שיטות להפקת endosymbionts מן Whitefly<em&gt; Bemisia Tabaci</em

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד endosymbionts מ tabaci בימייה פרפר באמצעות נתיחה וסינון. לאחר הגברה, דגימות DNA מתאימים לרצף הבאים ולימוד של הדדיות בין endosymbionts ו whitefly.

Abstract

חיידקים בקטריאליים יוצרים קשר אינטימי עם המארחים שלהם ומעניקים יתרונות למארח ברוב המקרים. מידע גנומי הוא קריטי ללמוד את הפונקציות ואת האבולוציה של חיידקים חיידקים המארח שלהם. כמו רוב symbionts לא יכול להיות מתורבת במבחנה , שיטות לבודד כמות נאותה של חיידקים עבור רצף הגנום חשובים מאוד. ב bemisia bamisia tabaci , מספר endosymbionts זוהו ו צפויים להיות בעל חשיבות בפיתוח ורבייה של מזיקים דרך גישות רבות. עם זאת, המנגנון המסייע לאסוציאציות נותר בלתי מוכר במידה רבה. המכשול נובע באופן חלקי מהעובדה כי endosymbionts ב whitefly, בעיקר מאופק בבקטריוציטים, קשה להפריד בין התאים המארח. כאן אנו מדווחים על פרוטוקול צעד אחר צעד לזיהוי, מיצוי וטיהור של endosymbionts מ whitefly B. tabaci בעיקר על ידי dissectiב ו סינון. דגימות Endosymbiont שהוכנו על ידי שיטה זו, אם כי עדיין תערובת של מינים שונים endosymbiont, מתאימים רצף הגנום הבאים וניתוח של תפקידים אפשריים של endosymbionts ב Tabaci. שיטה זו עשויה לשמש גם לבידוד endosymbionts מ חרקים אחרים.

Introduction

חיידקים המרכיבים מערכת יחסים סימביוטית אינטימית עם המארחים היחסיים נפוצים אצל פרוקי רגליים. את endosymbionts הוכחו כדי להשפיע על היבטים של המארחים, כגון מטבוליזם תזונה, רבייה, תגובות ללחץ סביבתי ^{2 , 3 , 4} וכו ' , כמעט בכל שלב התפתחותי ⁵ . עם זאת, המנגנון העומד בבסיס הארגונים עדיין אינו ידוע. גנומיקה היא בעלת חשיבות עליונה כאשר לומדים את הפונקציות הפוטנציאליות ואת תפקידים של חיידקים. חלק מהמידע הבסיסי, כלומר המעמד הטקסונומי, הגנים הפונקציונליים, מסלולי חילוף החומרים, מערכות ההפרשה, ניתן להסיק מרצפי הגנום, אשר שופכים אורות על התפקידים הפוטנציאליים של סימביונטות בסימביוזה. עם התפתחות של רצף תפוקה גבוהה, מספר עצום של גנומים חיידקים כבר רצף wIth פונקציות מגוונות גילה ⁶ .

Endosymbionts הם בעלי חשיבות חיונית ב hemipterans, כגון כנימות ⁷ , פשפשים ⁸ , פסיילים ⁹ , Planthoppers חום ¹⁰ ו cicadas ¹¹ . לדוגמה, בוכנרה ב כנימות, כמו סימביונט חובה, הוכח להיות מעורב חומצות אמינו חיוניות biosynthesis, יחד עם הגנים של הגנום aphid ¹² . יתר על כן, תקנה תעתיק של Buchnera נחשף גם ¹³ . בפסילים, קרסונלה הוא רצף מדורגת הגנום החיידקי הקטן ביותר שנמצא אי פעם ¹⁴ . כל אלה סימני ההיכר של endosymbionts מבוססים ו להסיק את רצפי הגנום. בגלל אלה endosymbionts לא יכול להיות מתורבת במבחנה , מספר גישות הוחלו לבודד חיידקים נאותים עבור seqהעלאה. ב כנימות, endosymbionts מופקים באמצעות צנטריפוגה וסינון, ונתונה ניתוח גנומי נוסף transcriptomic ⁵ . ב planthoppers חום, endosymbionts הם רצף יחד עם גנום חרק כולו ¹⁰ .

Whitefly B. Tabaci הוא קומפלקס מינים המכיל יותר מ -35 מינים שאינם ניתנים לזיהוי מבחינה מורפולוגית (מינים סתומים), בהם שני מינים פולשניים פלשו לכל רחבי העולם וגרמו לפגיעה עצומה בייצור החקלאי. של הערה, endosymbionts בתוך מינים tabaci B. הראו חשיבות בפיתוח מזיקים ¹⁶ . עד כה, שמונה endosymbionts זוהו ב whitefly, כולל symbiont חובה, Candidatus Portiera alerodididum, ושבע סימביונטות משניות המילטונלה , Rickettsia , ארסנופונוס , קרדיניום , < Em> וולבכיה, פריטשה והמיפטריפילוס הגדירו ^{17 , 18} .

שלא כמו ההמיפטרנים שתוארו קודם לכן, הטפטף הלבן הוא חרק זעיר באורך של 1 מ"מ בלבד. רוב endosymbionts מוגבלים bacteriocytes ¹⁹ (תאים מיוחדים המכילים symbionts, אשר טופס נוסף bacteriome ב B. tabaci ). בנוסף, אלה endosymbionts לא יכול להיות מתורבת במבחנה . הדרך היחידה להשיג endosymbionts מ B. tabaci היא לנתח את bacteriome החוצה. עם זאת, יש קושי של דיסקציה. ראשית, החיידק השברירי תמיד מקשר עם רקמות אחרות של הפרפר, שקשה להפריד ביניהם. שנית, הגודל הזעיר של הפרפר מגביל את הבידוד של בקטריום מספיק. שלישית, endosymbionts מקבץ בבקטריום, מה שהופך אותו מסובך מאוד לרכוש מינים בודדים של חיידק.

התחת = "jove_content"> כאן, אנו מדווחים פרוטוקול פשוט וזול לבודד endosymbionts whitefly עבור רצף metagenome הבאים. באמצעות דיסקציה, טיהור והגברה, ניתן להשיג DNA מתאים ל- endosymbiont וניתן לאשר את מינים של חיידקים. פרוטוקול המתואר ניתן להשתמש באופן דומה אחרים פרוקי רגליים.

Protocol

1. Whitefly Rearing ומין מינים זיהוי

1. שמירה על מינים לבן על כותנה Gossypium hirsutum (Malvaceae) (cv. Zian-mian 1973) בכלובים בתנאים סטנדרטיים של 27 ± 1 ° C, לחות 70 ± 10% ו 14 שעות אור: 10 שעות משטר כהה.
2. איסוף לבן יחיד מבוגר ו homogenize ב 30 μL של חיץ תמוגה (10 מ"מ טריס, pH 8.4, 50 מ"מ KCl, 0.45% [wt / vol] Tween-20, 0.2% [wt / vol] ג 'לטין, 0.45% [vol / Vol] Nonidet P 40, 60 גרם / מ"ל ​​Proteinase K).
3. דגירה homogenate ב 65 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות ולאחר מכן 100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   הערה: זמן דגירה על 65 מעלות צלזיוס ניתן להגדיל אם יש צורך. זמן דגירה על 100 מעלות צלזיוס צריך להיות מבוקר בביקורתית מספיק להשבית Proteinase K ולהימנע נזק DNA.
4. בצע את התגובה שרשרת פולימראז (PCR) באמצעות DNA לבן (שנרכש בסעיף 1.3) על בסיס אוקטידאז ציטוכרום המיטוכונדריה אני primers.
   COI-F: 5'-TTGATTTTTGGTCATCCAGAAGT-3 '
   COI-R: 5'-TAATATGGAGATTAGTGCATTGGA-3 '
   1. בצע את התגובות PCR בנפח סופי של 25 μL המכיל 1 U של פולימרז DNA Taq , 2.5 מאגר μL 10x, 0.2 מ"מ dNTP, 0.2 מ"מ של כל תחל ו 2 μL של DNA לבן.
   2. השתמש בתנאים הבאים הליך PCR: denaturation הראשונית 95 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ואחריו 35 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס במשך 45 שניות (denaturation), 50 מעלות צלזיוס במשך 45 שניות (חישול) ו 72 מעלות צלזיוס למשך 1 דקות (הרחבה) ו עוד 10 דקות ב 72 מעלות צלזיוס להארכה נוספת.
5. נקה את המוצר מוגבר PCR באמצעות ערכת ג 'ל DNA החילוץ עם פרוטוקול מומלץ.
6. רצף דגימות DNA מטוהרים עם דגימה דנ"א רצף המערכת בעקבות ההוראה של היצרן.
7. לנתח את sequences באמצעות כלי בסיסי מקומי יישור כלי (BLAST) כדי לזהות את מינים סתומים של זבוב לבן ולמנוע זיהום של speci אחריםEs.

2. זיהוי Endosymbiont לוקליזציה

1. לבצע PCR על DNA לבן (שנרכש בשלב 1.3) כדי להגביר את הגנים הספציפיים של endosymbiont כל בתוך whitefly (מתכון ה- PCR מתואר בסעיף 1.4, ו PCR נהלים פריימרים המפורטים בטבלה 1 ).
2. נושא המדגם מוגבר על ג'ל אלקטרופורזה agarose על פי פרוטוקול שפורסם בעבר ²⁰ (1% agarose ג'ל, Tris-אצטט-EDTA כמו חיץ פועל, מתח 5 V / cm) כדי לזהות את הגן הספציפי של כל חיידק.
3. לשחזר ורצף כל הלהקה כדי לקבוע את מינים חיידקי בתוך whitefly (ראה סעיפים 1.5-1.7).
4. בצע הקרינה באתר הכלאות (FISH) על whiteflies לזהות את המיקום של endosymbionts על פי פרוטוקול שפורסם בעבר ¹⁹ .
   הערה: יש להגדיל את הריכוז של בדיקות פלורסנט במידת הצורך.

3. הילוכים אלקטרונים מיקרוסקופית (TEM)

1. לטבול לתקן whiteflies במאגר פוספט (0.1 M, pH 7.0) המכיל 2.5% [vol / vol] glutaraldehyde עבור 4 שעות.
2. שטפו את דגימות במאגר פוספט (0.1 M, pH 7.0) שלוש פעמים, 15 דקות בכל פעם.
3. לטבול ולתקן את דגימות שוב במאגר פוספט (0.1 M, pH 7.0) המכיל 1% [wt / vol] OsO ₄ עבור 2 שעות.
4. מייבשים את הדגימות על ידי סדרה מדורגת של אתנול (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% ו 100%), 15 דקות בכל פעם.
5. העברה לטבול את דגימות לתוך אצטון 100% במשך 20 דקות.
6. מניחים את הדגימות בתערובת של אצטון 100% ו 100% שרף spurr (1: 1) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.
7. מעבירים את הדגימות לתערובת של אצטון 100% ו 100% שרף Spurr (1: 3) במשך 3 שעות בטמפרטורת החדר.
8. העברה לטבול את דגימות 100% שרף spurr (מודגרות על 70 מעלות צלזיוס) במשך יותר מ 9 שעות.
9. סעיף דגימות פרפר באמצעות מיקרולי.
10. כתם את הסרטים דק במיוחד (שנרכש בסעיף 3.9) על ידי טבילה ב אצטט uranyl מוחלטת עבור 5-10 דקות, ואחריו טבילה ב 50% אלקטרלי ציטראט להוביל עוד 5-10 דקות.
    הערה: כרכים של ריאגנטים מנוצל בסעיף 3.1-3.10 תלויים הדגימות. ודא דגימות שקועים ריאגנטים.
11. שימו לב לדגימות במיקרוסקופ אלקטרונים בתדר (15,000X) כדי לקבוע את לוקליזציה, צורה וגודל של חיידקים לשימוש נוסף (ראה סעיף 4.6).

4. Whitefly Bacteriome Dissection וטיהור

1. הוסף 100 μL של פתרון 1x PBS על שקופית מיקרוסקופ. בחר כמה 3 ^rd או 4 ^th נימפות מן העלים כותנה לטבול אותם לתוך הפתרון PBS.
2. השתמש מחטים אנטומולוגיים בסדר תחת stereomicroscope ולמשוך את הבקטריומים מתוך הגוף פרפר.
   1. לחתוך בעדינות חור בצד אחד של נימפה, ולחץ מעט על השניבצד לתת את הבקטריומים החוצה.
3. הר microloader 20 μL (עם לחתוך את קצה מוביל כדי לענות על גודל bacteriome) על פיפטה 0.5-10 μL. לחלץ את החיידק הפרט מתוך הפתרון PBS לתוך microloader.
4. לשטוף את bacteriome לחסל את הזיהום של רקמות רקמות אחרות על ידי pipetting את הבקטריום לתוך הפתרון PBS ולחלץ את הבקטריום. חזור שלוש פעמים.
5. מיד פיפטה הבקטריום שטף לתוך צינור צנטריפוגה המכיל 60 μL של פתרון PBS 1x.
6. מזרק לסנן את bacteriome התאספו באמצעות 5 קרום מסנן מיקרומטר (נקבע על ידי גדלים של חיידקים וגרעין של bacteriocyte ב whitefly). חזור על מספר פעמים כדי להעביר את הנוזל המעורב דרך קרום המסנן ביסודיות.
   הערה: כדי להשיג תוצאה טובה יותר של הגברה ורצף, להרכיב מעל 100 bacteriomes. רטוב קרום המסנן הראשון באמצעות פתרון 1x PBS כדי להפחית את אובדן החיידקיםמחייב את הממברנה.

5. הגברה של הגנום Endosymbiont

1. להגביר את תסנין (בעיקר המכיל endosymbionts של פרפר) באמצעות ערכת הגברה DNA על ידי פרוטוקול מומלץ עם שינוי כלשהו.
   1. בחר את הפרוטוקול המומלץ של הגברה של DNA גנומי מן הדם או תאים ולהכין D2 חיץ לניסוי הבא.
   2. להוסיף ישירות 1.5 μL של תסנין (ראה סעיף 4.6) לצינור צנטריפוגה, ואחריו μL 1.5 של D2 הצפת ומערבבים היטב.
   3. לדגור על הקרח במשך 10 דקות ולהוסיף 1.5 μL של פתרון להפסיק.
   4. הוסף 15 μL של חיץ התגובה 1 μL של פולימראז DNA לערבב בעדינות.
   5. לדגור את התערובת על 30 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות, ואחריו 3 דקות ב 65 מעלות צלזיוס.
2. בצע PCR ישירות על סינון מוגבר (לדלל את הדגימות מוגבר במידת הצורך) באמצעות פריימרים ספציפיים המיועדים bacטריה כדי לאשר את מינים חיידקים (ראה סעיף 2.1).
3. התנהגות PCR כדי לאשר אם יש זיהום של הגנום המארח באמצעות גרגר לבן בטן אקטין ו EF1 primers על פי השיטה שפורסמה בעבר ²¹ (מתכון ה- PCR מתואר בסעיף 1.4).

6. Endosymbiont Metagenome רצף

1. נושא סינון מוגבר ספקטרופוטומטר ו fluorometer (על פי הוראות היצרן) לפני רצף לבדוק את איכות דגימות ואם הדגימות לעמוד בקריטריונים של רצף.
2. נושא המוגבר לרצף הגנום בהתאם להוראות היצרן.

תוצאות

המזרח התיכון אסיה 1 מינור 1 (MEAM1) מינים של B. Tabaci מורכבים נלקח כדוגמה כאן לתיאור. כותנה לגידול whiteflies וכמה שלבים התפתחותיים של whiteflies מוצגים באיור 1 כולל צמח כותנה, זבוב לבן ו 1 ^st, 2 ^nd ו 4 n נימפות ניר של whitefly (3 ^rd instar נימפה...

Discussion

Since the endosymbionts within whiteflies cannot be cultured in vitro, dissection and assembling bacteriocytes is an effective way to obtain enough genetic material of endosymbionts. Before dissection, the species of whitefly and endosymbionts involved should be explicitly confirmed. The whitefly B. tabaci is a species complex with more than 35 morphologically indistinguishable species and different cryptic species may contain different endosymbionts. Portiera is uniformly harbored as an obliga...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Taq DNA polymerase	Takara	R001A	including rTaq, 10×Buffer and dNTP
Gel DNA extraction kit	Qiagen	28704
DNA sample sequencing system	ABI	ABI-3730XL
Microtome	Leica	EM UC7
Transmission electron microscopy	Hitachi	H-7650 TEM
Stereo microscope	Zeiss	Stemi 2000-C
20 μL microloader	Eppendorf	F2771951
Filter holder	Millipore	SX0001300
Filter membrane filter	Millipore	SMWP001300	5.0 μm SMWP
REPLI-g UltraFast Mini Kit	Qiagen	150033	DNA amlification kit
NanoDrop	Thermo Scientific	NanoDrop 2000
Qubit Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33216
Genome Sequencer	Illumina	Hiseq 2000