Métodos para a extração de endossimbiontes da mosca branca<em&gt; Bemisia tabaci</em

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar os endossimbionetas da mosca branca Bemisia tabaci através da dissecção e filtração. Após a amplificação, as amostras de DNA são adequadas para posterior seqüenciamento e estudo do mutualismo entre endosimbiontes e mosca branca.

Resumo

Os simbiontes bacterianos formam um relacionamento íntimo com seus hospedeiros e conferem vantagens aos hospedeiros na maioria dos casos. A informação genômica é fundamental para estudar as funções e a evolução dos simbiontes bacterianos em seu hospedeiro. Como a maioria dos simbiontes não pode ser cultivada in vitro , os métodos para isolar uma quantidade adequada de bactérias para o sequenciamento do genoma são muito importantes. Na mosca branca Bemisia tabaci , vários endossimbionos foram identificados e se prevê que sejam importantes no desenvolvimento e reprodução das pragas através de abordagens múltiplas. No entanto, o mecanismo subjacente às associações permanece em grande parte desconhecido. O obstáculo vem parcialmente do fato de que os endossimbicetos na mosca branca, principalmente retidos em bacteriócitos, são difíceis de separar das células hospedeiras. Aqui relatamos um protocolo passo-a-passo para a identificação, extração e purificação de endosimbiontes da mosca branca B. tabaci principalmente por dissectiSobre e filtração. As amostras de endossimbiontes preparadas por este método, apesar de ainda ser uma mistura de diferentes espécies de endosimbiontes, são adequadas para sequenciação subseqüente do genoma e análise das possíveis funções dos endossimbiontes em B. tabaci . Este método também pode ser usado para isolar endosimbionetas de outros insetos.

Introdução

As bactérias que formam uma relação simbiótica íntima com hospedeiros relativos são generalizadas nos artrópodes ¹ . Os endossimbiontes demonstraram afetar aspectos de hospedeiros, como o metabolismo nutricional, a reprodução, as respostas aos estresses ambientais ^{2 , 3 , 4} , etc. , em quase todos os estádios de desenvolvimento ⁵ . No entanto, o mecanismo subjacente às associações ainda é bastante desconhecido. A genômica é de prioridade e importância ao estudar as potenciais funções e papéis das bactérias. Algumas informações fundamentais, ou seja , o status taxonômico, genes funcionais, caminhos do metabolismo, sistemas de secreção, podem ser inferidos a partir de seqüências do genoma, que lança luzes sobre os potenciais papéis dos simbiontes em simbiose. Com o desenvolvimento de seqüenciamento de alto rendimento, um grande número de genomas bacterianos foram sequenciados wCom diversas funções reveladas ⁶ .

Endosymbionts são de importância vital em hemipterans, como pulgões ⁷ , percevejos ⁸ , psyllids ⁹ , brownhoas ¹⁰ e cigarras ¹¹ . Por exemplo, Buchnera nos pulgões, como o simbionte obrigatório, demonstrou estar envolvido na biossíntese de aminoácidos essenciais, juntamente com os genes do genoma do pulgão ¹² . Além disso, a regulação transcricional da Buchnera também é revelada ¹³ . Em psílidos , Carsonella é sequenciada e classificada como o menor genoma bacteriano já encontrado ¹⁴ . Todas essas características dos endossimbiontes são baseadas e inferidas a partir das sequências do genoma. Como esses endosimbiontes não podem ser cultivados in vitro , várias abordagens foram aplicadas para isolar bactérias adequadas para seqUencing. Nos pulmões, os endossimbiontes são extraídos através de centrifugação e filtração e submetidos a análises genômicas e transcriptômicas adicionais ⁵ . Em planthoppers marrons, os endossimbionetas são sequenciados juntamente com todo o genoma do inseto ¹⁰ .

Whitefly B. tabaci é um complexo de espécies contendo mais de 35 espécies morfologicamente indistinguíveis (espécies crípticas), entre as quais duas espécies invasivas invadiram todo o mundo e causaram enormes danos à produção agrícola ¹⁵ . De notar, os endossimbictos dentro das espécies de B. tabaci mostraram importância no desenvolvimento das pragas ¹⁶ . Até à data, oito endossimbiontes foram identificados na mosca branca, incluindo o simbionte obrigatório, Candidatus Portiera aleyrodidarum e sete simbiontes secundários Hamiltonella , Rickettsia , Arsenophonus , Cardinium , Wolbachia, Fritschea e Hemipteriphilus definiram ^{17 , 18} .

Ao contrário dos hemipteranos descritos anteriormente, a mosca branca B. tabaci é um inseto extremamente pequeno com apenas 1 mm de comprimento. A maioria dos endossimbiontes é confinada aos bacteriócitos ¹⁹ (células especializadas que contêm simbiontes, que ainda formam bacteriomo em B. tabaci ). Além disso, estes endosimbiontes não podem ser cultivados in vitro . A única maneira de obter endosimbiontes de B. tabaci é dissecar a bactéria. No entanto, há dificuldade na dissecação. Primeiro, a bactéria frágil sempre se liga a outros tecidos da mosca branca, o que é difícil de separar. Em segundo lugar, o pequeno tamanho da mosca branca limita o isolamento de bacteriomo suficiente. Em terceiro lugar, os endossimbiontes se agrupam na bactéria, tornando extremamente complicado adquirir uma única espécie de bactéria.

Aqui, relatamos um protocolo simples e barato para isolar endosimbilotes de mosca branca para sequenciação subseqüente de metagenome. Através da dissecção, purificação e amplificação, pode ser obtido ADN endosimbionado adequado e as espécies de bactérias podem ser confirmadas. O protocolo descrito pode ser usado de forma semelhante em outros artrópodes.

Protocolo

1. Criação de mosca branca e identificação de espécies criptípicas

1. Manter as espécies de moscas brancas em algodão Gossypium hirsutum (Malvaceae) (cv. Zhe-Mian 1973) em gaiolas sob condições padrão de 27 ± 1 ° C, 70 ± 10% de umidade e 14 h de luz: 10 h de regime escuro.
2. Recolher uma mosca branca branca individual e homogeneizar em 30 μL de tampão de lise (Tris 10 mM, pH 8,4, KCl 50 mM, 0,45% [wt / vol] Tween-20, 0,2% [wt / vol] de gelatina, 0,45% [vol / Vol] Nonidet P 40, 60 g / mL Proteinase K).
3. Incubar o homogeneizado a 65 ° C durante 1 h e depois 100 ° C durante 10 min.
   NOTA: O tempo de incubação a 65 ° C pode ser aumentado, se necessário. O tempo de incubação a 100 ° C deve ser controlado criticamente para inativar suficientemente a Proteinase K e evitar danos no DNA.
4. Realize a reação em cadeia da polimerase (PCR) usando DNA de mosca branca (adquirido na seção 1.3) com base nos iniciadores mitocondriais de citocromo oxidase I.
   COI-F: 5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3 '
   COI-R: 5'-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3 '
   1. Realize as reações de PCR em um volume final de 25 μL contendo 1 U de polimerase de ADN Taq , 2,5 μL de tampão 10x, dNTP 0,2 mM, 0,2 mM de cada iniciador e 2 μL de DNA de mosca branca.
   2. Utilize as seguintes condições de procedimento de PCR: desnaturação inicial 95 ° C durante 3 minutos seguido de 35 ciclos de 95 ° C durante 45 s (desnaturação), 50 ° C durante 45 s (recozimento) e 72 ° C durante 1 min (extensão) e Outros 10 min a 72 ° C para maior extensão.
5. Limpe o produto amplificado por PCR usando um kit de extração de gel de DNA com o protocolo recomendado.
6. Seqüência de amostras de DNA purificado com um sistema de seqüenciamento de amostras de DNA seguindo as instruções do fabricante.
7. Analise as seqüências usando a Ferramenta de Pesquisa de Alinhamento Local Básico (BLAST) para identificar as espécies crípticas da mosca branca e evitar a contaminação de outras espéciesEs.

2. Endosymbiont Identificação e localização

1. Execute PCR no DNA da mosca branca (adquirida no Passo 1.3) para amplificar os genes específicos de cada endosimbionto dentro da mosca branca (a receita de PCR é descrita na seção 1.4, e os procedimentos de PCR e primers estão listados na Tabela 1 ).
2. Sujeita a amostra amplificada em eletroforese em gel de agarose de acordo com o protocolo ²⁰ previamente publicado (1% de gel de agarose, Tris-acetato-EDTA como tampão de corrida, tensão 5 V / cm) para identificar o gene específico de cada bactéria.
3. Recupere e sequencie cada banda para determinar as espécies bacterianas dentro da mosca branca (ver seções 1.5-1.7).
4. Execute hibridizações in situ de fluorescência (FISH) em moscas brancas para identificar a localização dos endossimbionetas de acordo com o protocolo ¹⁹ previamente publicado.
   NOTA: Aumente a concentração das sondas fluorescentes se necessário.

3. Microscopia eletrônica de transmissão (TEM)

1. Mergulhe e corrija as moscas brancas em tampão fosfato (0,1 M, pH 7,0) contendo 2,5% [vol / vol] glutaraldeído durante 4 h.
2. Lavar as amostras em tampão de fosfato (0,1 M, pH 7,0) três vezes, 15 min cada vez.
3. Mergulhe e repare novamente as amostras em tampão fosfato (0,1 M, pH 7,0) contendo 1% [wt / vol] OsO ₄ durante 2 h.
4. Desidratar as amostras por uma série de etanol graduada (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% e 100%), 15 min a cada vez.
5. Transfira e mergulhe as amostras em 100% de acetona por 20 min.
6. Coloque as amostras em mistura de 100% de acetona e 100% de resina Spurr (1: 1) durante 1 h à temperatura ambiente.
7. Transfira as amostras para a mistura de 100% de acetona e 100% de resina Spurr (1: 3) durante 3 h à temperatura ambiente.
8. Transfira e mergulhe as amostras em 100% de resina Spurr (incubada a 70 ° C) por mais de 9 h.
9. Corte as amostras de moscas brancas usando um micropara mim.
10. Mancha os filmes ultra finos (adquiridos na seção 3.9) por imersão em acetato de uranilo absoluto durante 5-10 min, seguido de imersão em citrato de chumbo alcalino a 50% por mais 5-10 min.
    NOTA: Os volumes de reagentes utilizados na seção 3.1-3.10 dependem das amostras. Verifique se as amostras estão imersas nos reagentes.
11. Observe amostras sob microscopia eletrônica de transmissão (15,000 X) para determinar a localização, a forma e o tamanho das bactérias para uso posterior (ver seção 4.6).

4. Dissecção e Purificação de Bacterioma da Baleia Branca

1. Adicione 100 μL de 1x solução de PBS em uma lâmina de microscópio. Escolha algumas ninfas do ^3º ou ^4º instar das folhas de algodão e mergulhe na solução de PBS.
2. Use agulhas entomológicas finas sob um estereomicroscópio e puxe as bacteriomas para fora do corpo da mosca branca.
   1. Corte suavemente um buraco de um lado da ninfa e pressione levemente o outroLado para deixar as bacteriomas sair.
3. Monte um microcarregador de 20 μL (com o corte de extremidade dianteiro para atingir o tamanho da bactéria) em uma pipeta de 0,5-10 μL. Extraia o bacteriomo individual da solução PBS para o microcarregador.
4. Lave o bacteriomo para eliminar a contaminação de outros tecidos de mosca branca por pipetagem da bacterioma na solução de PBS e extração do bacteriomo. Repita três vezes.
5. Em seguida, pipetar a bacterioma lavada em um tubo de centrífuga contendo 60 μL de 1x solução de PBS.
6. Filtro de seringa da bacterioma montada através de uma membrana filtrante de 5 μm (determinada por tamanhos de bactérias e núcleo de bacteriócitos na mosca branca). Repita várias vezes para mover o líquido misto através da membrana do filtro completamente.
   NOTA: Para obter um melhor resultado de amplificação e seqüenciamento, montar mais de 100 bacteriomas. Molhe a membrana do filtro primeiro usando 1x solução de PBS para diminuir a perda de bactériasLigação à membrana.

5. Amplificação de Genomas de Endosimbionto

1. Amplifique o filtrado (contendo principalmente endosimbiontes da mosca branca) usando um kit de amplificação de DNA pelo protocolo recomendado com alguma modificação.
   1. Escolha o protocolo recomendado de amplificação de DNA genômico de sangue ou células e prepare o tampão D2 para experiência subseqüente.
   2. Adicione diretamente 1,5 μL de filtrado (ver seção 4.6) ao tubo de centrífuga, seguido de 1,5 μL do tampão D2 e ​​misture bem.
   3. Incubar em gelo durante 10 min e adicionar 1,5 μL da solução de parada.
   4. Adicione 15 μL do tampão de reação e 1 μL da DNA polimerase e misture suavemente.
   5. Incubar a mistura a 30 ° C durante 16 h, seguido de 3 min a 65 ° C.
2. Execute o PCR diretamente no filtrado amplificado (diluir as amostras amplificadas, se necessário) usando iniciadores específicos projetados para bacPara confirmar as espécies de bactérias (ver seção 2.1).
3. Conduza a PCR para confirmar se há contaminação do genoma do hospedeiro usando o beta-Actin e os primers EF1 do vírus da mosca branca de acordo com o método ²¹ previamente publicado (a receita de PCR é descrita na seção 1.4).

6. Seqüenciamento de Metagenome de Endosymbiont

1. Sujeite o filtrado amplificado para um espectrofotômetro e um fluorômetro (de acordo com as instruções do fabricante) antes do seqüenciamento para testar a qualidade das amostras e se as amostras atendem aos critérios de seqüenciamento.
2. Assine o amplificador para um seqüenciador de genoma de acordo com as instruções do fabricante.

Resultados

As espécies do Médio Oriente Ásia Menor 1 (MEAM1) do complexo B. tabaci foram tomadas como exemplo aqui para descrição. O algodão para a criação de moscas brancas e vários estádios de desenvolvimento de moscas brancas são mostrados na Figura 1, incluindo uma planta de algodão, mosca branca adulta e as ninfas ^{1ª, 2ª} e ^4ª instar da mosca branca (a ninfa do ^3º instar parece similar à ninfa do...

Discussão

Since the endosymbionts within whiteflies cannot be cultured in vitro, dissection and assembling bacteriocytes is an effective way to obtain enough genetic material of endosymbionts. Before dissection, the species of whitefly and endosymbionts involved should be explicitly confirmed. The whitefly B. tabaci is a species complex with more than 35 morphologically indistinguishable species and different cryptic species may contain different endosymbionts. Portiera is uniformly harbored as an obliga...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Taq DNA polymerase	Takara	R001A	including rTaq, 10×Buffer and dNTP
Gel DNA extraction kit	Qiagen	28704
DNA sample sequencing system	ABI	ABI-3730XL
Microtome	Leica	EM UC7
Transmission electron microscopy	Hitachi	H-7650 TEM
Stereo microscope	Zeiss	Stemi 2000-C
20 μL microloader	Eppendorf	F2771951
Filter holder	Millipore	SX0001300
Filter membrane filter	Millipore	SMWP001300	5.0 μm SMWP
REPLI-g UltraFast Mini Kit	Qiagen	150033	DNA amlification kit
NanoDrop	Thermo Scientific	NanoDrop 2000
Qubit Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33216
Genome Sequencer	Illumina	Hiseq 2000