طرق استخراج إندوسيمبيونتس من الذبابة البيضاء<em&gt; بيميسيا تاباسي</em

Summary

هنا، نقدم بروتوكول لعزل إندوسيمبيونتس من الذبابة البيضاء بيميسيا تاباسي من خلال تشريح والترشيح. بعد التضخيم، عينات الحمض النووي هي مناسبة لتسلسل لاحق ودراسة التبادلية بين إندوسيمبيونتس والذبابة البيضاء.

Abstract

تشكل الارتباطات البكتيرية علاقة حميمة مع مضيفيها وتقدم مزايا للمضيفين في معظم الحالات. المعلومات الجينومية أمر بالغ الأهمية لدراسة وظائف وتطور سيمبيونتس البكتيريا في مضيفهم. كما لا يمكن استزراع معظم التعاطف في المختبر ، وأساليب لعزل كمية كافية من البكتيريا لتسلسل الجينوم هي مهمة جدا. في الذبابة البيضاء بيميسيا تاباسي، تم تحديد عدد من إندوسيمبيونتس ويتوقع أن تكون ذات أهمية في تطوير وتكاثر الآفات من خلال نهج متعددة. ومع ذلك، فإن الآلية التي تقوم عليها الجمعيات لا تزال غير معروفة إلى حد كبير. والعقبة تأتي جزئيا من حقيقة أن إندوسيمبيونتس في الذبابة البيضاء، ومعظمهم من ضبط النفس في البكتيريا، من الصعب فصل من الخلايا المضيفة. نحن هنا تقرير بروتوكول خطوة بخطوة لتحديد واستخراج وتنقية إندوسيمبيونتس من الذبابة البيضاء B. تاباسي أساسا عن طريق تشريحعلى والترشيح. عينات إندوسيمبيونت أعدت من قبل هذه الطريقة، على الرغم من أن لا يزال خليط من الأنواع إندوسيمبيونت مختلفة، هي مناسبة لتسلسل الجينوم لاحق وتحليل الأدوار المحتملة لل إندوسيمبيونتس في B. تاباسي. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لعزل إندوسيمبيونتس من الحشرات الأخرى.

Introduction

البكتيريا التي تشكل علاقة تكافلية حميمة مع المضيفين النسبية منتشرة على نطاق واسع في المفصليات ¹ . وقد ثبت أن إندوسيمبيونتس تؤثر على جوانب المضيفين، مثل استقلاب التغذية، والاستنساخ، والاستجابات للضغوط البيئية ^{2 ، 3 ، 4} وما إلى ذلك ، في كل مرحلة تنموية تقريبا ⁵ . ومع ذلك، فإن الآلية التي تقوم عليها الجمعيات لا تزال غير معروفة إلى حد كبير. علم الجينوم هو من الأولوية والأهمية عند دراسة الوظائف والأدوار المحتملة للبكتيريا. ويمكن الاستدلال على بعض المعلومات الأساسية، أي الحالة التصنيفية، والجينات الوظيفية، ومسارات الأيض، ونظم الإفراز، من تسلسل الجينوم، الذي يلقي الضوء على الأدوار المحتملة للروابط في التعايش. مع تطور تسلسل الإنتاجية العالية، وقد تم تسلسل عدد كبير من الجينومات البكتيرية ثإيث وظائف متنوعة كشفت ⁶ .

إندوسيمبيونتس هي ذات أهمية حيوية في هيميبتيرانز، مثل المن ⁷ ، البق ⁸ ، بسيلدس ⁹ ، بلانثوبرز البني ¹⁰ و السيكادا ¹¹ . على سبيل المثال، وقد أثبتت بوكنيرا في المن، باعتبارها التعاطف الملزم، للمشاركة في الحيوي الحيوي الأحماض الأمينية، جنبا إلى جنب مع الجينات من الجينوم المن ¹² . وعلاوة على ذلك، يتم الكشف عن تنظيم النسخي بوكنيرا أيضا ¹³ . في بسيلديس ، كارسونيلا هو تسلسل وتصنيف أصغر الجينوم البكتيري وجدت من أي وقت مضى ¹⁴ . وتستند كل هذه السمات المميزة لل إندوسيمبيونتس وتستدل من تسلسل الجينوم. لأن هذه إندوسيمبيونتس لا يمكن أن تكون مثقف في المختبر ، وقد طبقت عدة نهج لعزل البكتيريا الكافية لمقترضةuencing. في المن، يتم استخراج إندوسيمبيونتس من خلال الطرد المركزي والترشيح، وتخضع لمزيد من التحليل الجيني و ترانسكريبتوميك ⁵ . في بنهوبرز البني، يتم تسلسل إندوسيمبيونتس جنبا إلى جنب مع الجينوم الحشرة كلها ¹⁰ .

الذبابة البيضاء B. تاباسي هو مجمع الأنواع التي تحتوي على أكثر من 35 الأنواع المورفولوجية التي لا يمكن تمييزها (الأنواع الخفية)، من بينها، غزو نوعين الغازية في جميع أنحاء العالم وتسبب ضررا هائلا للإنتاج الزراعي ¹⁵ . وتجدر الإشارة إلى أن إندوسيمبيونتس ضمن الأنواع B. تاباسي أظهرت أهمية في تطوير الآفات ¹⁶ . حتى الآن، تم تحديد ثمانية إندوسيمبيونتس في الذبابة البيضاء، بما في ذلك التعاطف الملزم، كانديداتوس بورتيرا أيروديداروم، وسبعة تعاطف ثانوي هاميلتونيلا ، ريكيتسيا ، أرسينوفونوس ، كاردينيم ، < إم> ولباشيا، فريتشيا و هيميبتيريفيلوس المعرفة ^{17 ، 18} .

على عكس هيميبتيرانز وصفها سابقا، الذبابة البيضاء B. تاباسي هو حشرة صغيرة للغاية فقط 1 ملم في الطول. تقتصر معظم إندوسيمبيونتس إلى البكتيريا ¹⁹ (الخلايا المتخصصة التي تحتوي على سيمبيونتس، التي تشكل كذلك البكتيريا في B. تاباسي). وبالإضافة إلى ذلك، هذه إندوسيمبيونتس لا يمكن أن تكون مثقف في المختبر . الطريقة الوحيدة للحصول على إندوسيمبيونتس من B. تاباسي هو تشريح البكتيريا خارج. ومع ذلك، هناك صعوبة في تشريح. أولا، البكتيريا الهشة ترتبط دائما مع أنسجة أخرى من الذبابة البيضاء، والتي من الصعب فصل. ثانيا، حجم صغير من الذبابة البيضاء يحد من عزل ما يكفي من البكتيريا. ثالثا، إندوسيمبيونتس الكتلة في البكتيريا، مما يجعل من تعقيد للغاية للحصول على نوع واحد من البكتيريا.

أس = "jove_content"> هنا، نحن الإبلاغ عن بروتوكول بسيط وغير مكلف لعزل إندوسيمبيونتس الذبابة البيضاء لتسلسل ميتاجينوم لاحق. من خلال التشريح، والتنقية والتضخيم، ويمكن الحصول على الحمض النووي كافية إندوسيمبيونت ويمكن تأكيد أنواع البكتيريا. بروتوكول وصفها يمكن استخدامها على نحو مماثل في المفصليات الأخرى.

Protocol

1. الذبابة البيضاء وتربية الأنواع الخفي

1. الحفاظ على أنواع الذبابة البيضاء على القطن غوسيبيوم هيرسوتم (مالفاسي) (كف زهي-ميان 1973) في أقفاص تحت ظروف قياسية من 27 ± 1 درجة مئوية، و 70 ± 10٪ الرطوبة و 14 ساعة ضوء: 10 ساعة النظام المظلم.
2. جمع الذبابة البيضاء الفردية والتجانس في 30 ميكرولتر من العازلة تحلل (10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.4، 50 ملي بوكل، 0.45٪ [الوزن بالوزن / فول] توين 20، 0.2٪ [وت / فول] الجيلاتين، 0.45٪ [المجلد / فول] نونيديت P 40، 60 جم ​​/ مل بروتين K).
3. احتضان جناسة في 65 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ثم 100 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
   ملاحظة: يمكن زيادة وقت الحضانة عند 65 درجة مئوية إذا لزم الأمر. وينبغي أن يكون حاضنة الوقت في 100 درجة مئوية تسيطر عليها بشكل حاسم لإيقاف كاف K البروتين وتجنب تلف الحمض النووي.
4. أداء تفاعل البوليميراز سلسلة (ير) باستخدام الحمض النووي الذبابة البيضاء (المكتسبة في القسم 1.3) على أساس الميتوكوندريا السيتوكروم أوكسيديز الأول الاشعال.
   كوي-F: 5'-تغاتغتكاتساغاغت-3 '
   كوي-R: 5'-تاتاتغكاغاتغتكاتغا-3 '
   1. أداء تفاعلات ير في الحجم النهائي من 25 ميكرولتر تحتوي على 1 U من البلمرة دنا طق ، 2.5 ميكرولتر العازلة 10X، 0.2 ملي دنتب، 0.2 ملم من كل التمهيدي و 2 ميكرولتر من الحمض النووي الذبابة البيضاء.
   2. استخدام شروط الإجراء ير التالية: تمسخ الأولي 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق تليها 35 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 45 ثانية (تمسخ)، 50 درجة مئوية لمدة 45 ثانية (الصلب) و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة (التمديد) و آخر 10 دقيقة في 72 درجة مئوية لمزيد من التمديد.
5. تنظيف ير تضخيم المنتج باستخدام مجموعة استخراج هلام الحمض النووي مع البروتوكول الموصى بها.
6. تسلسل عينات الحمض النووي المنقى مع نظام تسلسل عينة الحمض النووي بعد تعليمات الشركة الصانعة.
7. تحليل تسلسل باستخدام أداة البحث المحاذاة المحلية الأساسية (بلاست) لتحديد أنواع خفية من الذبابة البيضاء وتجنب تلوث غيرها من سبيسيوفاق.

2. إندوسيمبيونت تحديد والتعريب

1. أداء ير على الحمض النووي الذبابة البيضاء (المكتسبة في الخطوة 1.3) لتضخيم جينات محددة من كل إندوسيمبيونت داخل الذبابة البيضاء (وصفت وصفة ير في القسم 1.4، وترد إجراءات ير والبادئات في الجدول 1 ).
2. موضوع العينة تضخيم إلى أغاروس هلام الكهربائي وفقا لبروتوكول نشرت سابقا ²⁰ (1٪ هلام الاغاروز، تريس-أسيتات-إدتا كما العازلة تشغيل، والجهد 5 V / سم) لتحديد الجينات محددة من كل بكتيريا.
3. استعادة وتسلسل كل فرقة لتحديد الأنواع البكتيرية داخل الذبابة البيضاء (انظر الأقسام 1.5-1.7).
4. أداء مضان في التهجين الموضعي (فيش) على وايتفليز لتحديد موقع إندوسيمبيونتس وفقا للبروتوكول المنشورة سابقا ¹⁹ .
   ملاحظة: زيادة تركيز تحقيقات الفلورسنت إذا لزم الأمر.

3. انتقال المجهر الإلكتروني (تيم)

1. تزج وتثبيت ويتفليز في الفوسفات العازلة (0.1 M، ودرجة الحموضة 7.0) التي تحتوي على 2.5٪ [فول / فول] غلوتارالدهيد لمدة 4 ساعات.
2. غسل العينات في الفوسفات العازلة (0.1 M، ودرجة الحموضة 7.0) ثلاث مرات، 15 دقيقة في كل مرة.
3. تزج وإصلاح العينات مرة أخرى في العازلة الفوسفات (0.1 M، ودرجة الحموضة 7.0) تحتوي على 1٪ [وت / فول] أوسو ₄ لمدة 2 ساعة.
4. تجفيف العينات من قبل سلسلة متدرجة من الايثانول (30٪، 50٪، 70٪، 80٪، 90٪، 95٪ و 100٪)، 15 دقيقة في كل مرة.
5. نقل وتزج العينات في الأسيتون 100٪ لمدة 20 دقيقة.
6. وضع العينات في خليط من الأسيتون 100٪ و 100٪ راتنج سبور (1: 1) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
7. نقل العينات إلى خليط من الأسيتون 100٪ و 100٪ راتنج سبور (1: 3) لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة.
8. نقل وتزج العينات في 100٪ الراتنج سبور (المحتضنة في 70 درجة مئوية) لأكثر من 9 ساعة.
9. قسم عينات الذبابة البيضاء باستخدام مايكروإلي.
10. وصمة عار الأفلام رقيقة جدا (المكتسبة في القسم 3.9) عن طريق الغمر في خلات اليورانيل المطلق لمدة 5-10 دقيقة، تليها الغمر في 50٪ القلوية الرصاص سيترات لمدة 5-10 دقيقة أخرى.
    ملاحظة: أحجام الكواشف المستخدمة في القسم 3.1-3.10 تعتمد على العينات. تأكد من أن مغمورة العينات في الكواشف.
11. مراقبة العينات تحت المجهر الإلكتروني انتقال (15،000X) لتحديد توطين وشكل وحجم البكتيريا لمزيد من الاستخدام (انظر القسم 4.6).

4. الذبابة البيضاء بكتيريوم تشريح وتنقية

1. إضافة 100 ميكرولتر من حل برنامج تلفزيوني 1X على شريحة المجهر. اختيار بعض الحوريات 3 أو 4 ^ال إنستار من أوراق القطن وتزجها في حل برنامج تلفزيوني.
2. استخدام الإبر حشري غرامة تحت ستيريوميكروسكوب وسحب البكتيريا من الجسم الذبابة البيضاء.
   1. قطع بلطف حفرة على جانب واحد من الحورية، والضغط قليلا على الآخرالجانب للسماح للبكتريوميس بها.
3. جبل 20 ميكرولتر ميكرولتر (مع قطع نهاية الرائدة لتلبية حجم البكتيريا) على ماصة 0.5-10 ميكرولتر. استخراج البكتيريا الفردية من حل برنامج تلفزيوني في ميكرولودر.
4. غسل البكتيريا للقضاء على تلوث أنسجة الذبابة البيضاء الأخرى عن طريق بيبتينغ البكتيريا في حل برنامج تلفزيوني واستخراج البكتيريا. كرر ثلاث مرات.
5. ماصة على الفور البكتيريا غسلها في أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على 60 ميكرولتر من حل بس 1X.
6. المحقنة تصفية البكتيريا تجميعها من خلال غشاء فلتر 5 ميكرون (تحددها أحجام البكتيريا ونواة البكتيريا في الذبابة البيضاء). كرر عدة مرات لنقل السائل المختلط من خلال غشاء فلتر بدقة.
   ملاحظة: لتحقيق نتيجة أفضل من التضخيم والتسلسل، وتجميع أكثر من 100 بكتيريوميس. الرطب غشاء فلتر أولا باستخدام 1X حل برنامج تلفزيوني لتقليل فقدان البكتيرياملزمة للغشاء.

5. التضخيم من جينوميس إندوسيمبيونت

1. تضخيم الترشيح (التي تحتوي أساسا على إندوسيمبيونتس الذبابة البيضاء) باستخدام مجموعة تضخيم الحمض النووي من قبل بروتوكول الموصى بها مع بعض التعديل.
   1. اختيار بروتوكول الموصى بها من التضخيم من الحمض النووي الجيني من الدم أو الخلايا وإعداد D2 العازلة لتجربة لاحقة.
   2. إضافة مباشرة 1.5 ميكرولتر من الترشيح (انظر القسم 4.6) إلى أنبوب الطرد المركزي، تليها 1.5 ميكرولتر من العازلة D2 وتخلط جيدا.
   3. احتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة وإضافة 1.5 ميكرولتر من حل التوقف.
   4. إضافة 15 ميكرولتر من المخزن المؤقت التفاعل و 1 ميكرولتر من البلمرة الحمض النووي وتخلط بلطف.
   5. احتضان الخليط في 30 درجة مئوية لمدة 16 ساعة، تليها 3 دقائق عند 65 درجة مئوية.
2. أداء ير مباشرة على الترشيح تضخيم (تمييع عينات تضخيم إذا لزم الأمر) باستخدام الاشعال محددة مصممة ل باكتيريا لتأكيد أنواع البكتيريا (انظر القسم 2.1).
3. إجراء ير لتأكيد ما إذا كان هناك تلوث الجينوم المضيف باستخدام الجين الذبابة البيضاء بيتا أكتين و EF1 الاشعال وفقا لطريقة نشرت سابقا ²¹ (وصف وصف ير في القسم 1.4).

6. إندوسيمبيونت ميتاجينوم التسلسل

1. تخضع الترشيح المضخم إلى مقياس الطيف وفلورومتر (وفقا لتعليمات الشركة الصانعة) قبل التسلسل لاختبار جودة العينات وعما إذا كانت العينات تستوفي معايير التسلسل.
2. قم بتصنيع المضخم إلى جهاز الجينوم وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.

النتائج

وقد أخذت أنواع الشرق الأوسط آسيا الصغرى 1 (MEAM1) من مجمع B. تاباسي كمثال هنا للتوصيف. ويظهر الشكل رقم 1 قطن لتربية ويتفليز وعدة مراحل تنموية للبيض الأبيض، بما في ذلك نبات القطن والذبابة البيضاء للكبار وحوريات الذبابة البيضاء ^الأ?...

Discussion

Since the endosymbionts within whiteflies cannot be cultured in vitro, dissection and assembling bacteriocytes is an effective way to obtain enough genetic material of endosymbionts. Before dissection, the species of whitefly and endosymbionts involved should be explicitly confirmed. The whitefly B. tabaci is a species complex with more than 35 morphologically indistinguishable species and different cryptic species may contain different endosymbionts. Portiera is uniformly harbored as an obliga...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Taq DNA polymerase	Takara	R001A	including rTaq, 10×Buffer and dNTP
Gel DNA extraction kit	Qiagen	28704
DNA sample sequencing system	ABI	ABI-3730XL
Microtome	Leica	EM UC7
Transmission electron microscopy	Hitachi	H-7650 TEM
Stereo microscope	Zeiss	Stemi 2000-C
20 μL microloader	Eppendorf	F2771951
Filter holder	Millipore	SX0001300
Filter membrane filter	Millipore	SMWP001300	5.0 μm SMWP
REPLI-g UltraFast Mini Kit	Qiagen	150033	DNA amlification kit
NanoDrop	Thermo Scientific	NanoDrop 2000
Qubit Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33216
Genome Sequencer	Illumina	Hiseq 2000