaCl; Und 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in destilliertem Wasser.
2. Verdünnungsmittel [ ³⁵ S] GTPγS bis 50 nM in 10 mM Tris-HCl, pH 7,6 und 10 mM DTT. Mischen Sie 500 μl Aliquots und lagern Sie sie bei -80 ° C. Verwenden Sie vor dem Einleiten des Experiments nur ein frisch aufgetautes Aliquot. Tausche die Aliquots auf Eis.
3. Vorbereiten von nicht radioaktiv markiertem GTP & ggr; S durch Auflösen von 1 mg GTP & ggr; S-Pulver in 177,62 & mgr; l reinem Wasser für eine Stammkonzentration von 10 mM. Machen Sie 10-μl Aliquots und speichern Sie sie bei-20 ° C
4. Vorbereiten des vollständigen Bindungspuffers (CBB) durch Ergänzung des IBB um eine Endkonzentration von 1 mM DTT, 0,1% (wt / vol) Rinderserumalbumin (BSA), 10 μM GDP und 0,1 nM [ ³⁵ S] GTPγS.
   HINWEIS: Die CBB enthält jetzt radioaktiv markiertes GTP. Bei der Arbeit mit radioaktiven Lösungen geeignete Sicherheitsvorkehrungen treffen.
5. Die Membranfraktion aus Schritt 2.11 auf Eis auftauen.
6. Quantifizierung der Proteinkonzentration der Membranfraktion über einen Bradford-Protein-Assay unter Verwendung eines Spektrophotometers bei 595 nm.
   1. Bereiten Sie eine Verdünnungsreihe von BSA-Proteinstandards mit Puffer 2 bei Endkonzentrationen von 0, 250, 500, 750, 1.500, 2.500 und 5.000 μg / ml vor.
   2. 2 & mgr; l von jedem Standard oder Membran zu 1 ml Bradford-Reagenz in einer Küvette geben. Mischen Sie gründlich durch Vortexen.
   3. Stellen Sie das Spektrophotometer auf eine Wellenlänge von 595 nm und leeren Sie es mit der Küvette mit 0 μg / ml Protein.
   4. Warte 5 min und rEad jeder der Standards und jede der Proben bei einer Wellenlänge von 595 nm.
   5. Zeichnen Sie die Absorption der Standards gegenüber der Konzentration. Mit dem Beer-Lambert-Gesetz (A = εcl, wobei ε = Extinktionskoeffizient, l = Länge der Küvette und c = Konzentration) die Konzentration der Membranproben berechnen.
7. Die Membranfraktionen auf eine Konzentration von 100 μg Protein / ml in IBB verdünnen.
   HINWEIS: Eine 10-cm-Schale mit HEK293-Zellen ergibt typischerweise zwischen 1 & 3 mg Protein / ml.
8. Bereiten Sie die folgenden experimentellen Bedingungen in einzelnen 1,6-mL-Mikrozentrifugenröhrchen vor: eine Ligand-Verdünnungsreihe, eine basale Aktivitätsbedingung zur Messung der basalen GTP-Bindung und eine unspezifische Bindungsbedingung zur Messung der unspezifischen GTP-Bindung.
   1. Für die Liganden-Verdünnungsreihe wird eine Verdünnungsreihe des interessierenden Liganden in einem Endvolumen von 100 & mgr; l CBB hergestellt. Bereiten Sie die Ligandenreihe bei 2x die gewünschte Endkonzentration vorOns Platzieren Sie die Ligandenkonzentrationen, um eine Reihe von Antworten adäquat abzudecken.
      1. Um die Wirkung von DAMGO auf die GTP-Bindung über MOR1 zu untersuchen, werden DAMGO-Verdünnungen von 2 mM, 200 μM, 20 μM, 2 μM, 200 nM, 20 nM, 2 nM, 200 pM, 20 pM und 2 pM in CBB (endgültig) Volumen: 100 & mgr; l).
         HINWEIS: Wenn zum Beispiel der interessierende Ligand einen erwarteten EC ₅₀ -Wert von 10 μM aufweist, so erhält man Ligandenverdünnungen von 200 nM, 2 μM, 20 μM, 200 μM und 2 mM. Diese fünf Bedingungen decken einen breiten Bereich von Konzentrationen ab und sind 2x die für den Assay gewünschte Konzentration.
   2. Für die basale Bindung wird ein Röhrchen nur mit 100 μl CBB hergestellt.
   3. Zur unspezifischen Bindung wird ein Röhrchen mit 99 μl CBB, ergänzt mit 1 μl 2 mM nicht radioaktiv markiertem GTPγS, hergestellt.
9. Füge 100 μl der verdünnten Membranlösung (Schritt 3.7) zu jeder experimentellen Bedingung hinzu.
10. Inkubieren Sie die Membranen mit den verschiedenen ExperimentenBedingungen in 1,6 mL Mikrozentrifugenröhrchen für 30 min bei 25 ° C in einem Thermomixer oder auf einem Orbitalschüttler.

4. Membranfiltration

1. Vorbereiten von Waschpuffer durch Kombinieren von 50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 5 mM MgCl & _sub2 ;; Und 50 mM NaCl in destilliertem Wasser.
2. Die Glasfaserfilter in Wasser für 10 min abschleifen.
   HINWEIS: Die Filter haben eine Porengröße von 1 μm, einen Durchmesser von 2,1 cm und eine Dicke von 675 μm.
3. Entfernen Sie die Proben aus dem Thermomixer oder dem Orbitalschüttler (Schritt 3.10). Die Proben für 5 s kurz spülen, um jede Probe am Boden des Röhrchens zu sammeln.
4. Entfernen Sie den Deckel des Vakuumfiltrationsgeräts. Legen Sie die vorgespannten Filter auf die Vakuumanschlüsse des Gerätes. Sichern Sie den Apparat Deckel, um eine Vakuumdichtung zu bilden. Schalte das Vakuum ein.
5. Pipette von 195 μl jeder 200 μl experimentellen Bedingung auf Filter, um den Fehler der Adsorption an den Wänden des Röhrchens und / oder der Pipette zu minimierenTing
6. Waschen Sie die Filter dreimal mit 1 ml eiskaltem Waschpuffer.

5. Flüssigkeitszintillationszählung

1. Legen Sie 5 ml Szintillationszählröhrchen in ein Zählgestell ein. Füge 5 ml Szintillationsflüssigkeit zu jeder Durchstechflasche hinzu.
2. Schalte das Vakuum aus (Schritt 4.4). Entfernen Sie den Deckel des Vakuumfiltrationsgeräts. Mit Pinzetten die Filter aus den Vakuumanschlüssen des Filtrationsapparates aufnehmen und jeden Filter in eine einzelne 5 ml Szintillationsfläschchen geben.
3. Bereiten Sie eine Durchstechflasche mit 195 μl CBB vor, um das maximale Signal zu bestimmen.
4. Kappe jede Durchstechflasche sicher. Inkubieren Sie die Fläschchen auf einem Orbitalschüttler bei 25 ° C für 10 min.
5. Schalte den Szintillationszähler ein. Programmieren Sie den Szintillationszähler, um die ⁵ S-Isotopenemission für 5 min pro Probe mit dem standardbezogenen Szintillationsprogramm zu messen.
6. Drücken Sie "Start", um eine Zählung zu nehmen.
7. Wenn die Zählung erfolgt ist, entsorgen Sie die gezählte DurchstechflascheS als gefährlicher Abfall.

6. Datenanalyse

1. Geben Sie die Daten in die Statistik- und Analysesoftware ein.
   1. Subtrahieren Sie die unspezifische Bindung von jeder der anderen Messungen, um die spezifische Bindung zu bestimmen.
      HINWEIS: Der Grad der unspezifischen Bindung wird durch die mit nicht-radioaktiv markiertem GTPγS inkubierte Probe bestimmt (Schritt 3.8.3).
   2. Öffnen Sie die Statistik- und Analysesoftware und wählen Sie einen XY-Datensatzeintrag aus.
   3. Geben Sie die spezifischen Bindungsdaten aus den [ ³⁵ S] GTPγS-Bindungsexperimenten in eine Datentabelle in der Statistik- und Analysesoftware ein. Geben Sie die Agonistenkonzentrationen als molare Konzentrationen in die "X" -Säule ein. Geben Sie die zugehörigen ³⁵ S-Werte als "Y" -Werte ein.
2. Verwandeln Sie die Daten.
   1. Konvertieren Sie die X-Werte in ihren jeweiligen Logarithmus, indem Sie auf "Analysieren" klicken. Wählen Sie "Transformieren" aus dem eingebauten iN analysiert.
   2. Wählen Sie im Dialogfeld "Transformieren" die Option "X-Werte umwandeln" und wählen Sie die Funktion "X = log (X)". Wählen Sie, um einen neuen Graphen der Ergebnisse zu erstellen.
   3. OK klicken."
3. Normalisieren Sie die Y-Werte.
   1. Wenn die umgewandelten Ergebnisse angezeigt werden, klicken Sie auf "Analysieren". Wählen Sie "Normalisieren" aus den eingebauten Analysen.
   2. Wählen Sie im Dialogfeld "Normalisieren" das Optionsfeld aus, um 0% als "kleinsten Wert in jedem Datensatz" und 100% als den "größten Wert in jedem Datensatz" zu definieren. Wählen Sie das Feld aus, um die Ergebnisse als Prozentsätze darzustellen. Markieren Sie das Feld, um ein neues Diagramm der Ergebnisse zu erstellen.
   3. OK klicken."
4. Setzen Sie eine nichtlineare Regressionskurven auf die gezeichneten Daten. Führen Sie eine nichtlineare Regressionsanalyse durch.
   1. Wenn die normalisierten Ergebnisse angezeigt werden, klicken Sie auf "Analysieren". Aus den eingebauten AnalysenWählen Sie "Nichtlineare Regression (Kurvenanpassung)".
   2. Bei der Untersuchung eines Agonisten wählen Sie aus dem Dialogfenster "log (agonist) vs. normalisierte Antwort - Variable Slope" aus.
   3. Bei der Untersuchung eines Antagonisten, "Select Log (Antagonist) vs. normalisierte Antwort - Variable Slope" aus dem Dialogfeld.
   4. OK klicken."
5. Überprüfen Sie die Grafik und die Ergebnisse, um sicherzustellen, dass die Passform und die Daten in angemessener Übereinstimmung sind. Stellen Sie sicher, dass die Regression mit dem allgemeinen Muster der aufgezeichneten Daten übereinstimmt und dass die Residuen nicht so groß sind, dass sie die Dosis-Wirkungs-Kurve flach machen.
   HINWEIS: Die Software fasst die Ergebnisse der nichtlinearen Regression zusammen und beschreibt die Konzentration, die die halbmaximale Antwort (EC ₅₀ ), den Hill-Koeffizienten (n _H ) und die halbmaximale Hemmkonzentration (IC ₅₀ ) hervorruft.
6. Ableitung der Agonisten / Antagonisten-Parameter-Potenz.
   1. Leitet den Agonisten gleichIlibrium-Dissoziationskonstanten (K _b ) aus einem der folgenden Experimente ^{16 , 17 , 18}
      1. Beurteilen Sie die Verschiebung in der Dosis-Antwort eines Agonisten im Wettbewerb mit einer festen Konzentration von Antagonisten. Hier ist EC ₅₀ '= EC ₅₀ (1 + [Antagonist] / Antagonist _Kb ), wobei EC ₅₀ ' die rechtsverschobene EC ₅₀ ist.
      2. Assess [ ³⁵ S] GTPγS-Bindung mit variierenden Konzentrationen des Antagonisten im Wettbewerb mit einer festen Konzentration von Agonisten. Hier ist K _b = IC ₅₀ / (2 + ([Agonist] / Agonist EC ₅₀ ) ⁿ ) ^{1 / n} - 1, wobei n der Hangkoeffizient des Agonisten ist.
7. Abhängig von der Variabilität der Daten, wiederholen Sie den Versuch (Schritte 3.8-5.6) für jeden Liganden etwa 3-5 mal und durchschnittlich die Ergebnisse mit einer Statistik und Analyse Softwsind.

Ergebnisse

Zellfraktionierung kann verwendet werden, um Membran-assoziierte Proteine ​​aus zytosolischen und nuklearen Proteinen zu isolieren und zu bereichern. Abbildung 1 ist ein Western-Blot, der den Inhalt der drei primären Fraktionen demonstriert, die während des subzellulären Fraktionierungsprozesses gesammelt werden können. Speziell zeigt Fig. 1 , daß die Fraktionierung Membranproteine ​​( dh Na + / K + ATPase,...

Diskussion

Das vorliegende Protokoll beschreibt zwei getrennte, aber komplementäre Methoden: einen einfachen Ansatz zur Fraktionierung von Zellen und Geweben in breite, aber unterschiedliche Kompartimente und ein Mittel zur Untersuchung der GPCR-Signalisierung durch Messung der [ ³⁵ S] GTPγS-Bindung.

Die effiziente zelluläre Fraktionierung hat eine breite Palette von Anwendungen, angefangen von der Extraktion und Anreicherung von Proteinen bis hin zur Bewertung der subzellulären Lokalisa...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine	Thermo Fisher Scientific	10313021	Warm in 37°C water bath before use
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081	Warm in 37°C water bath before use
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	Warm in 37°C water bath before use
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985070	Warm in 37°C water bath before use
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16000044	Warm in 37°C water bath before use
Cell culture 10-cm plate	Sigma-Aldrich	CLS430167
Lipofectamine 3000 reagent	Thermo Fisher Scientific	L3000-008
1.6 mL microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma-Aldrich	H3375
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Trizma base)	Thermo Fisher Scientific	BP152-1
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E3889
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E9884
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5016
cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	2900
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	DO632
Sodium chloride (NaCl)	Thermo Fisher Scientific	BP358-1
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M1028-1
Pellet pestles motor	Sigma-Aldrich	Z359971
Pestles	Bel Art	F19923-0001
Bovine serum albumin (BSA)	Affymetrix	10857
[35S]guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTPγS)	Perkin Elmer	NEG030H
non-radiolabeled guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate (GTPγS)	Sigma-Aldrich	89378
guanosine diphosphate (GDP)	Sigma-Aldrich	51060
Bradford reagent	Bio-Rad	5000006
UV/VIS spectrophotometer	Beckman Coulter	DU640
spectrophotometer cuvettes	USA Scientific	9090-0460
orbital shaker	Thermo Fisher Scientific	2314
thermomixer	Eppendorf	535027903
glass fiber filters	GE Healthcare Life Sciences	1821-021
vacuum filtration apparatus	Millipore Corporation	XX2702550
desktop microcentrifuge	Eppendorf	65717
Scintillation counter	Beckman Coulter	LS6500
scintillation fluid	Ecoscint A	LS-273
scintillation counter vials	Beckman Coulter	592690
scintillation vial lids	Beckman Coulter	592928
Prism 6	GraphPad Software	PRISM 6
ATP1A1 antibody	Developmental Studies Hybridoma	a6F	1:1000 in 3% BSA
GAPDH antibody	EMD Millipore	CB1001	1:5000 in 3% BSA
H2B antibody	Cell Signaling	2934S	1:2500 in 3% BSA
PDI antibody	Cell Signaling	3501S	1:1000 in 3% BSA
HA antibody	Roche	11867423001	1:2000 in 3% BSA