Methoden zur Extraktion von Endosymbionten aus der Whitefly<em&gt; Bemisia tabaci</em

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Isolierung von Endosymbionten aus der Whitefly Bemisia tabaci durch Dissektion und Filtration. Nach der Amplifikation eignen sich die DNA-Proben für die anschließende Sequenzierung und Untersuchung des Mutualismus zwischen Endosymbionten und Whitefly.

Zusammenfassung

Bakterielle Symbionten bilden eine intime Beziehung zu ihren Gastgebern und verleihen den Gastgebern in den meisten Fällen Vorteile. Genomische Informationen sind entscheidend, um die Funktionen und die Entwicklung von bakteriellen Symbionten in ihrem Wirt zu studieren. Da die meisten Symbionten nicht in vitro kultiviert werden können, sind Methoden zur Isolierung einer adäquaten Menge an Bakterien für die Genomsequenzierung sehr wichtig. In der Whitefly Bemisia tabaci wurde eine Anzahl von Endosymbionten identifiziert und vorausgesetzt, dass sie bei der Entwicklung und Reproduktion der Schädlinge durch mehrere Ansätze von Bedeutung sind. Der Mechanismus, der die Verbände untermauert, bleibt jedoch weitgehend unbekannt. Das Hindernis kommt teilweise aus der Tatsache, dass die Endosymbionten in whitefly, meist in Bakteriocyten zurückgehalten, schwer von den Wirtszellen zu trennen sind. Hier berichten wir ein schrittweises Protokoll zur Identifizierung, Extraktion und Reinigung von Endosymbionten aus dem Whitefly B. Tabaci vorwiegend durch DissectiAuf und filtration. Endosymbiont-Proben, die nach dieser Methode hergestellt wurden, obwohl immer noch eine Mischung aus verschiedenen Endosymbiont-Spezies, eignen sich für die anschließende Genomsequenzierung und die Analyse der möglichen Rollen von Endosymbionten in B. tabaci . Diese Methode kann auch verwendet werden, um Endosymbionten von anderen Insekten zu isolieren.

Einleitung

Bakterien, die eine intime symbiotische Beziehung mit relativen Wirten bilden, sind bei Arthropoden weit verbreitet ¹ . Es wurde gezeigt, dass die Endosymbionten in fast allen Entwicklungsstadien die Aspekte von Wirten, wie den Stoffwechsel, die Reproduktion, die Reaktionen auf die Umweltbelastungen ^{2 , 3 , 4} usw. beeinflussen. Der Mechanismus, der die Verbände untermauert, bleibt jedoch weitgehend unbekannt. Genomik ist von Priorität und Bedeutung beim Studium der möglichen Funktionen und Rollen von Bakterien. Über die Genomsequenzen, die den potentiellen Rollen der Symbionten in der Symbiose beleuchten, können einige fundamentale Informationen, dh der taxonomische Status, funktionale Gene, Stoffwechselwege, Sekretionssysteme, abgeleitet werden. Mit der Entwicklung der Hochdurchsatz-Sequenzierung wurde eine große Anzahl von bakteriellen Genomen sequenziertMit diversen Funktionen zeigte sich ⁶ .

Endosymbionten sind von entscheidender Bedeutung bei Hämipteren, wie Blattläuse ⁷ , Wanzen ⁸ , Psyllids ⁹ , braune Pflanzenpflege ¹⁰ und Zikaden ¹¹ . So wurde zum Beispiel Buchnera in Blattläuse als obligates symbiont gezeigt, dass es in die essentielle Aminosäurebiosynthese involviert ist, zusammen mit den Genen aus Blattlausgenom ¹² . Darüber hinaus zeigt sich auch die Transkriptionsregulation von Buchnera ¹³ . In Psylliden wird Carsonella sequenziert und rangiert das kleinste bakterielle Genom, das jemals gefunden wurde ¹⁴ . Alle diese Kennzeichen von Endosymbionten basieren und werden aus den Genomsequenzen abgeleitet. Da diese Endosymbionten nicht in vitro kultiviert werden können, wurden mehrere Ansätze angewendet, um adäquate Bakterien für seq. Zu isolierenUning Bei Blattläusen werden Endosymbionten durch Zentrifugation und Filtration extrahiert und einer weiteren genomischen und transkriptomischen Analyse unterzogen. In braunen Pflanzern werden Endosymbionten zusammen mit dem ganzen Insektengenom ¹⁰ sequenziert.

Whitefly B. tabaci ist ein Spezieskomplex mit mehr als 35 morphologisch nicht unterscheidbaren Spezies (kryptische Spezies), unter denen zwei invasive Arten auf der ganzen Welt eingedrungen sind und der landwirtschaftlichen Produktion enorme Schäden verursacht haben ¹⁵ . Bemerkenswert, Endosymbionten innerhalb der B. tabaci- Arten haben bei der Entwicklung der Schädlinge Bedeutung geweckt ¹⁶ . Bisher wurden acht Endosymbionten in der Whitefly identifiziert, darunter der obligatorische Symbiont, Candidatus Portiera aleyrodidarum und sieben sekundäre Symbionten Hamiltonella , Rickettsia , Arsenophonus , Cardinium , Wolbachia, Fritschea und Hemipteriphilus definiert ^{17 , 18} .

Im Gegensatz zu den zuvor beschriebenen Hemipterern ist die Whitefly B. Tabaci ein äußerst winziges Insekt, das nur 1 mm lang ist. Die meisten Endosymbionten beschränken sich auf Bakteriozyten ¹⁹ (spezialisierte Zellen, die Symbionten enthalten, die Bakterien in B. tabaci weiter bilden). Darüber hinaus können diese Endosymbionten nicht in vitro kultiviert werden. Der einzige Weg, um Endosymbionten von B. tabaci zu erhalten, besteht darin, das Bakteriom zu sezieren. Allerdings gibt es Schwierigkeiten in der Sektion. Zuerst verbindet sich das zerbrechliche Bakteriom immer mit anderen Geweben der Whitefly, die schwer zu trennen ist. Zweitens begrenzt die winzige Größe der Whitefly die Isolierung von genügend Bakterien. Drittens gruppieren sich Endosymbionten im Bakteriom, was es äußerst kompliziert macht, eine einzige Bakterienart zu erwerben.

Hier berichten wir über ein einfaches und kostengünstiges Protokoll, um Whitefly Endosymbionten für die anschließende Metagenomsequenzierung zu isolieren. Durch Dissektion, Reinigung und Amplifikation konnte adäquate Endosymbiont-DNA erhalten und die Bakterienarten bestätigt werden. Das beschriebene Protokoll kann in anderen Arthropoden ähnlich verwendet werden.

Protokoll

1. Whitefly Aufzucht und kryptische Arten Identifizierung

1. Halten Sie die Whitefly- Spezies auf Baumwolle Gossypium Hirsutum (Malvaceae) (cv. Zhe-Mian 1973) in Käfigen unter Standardbedingungen von 27 ± 1 ° C, 70 ± 10% Feuchtigkeit und 14 h Licht: 10 h dunkles Regime.
2. Sammeln Sie einen einzelnen erwachsenen Weißfarbstoff und homogenisieren Sie in 30 μl Lysepuffer (10 mM Tris, pH 8,4, 50 mM KCl, 0,45% [wt / vol] Tween-20, 0,2% [wt / vol] Gelatine, 0,45% [vol / Vol] Nonidet P 40, 60 g / ml Proteinase K).
3. Inkubieren des Homogenats bei 65 ° C für 1 h und dann 100 ° C für 10 min.
   HINWEIS: Die Inkubationszeit bei 65 ° C kann bei Bedarf erhöht werden. Die Inkubationszeit bei 100 ° C sollte kritisch kontrolliert werden, um Proteinase K ausreichend zu inaktivieren und DNA-Schäden zu vermeiden.
4. Führen Sie die Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Whitefly-DNA (gewonnen in Abschnitt 1.3) auf der Basis von mitochondrialen Cytochromoxidase I-Primern durch.
   COI-F: 5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3 '
   COI-R: 5'-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3 '
   1. Führen Sie die PCR-Reaktionen in einem Endvolumen von 25 μl mit 1 U Taq- DNA-Polymerase, 2,5 μl 10x Puffer, 0,2 mM dNTP, 0,2 mM jedes Primers und 2 μl Whitefly-DNA durch.
   2. Verwenden Sie die folgenden PCR-Verfahrensbedingungen: anfängliche Denaturierung 95 ° C für 3 min, gefolgt von 35 Zyklen von 95 ° C für 45 s (Denaturierung), 50 ° C für 45 s (Glühen) und 72 ° C für 1 min (Verlängerung) und Weitere 10 min bei 72 ° C für weitere verlängerung
5. Reinigen Sie das PCR-amplifizierte Produkt mit einem DNA-Gel-Extraktionskit mit dem empfohlenen Protokoll.
6. Sequenzieren Sie die gereinigten DNA-Proben mit einem DNA-Proben-Sequenzierungssystem nach der Anweisungen des Herstellers.
7. Analysieren Sie die Sequenzen mit dem Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), um die kryptischen Arten von Whitefly zu identifizieren und eine Kontamination anderer Spezies zu vermeidenEs

2. Endosymbiont Identifizierung und Lokalisierung

1. Führen Sie die PCR auf der Whitefly-DNA aus (in Schritt 1.3 erworben), um die spezifischen Gene jedes Endosymbionts innerhalb des Whitefly zu amplifizieren (das PCR-Rezept ist in Abschnitt 1.4 beschrieben und PCR-Verfahren und Primer sind in Tabelle 1 aufgelistet).
2. Bezeichnen Sie die amplifizierte Probe einer Agarose-Gelelektrophorese gemäß dem zuvor veröffentlichten Protokoll ²⁰ (1% Agarosegel, Tris-Acetat-EDTA als Laufpuffer, Spannung 5 V / cm), um das spezifische Gen jedes Bakteriums zu identifizieren.
3. Wiederholen und Sequenz jedes Bandes, um die Bakterienarten innerhalb von whitefly zu bestimmen (siehe Abschnitte 1.5-1.7).
4. Führen Sie Fluoreszenz in situ Hybridisierungen (FISH) auf Whiteflies durch, um den Ort der Endosymbionten gemäß dem zuvor veröffentlichten Protokoll zu identifizieren.
   HINWEIS: Erhöhung der Konzentration der fluoreszierenden Sonden bei Bedarf.

3. Transmission Electron Microscopy (TEM)

1. In Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,0), enthaltend 2,5% [vol / vol] Glutaraldehyd, für 4 h einwischen und fixieren.
2. Waschen Sie die Proben in Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,0) dreimal, jeweils 15 min.
3. Tauchen Sie ein und fixieren Sie die Proben erneut in Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,0), enthaltend 1% [wt / vol] OsO ₄ für 2 h.
4. Dehydrieren Sie die Proben mit einer abgestuften Reihe von Ethanol (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% und 100%), jeweils 15 min.
5. Übertragen und die Proben 20 Minuten in 100% Aceton eintauchen.
6. Legen Sie die Proben in Mischung aus 100% Aceton und 100% Spurr Harz (1: 1) für 1 h bei Raumtemperatur.
7. Übertragen Sie die Proben 3 Minuten lang bei Raumtemperatur auf Mischung aus 100% Aceton und 100% Spurrharz (1: 3).
8. Übertragen und tauchen die Proben in 100% Spurr-Harz (inkubiert bei 70 ° C) für mehr als 9 h.
9. Sektion der Whitefly-Proben mit einem Mikromir.
10. Färben Sie die ultradünnen Filme (gewonnen in Abschnitt 3.9) durch Eintauchen in absolutes Uranylacetat für 5-10 min, gefolgt von Eintauchen in 50% iges alkalisches Bleibitrat für weitere 5-10 min.
    HINWEIS: Die in Abschnitt 3.1-3.10 genutzten Reagenzienmengen reichen von den Proben ab. Stellen Sie sicher, dass die Proben in die Reagenzien eingetaucht sind.
11. Beobachten Sie Proben unter Transmissionselektronenmikroskopie (15.000X), um die Lokalisierung, Form und Größe der Bakterien zur weiteren Verwendung zu bestimmen (siehe Abschnitt 4.6).

4. Whitefly Bakteriome Dissektion und Reinigung

1. 100 μl 1x PBS-Lösung auf einen Objektträger geben. Wählen Sie aus ^den Baumwollblättern die ^3. oder 4. Instanz-Nymphen und tauchen sie in die PBS-Lösung ein.
2. Verwenden Sie feine entomologische Nadeln unter einem Stereomikroskop und ziehen Sie die Bakterien aus dem Whitefly-Körper.
   1. Schon mal ein Loch auf die eine Seite der Nymphe schneiden und das andere leicht drückenSeite, um die Bakterien auszulassen.
3. Montieren Sie einen 20 μL Mikroloader (mit dem führenden Endschnitt, um die Größe des Bakterioms zu erfüllen) auf einer 0,5-10 μl Pipette. Extrahieren Sie das einzelne Bakteriom aus der PBS-Lösung in den Mikroloader.
4. Waschen Sie das Bakteriom, um die Kontamination von anderen Whitefly-Geweben zu eliminieren, indem Sie das Bakteriom in die PBS-Lösung pipettieren und das Bakteriom extrahieren. Wiederholen Sie dreimal.
5. Das gewaschene Bakteriom sofort in ein Zentrifugenröhrchen pipettieren, das 60 μl 1x PBS-Lösung enthält.
6. Spritzen Sie das zusammengesetzte Bakteriom durch eine 5 μm Filtermembran (bestimmt durch Größen von Bakterien und Kern von Bakteriocyten in Whitefly). Wiederholen Sie mehrmals, um die gemischte Flüssigkeit durch die Filtermembran gründlich zu bewegen.
   HINWEIS: Um ein besseres Ergebnis der Amplifikation und Sequenzierung zu erreichen, montieren Sie über 100 Bakterien. Netzen Sie die Filtermembran zuerst durch die Verwendung von 1x PBS-Lösung, um den Verlust von Bakterien zu verringernBindung an die Membran.

5. Verstärkung von Endosymbiont-Genomen

1. Verstärken Sie das Filtrat (hauptsächlich enthaltende Endosymbionten der Whitefly) mit einem DNA-Amplifikations-Kit durch das empfohlene Protokoll mit einigen Modifikationen.
   1. Wählen Sie das empfohlene Protokoll der Amplifikation von genomischer DNA aus Blut oder Zellen und bereiten Puffer D2 für nachfolgendes Experiment vor.
   2. Direkt zu 1,5 μl Filtrat (siehe Abschnitt 4.6) zum Zentrifugenröhrchen geben, gefolgt von 1,5 μl des Puffers D2 und gut vermischen.
   3. Inkubieren auf Eis für 10 min und füge 1,5 μl der Stopplösung hinzu.
   4. Fügen Sie 15 μl des Reaktionspuffers und 1 μl der DNA-Polymerase hinzu und mischen Sie vorsichtig.
   5. Inkubieren Sie die Mischung bei 30 ° C für 16 h, gefolgt von 3 min bei 65 ° C.
2. Führen Sie PCR direkt auf dem amplifizierten Filtrat aus (verdünnen Sie die amplifizierten Proben, falls erforderlich), indem Sie spezifische Primer verwenden, die für bac entworfen sindUm die Bakterienarten zu bestätigen (siehe Abschnitt 2.1).
3. Durchführen von PCR, um zu bestätigen, ob eine Kontamination des Wirtsgenoms durch die Verwendung von Whitefly-Gen- Beta- Actin- und EF1- Primern gemäß der zuvor veröffentlichten Methode ²¹ vorliegt (das PCR-Rezept ist in Abschnitt 1.4 beschrieben).

6. Endosymbiont Metagenome Sequenzierung

1. Das amplifizierte Filtrat einem Spektrophotometer und einem Fluorometer (gemäß den Anweisungen des Herstellers) vor der Sequenzierung zur Prüfung der Probenqualität und ob die Proben die Kriterien für die Sequenzierung erfüllen.
2. Betreff der Verstärker zu einem Genom-Sequenzer gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Ergebnisse

Im Nahen Osten Kleinasien 1 (MEAM1) Spezies des B. tabaci- Komplexes wurde als Beispiel für die Beschreibung genommen. Baumwolle für die Aufzucht von Weißfliegen und mehrere Entwicklungsstadien von Weißfliegen sind in Abbildung 1 gezeigt, darunter eine Baumwollpflanze, eine erwachsene Whitefly und die ^{1., 2.} und 4. Instar-Nymphe von Whitefly (die ^3. Instar-Nymphe sieht ähnlich wie die 4. Instar-Nymphe aus ). Es ...

Diskussion

Since the endosymbionts within whiteflies cannot be cultured in vitro, dissection and assembling bacteriocytes is an effective way to obtain enough genetic material of endosymbionts. Before dissection, the species of whitefly and endosymbionts involved should be explicitly confirmed. The whitefly B. tabaci is a species complex with more than 35 morphologically indistinguishable species and different cryptic species may contain different endosymbionts. Portiera is uniformly harbored as an obliga...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Taq DNA polymerase	Takara	R001A	including rTaq, 10×Buffer and dNTP
Gel DNA extraction kit	Qiagen	28704
DNA sample sequencing system	ABI	ABI-3730XL
Microtome	Leica	EM UC7
Transmission electron microscopy	Hitachi	H-7650 TEM
Stereo microscope	Zeiss	Stemi 2000-C
20 μL microloader	Eppendorf	F2771951
Filter holder	Millipore	SX0001300
Filter membrane filter	Millipore	SMWP001300	5.0 μm SMWP
REPLI-g UltraFast Mini Kit	Qiagen	150033	DNA amlification kit
NanoDrop	Thermo Scientific	NanoDrop 2000
Qubit Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33216
Genome Sequencer	Illumina	Hiseq 2000