JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن تصف الكروماتين الانقسام الذاتية إلى جانب تسلسل عالية الإنتاجية (تشيك-سيق)، المناعية لونين (رقاقة) طريقة متعامدة لرسم الخرائط مواقع ملزمة البروتين الجينوم على نطاق واسع مع نوكليس نوكوكلياز (منيس) البروتينات الانصهار.

Abstract

رسم الخرائط على نطاق الجينوم من التفاعلات البروتين الحمض النووي أمر بالغ الأهمية لفهم التنظيم الجيني، وإعادة عرض لونين، وغيرها من العمليات المقيمين الكروماتين. الفورمالديهايد يشابك تليها لونين مناعي وارتفاع الإنتاجية الإنتاجية (X-تشيب-سيق) وقد استخدمت لكسب العديد من الأفكار القيمة في علم الأحياء الجينوم. ومع ذلك، X-تشيب-سيق لديه قيود مرتبطة مرتبطة كروسلينكينغ وسونيكاتيون. رقاقة الأصلي تجنب هذه العيوب عن طريق حذف تشابك، ولكن غالبا ما يؤدي إلى الانتعاش الفقراء من البروتينات المرتبطة الكروماتين. وبالإضافة إلى ذلك، فإن جميع الطرق القائمة على رقاقة تخضع لاعتبارات الجودة الأجسام المضادة. وقد استخدمت أيضا أساليب الأنزيمية لرسم خرائط التفاعلات الحمض النووي للبروتين، والتي تنطوي على الانصهار من البروتين من الاهتمام لانزيم تعديل الحمض النووي، لتعيين التفاعلات البروتين الحمض النووي. نحن في الآونة الأخيرة مجتمعة واحدة من هذه الطريقة، لونين الانقسام الذاتية (تشيك)، مع تسلسل الإنتاجية العالية كما تشيك-سيق. تشيك-سيق يعتمد على الانصهار من الكروماتين- أسوكالبروتين إاتد من الفائدة إلى نوكلياز ميكروكوكال (منيس) لتوليد استهداف الحمض النووي الانقسام في وجود الكالسيوم في الخلايا الحية. تشيك-سيق لا يقوم على إمونوبريسيانتاتيون وبالتالي التحايل على المخاوف المحتملة مع يشابك، صوتنة، لونين سولوبيليزاتيون، وجودة الأجسام المضادة مع توفير عالية الدقة رسم الخرائط مع الحد الأدنى من إشارة الخلفية. ونحن نتصور أن تشيك-سيق سوف تكون نظير قوي ل تشيب، وتوفير وسيلة مستقلة من أجل التحقق من صحة النتائج تشيب-سيق، واكتشاف رؤى جديدة في التنظيم الجيني.

Introduction

رسم الخرائط مواقع ملزمة من عوامل النسخ (تفس)، إعادة تشكيل الكروماتين، والعوامل التنظيمية الأخرى المرتبطة بالكروماتين هو المفتاح لفهم جميع العمليات القائمة على الكروماتين. في حين استخدمت المناعية لونين وارتفاع تسلسل الإنتاجية (تشيب-سيق) نهج لكسب العديد من الأفكار الهامة في علم الأحياء الجينوم، لديهم قيود ملحوظة. لقد أدخلنا مؤخرا طريقة بديلة، يطلق عليها الانقسام الداخلي لونين والإنتاجية العالية تسلسل (تشيك-سيق) 1 ، للتحايل على هذه السلبيات.

وغالبا ما يتم تنفيذ تشيب-سيق مع خطوة الفورمالديهايد الأولي يشابك (X- رقاقة-سيق) للحفاظ على التفاعلات البروتين الحمض النووي. ومع ذلك، فقد أشار عدد من الدراسات الحديثة أن X-تشيب-سيق يلتقط التفاعلات البروتين الحمض النووي عابرة أو غير محددة 2 ، 3 ، 4 ، 5 <سوب>، 6 ، 7 ، 8 ، مما يؤدي إلى مواقع ملزمة إيجابية كاذبة. وبالإضافة إلى ذلك، سونيكاتيون، وتستخدم عادة لتفريق لونين في التجارب X- تشيب-سيق، مناطق المقصات تفضيلي من لونين مفتوح، مما يؤدي إلى الانتعاش منحازة شظايا من هذه المناطق 9 ، 10 . سونيكاتيون ينتج أيضا خليط غير متجانسة من أطوال الشظايا، مما يحد في نهاية المطاف قرار الموقع ملزمة، على الرغم من أن إضافة خطوة الهضم نوكلياز يمكن أن تحسن كثيرا القرار 11 ، 12 . طرق رقاقة المحلية مثل المناطق المحتلة من الجينوم من تقارب تنقيته لونين معزولة طبيعيا (أورغانيك) 13 لا تستخدم كروسلينكينغ وشظية لونين مع نوكلياز ميكروكوكال (منيس)، والتخفيف من التحيزات المحتملة المرتبطة التشابك الفورمالديهايد وسونيكاتيون. ومع ذلك،فإن ذوبانية العديد من البروتينات المرتبطة بالكروماتين في ظل ظروف خفيفة نسبيا المطلوبة لاستخراج الكروماتين الأصلي ضعيف، مما قد يؤدي إلى انخفاض النطاق الديناميكي و / أو السلبيات الكاذبة 14 .

في حين أن التكرارات المختلفة من تشيب سيق، هي الأكثر شيوعا لرسم الخرائط على نطاق الجينوم من التفاعلات الحمض النووي للبروتين، كما تم تنفيذ عدة تقنيات رسم الخرائط على أساس انصهار البروتينات التي تهم مختلف الأنزيمات تعديل الحمض النووي. واحد من هذه النهج هو دنا أدينين ميثيل ترانسفيراس تحديد (داميد) 15 ، حيث يتم دمج البروتين ملزم من الكروماتين من الفائدة إلى وراثيا ويتم التعبير عن هذا الانصهار في الخلايا أو الحيوانات، مما أدى إلى مثيلة من تسلسل غاتس القريبة لمواقع ملزمة للبروتين. داميد مفيد في أنه لا يعتمد على مناعي وهكذا يتجنب التشابك، الأجسام المضادة، أو لونين الانحلال. كما يتم تنفيذها في الجسم الحي . ومع ذلك، يقتصر قرار داميد على مقياس الكيلوباس ونشاط الميثيلات من بروتين الدم الانصهار هو كونستيتوتيف. وهناك طريقة ثانية تقوم على الانزيم الانزيمية هي استدعاء بطاقة- 16 ، الذي يوظف الانصهار من عامل من الفائدة إلى ترانسبوزاز، توجيه التكامل موقع معين من ترانسبوسونس. مثل داميد، استدعاء بطاقة المتابعة لا يستند إلى إمونوبريسيانتاتيون وبالتالي لديها مزايا مماثلة، مع فائدة إضافية من زيادة القرار. ومع ذلك، قد تقيد بطاقة الاتصال المتابعة بالتسلسل التحيز من ينتقل ويعتمد أيضا على وجود مواقع تقييد قريبة من مواقع الإدراج ترانزوسون.

وهناك طريقة الانزيمية الثالثة الانصهار، وضعت في مختبر لامللي، هو لونين الانقسام الذاتية (تشيك) 17 . في تشيك، يتم التعبير عن الانصهار بين البروتين المرتبط بالكروماتين و منيس في الخلايا، وعلى إضافة الكالسيوم لتنشيط منيس، يتم تشريح الحمض النووي الأقرب إلى مواقع ملزمة للموسومةعامل ( الشكل 1 ). جنبا إلى جنب مع النشاف الجنوبية، وقد استخدمت تشيك لتوصيف هيكل الكروماتين والبروتين ملزمة في عدد من لوكسي الفردية في الخميرة 17 ، 18 ، وتم دمجها مع تحليل ميكروأري منخفضة الدقة للتحقيق في التفاعل من مكونات المسام النووية مع الخميرة الجينوم 19 . تشيك يقدم فوائد مماثلة ل داميد و بطاقة دعوة المتابعة، وقرارها هو تقريبا زوج واحد قاعدة عند تحليل التمديد التمهيدي 19 . تشيك هو أيضا يمكن السيطرة عليها: الانقسام الحمض النووي قوي مناس يعتمد على إضافة مليمولار الكالسيوم، وضمان أن منيس غير نشط في تركيزات منخفضة الكالسيوم الحرة لوحظ في خلايا الخميرة الحية 20 .

في السابق، افترضنا أن الجمع بين تشيك مع تسلسل الإنتاجية العالية (تشيك-سيق) من شأنه أن يوفر خرائط عالية الدقة من مواقع الربط تف. في الواقع، تشيك-sq ولدت خرائط عالية الدقة من الخميرة الناشئة العوامل التنظيمية العامة (غرفس) Abf1، Rap1، و Reb1 عبر الجينوم 1 . وقد نجحنا أيضا في تطبيق تشيك-سيق على مجمع الوسطاء المعياري، وهو عامل حفظي عالمي أساسي محفظ 21 ، وتوسيع نطاق تطبيق تشيك-سيق إلى مجمعات الحجم ميغادالتون التي لا تتصل مباشرة دنا وقد يكون من الصعب رسم بواسطة رقاقة- . تشيك-سيق هو وسيلة قوية على حد سواء للتحقق من صحة مستقلة النتائج تشيب-سيق وتوليد رؤى جديدة في تنظيم العمليات المقيمين الكروماتين. هنا، نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لتنفيذ هذه الطريقة في مهدها الخميرة.

Protocol

1. جيل من سلالات الخميرة

  1. توليد سلالة الخميرة التي تحمل عامل الفائدة الموسومة مع منيس.
    1. ير تضخيم كاسيت منيس علامات من ناقلات المطلوب ( الجدول 1 ) باستخدام خليط التفاعل المحدد ( الجدول 2 ) وظروف الدراجات ( الجدول 3 ). مزيج 5 ميكرولتر من تفاعل ير و 1 ميكرولتر من 6X دنا تحميل الصبغة. تشغيل كل قسامة ير على هلام الاغاروز 0.8٪ في 120 V لمدة 40 دقيقة. حجم المنتج المتوقع هو ~ 2.3 كيلوبايت.
    2. تحويل كاسيت العلامات تضخيم في سلالة من الاختيار باستخدام معيار تحويل خلات الليثيوم 22 وأداء التحديد.
    3. تحقق من التكامل الصحيح من شريط العلامات مع مستعمرة ير.
      1. إعداد خليط التفاعل المحدد ( الجدول 4 ) لعدد من المستعمرات ليتم فحصها. الحفاظ على الجليد حتى الحاجة.
      2. اختيار جزء من كل مستعمرة ليكون تيستيد في الجزء السفلي من أنبوب ير باستخدام مسواك معقمة أو طرف الماصة.
      3. الميكروويف المستعمرات التقطت في قوة عالية لمدة 1 دقيقة.
      4. إضافة 50 ميكرولتر من مزيج ير ( الجدول 4 ) إلى كل مستعمرة ميكروافيد والماصة صعودا وهبوطا لخلط. أداء ير باستخدام ظروف الدراجات المحددة ( الجدول 5 ).
      5. مزيج 50 ميكرولتر من تفاعل ير و 10 ميكرولتر من 6X دنا تحميل الصبغة مباشرة في كل أنبوب ير. تشغيل 10 ميكرولتر من كل عينة على هلام الاغاروز 1٪ في 120 V لمدة 40 دقيقة. حجم المنتج المتوقع هو ~ 700 نقطة أساس.
        ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، تحقق من التعبير المناسب للبروتين الانصهار منيس عبر النشاف الغربية. A ~ 20.6 كيلودالتون التحول في الوزن الجزيئي للبروتين الموسومة ومن المتوقع.
  2. توليد سلالة منيس خالية من الاستنساخ القائم على التماثل من المروج من الجينات من الفائدة في pGZ136 (الجدول 1) والتحول والاختيار كما هو الحال في الخطوة 1.1.2.
    1. Alternatiفيلي، تجميع المروج من الجينات في المصالح و 3xFLAG-مناس-SV40 نلس في ناقلات البلازميد، وتحويل وحدد كما هو الحال في الخطوة 1.1.2، وتنمو سلالة في حالة انتقائية المناسبة لصيانة البلازميد.

2. تشيك

  1. في فترة ما بعد الظهر / مساء اليوم السابق لتجربة تشيك، تطعيم 3 مل الخميرة الببتون-سكر العنب (يبد) أو المتوسطة الانتقائية المناسبة مع مستعمرة واحدة من سلالة تحمل عامل منيس الموسومة. احتضان هذه الثقافة بين عشية وضحاها (180 دورة في الدقيقة الهز، 30 درجة مئوية).
  2. في صباح اليوم من تجربة تشيك، تمييع الثقافة بين عشية وضحاها في 50 مل من المتوسطة إلى الكثافة البصرية في 600 نانومتر (أود 600 ) من 0.2 - 0.3. احتضان هذه الثقافة (180 دورة في الدقيقة الهز، 30 درجة مئوية) حتى تصل إلى أود 600 من 0.5-0.7. كما تقترب الثقافة أود 600 المناسبة ، تعيين كتلة الحرارة أو حمام الماء إلى 30 درجة مئوية والبدء في ذوبان الجليد العازلة المواد المضافة ( تابلي 6).
  3. إعداد 5 مل من العازلة بالإضافة إلى الإضافات ( الجدول 6 ) لكل ثقافة. إبقاء العازلة A في رت أثناء الإجراء.
  4. إعداد أنابيب ميكروفوج تحتوي على 90 ميكرولتر من حل وقف ( الجدول 7 ) و 10 ميكرولتر من 10٪ سدز لكل نقطة زمنية ليتم جمعها. لكل عامل جديد تحليلها، واتخاذ عينات في 0 ق، 30 ثانية، 1 دقيقة، 2.5 دقيقة، 5 دقائق، و 10 دقيقة.
  5. ثقافة الصب في أنبوب مخروطي 50 مل وطرد مركزي في 1500 x ج ودرجة حرارة الغرفة (رت) لمدة 1 دقيقة.
  6. ريسوسبيند تماما الخلايا في 1 مل من العازلة A ونقل الخلايا معلق إلى أنبوب ميكروفوج. بيليه معلق الخلايا في ميكروفوج في 1500 x ج و رت لمدة 30 ثانية.
  7. نضح طاف وخلايا ريسوسبيند بدقة في 1 مل من العازلة من قبل بيبتينغ صعودا وهبوطا. بيليه معلق الخلايا في ميكروفوج في 1500 x ج و رت لمدة 30 ثانية. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
  8. الخلايا ريسوسبيند تماما في 570 ميكرولتر من العازلة A. إضافة 30 ميكرولتر من 2٪ ديجيتونين(0.1٪ تركيز النهائي) لتسهيل بيرمابيليزاتيون من الخلايا، وعكس للخلط.
  9. بيرمابيليز الخلايا في كتلة الحرارة أو حمام الماء في 30 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  10. الماصة رد فعل صعودا وهبوطا لضمان توزيع حتى من الخلايا. إزالة قسامة 100 ميكرولتر من الخلايا بيرمابيليزد كسيطرة سلبية إلى أنبوب ميكروفوج تحتوي على حل وقف و سدز (الخطوة 2.4) ودوامة لفترة وجيزة لخلط.
  11. إضافة 1.1 ميكرولتر من 1 M كاكل 2 (2 تركيز النهائي ملي) لخلايا بيرمابيليزد لتنشيط منيس وعكس عدة مرات بسرعة أو دوامة لفترة وجيزة لخلط. على الفور العودة رد فعل مختلطة في 30 درجة مئوية وبدء جهاز توقيت.
  12. في كل نقطة زمنية ليتم جمعها، ماصة رد فعل صعودا وهبوطا لضمان توزيع حتى من الخلايا، ثم إزالة قسامة 100 ميكرولتر من الخلايا بيرمابيليزد إلى أنبوب ميكروفوج تحتوي على حل وقف و سدز ودوامة لفترة وجيزة لخلط. لكل عامل جديد تحليلها، واتخاذ 0 ق (لا كاكل 2 المضافة)، 30 ثانية، 1 دقيقة، 2.5 دقيقة، 5 دقائق، و 10 دقيقة نقاط الوقت.
    ملاحظة: تشيك التجارب مع العوامل التي يلتصق بسرعة الحمض النووي في 30 درجة مئوية يمكن أن يؤديها في درجات حرارة منخفضة لإبطاء حركية الانقسام منيس.
  13. مرة واحدة وقد تم جمع كل نقاط الوقت، إضافة 4 ميكرولتر من 20 ملغ / مل بروتينز K لكل عينة، دوامة لفترة وجيزة لخلط، واحتضان عند 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  14. إضافة 200 ميكرولتر من 25: 24: 1 الفينول: الكلوروفورم: الكحول الإيزواميلي إلى كل عينة، دوامة بقوة لخلط، وأجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة و رت في ميكروفوج لمدة 5 دقائق.
  15. إزالة كل مرحلة مائي (~ 150 ميكرولتر) إلى أنبوب جديد. إضافة 30 ميكروغرام من الجليكوجين و 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪. دوامة بقوة لخلط وترسب على الجليد الجاف لمدة 10 دقيقة أو حتى حل لزج.
  16. بيليه عجلت الحمض النووي في أقصى سرعة و 4 درجات مئوية في ميكروفوج لمدة 10 دقيقة.
  17. صب سوبرناتانتس وغسل الكريات مع 1 مل من رت 70٪ من الإيثانول.
  18. صب الإيثانول، وإزالة المتبقية عن طريق عكسد التنصت بلطف الأنابيب على منشفة ورقية. تدور لفترة وجيزة عينات باستخدام الطرد المركزي بينشتوب واستخدام ماصة لإزالة الإيثانول المتبقية، مع الحرص على عدم إزعاج بيليه. الهواء الجاف الكريات ل رت لمدة 5 دقائق.
  19. بينما الكريات تجفيف، وجعل مزيج الرئيسي ل ريسوسبيند الكريات المجففة في 29 ميكرولتر من تريس، ودرجة الحموضة 8.0 + 1 ميكرولتر من 10 ملغ / مل ريبونوكلياز كل منهما. هضم الحمض النووي الريبي عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  20. مزيج 1 ميكرولتر من 6X دنا تحميل الصبغة مع 5 ميكرولتر من كل عينة وتشغيلها على هلام الاغاروز 1.5٪ في 120 V لمدة 40 دقيقة.

3. حجم التحديد

ملاحظة: الهدف من اختيار الحجم هو إزالة شظايا متعددة كيلوباس من الحمض النووي الجيني من العينة لتكون تسلسل وإثراء شظايا من ~ 150 نقطة أساس (تقريبا حجم الحمض النووي نوكليوسومال) أو أصغر. في تسلسل البيانات، شظايا <400 بي بي هي المخصب، مع ذروة ملحوظة حول حجم الحمض النووي النيوكليوسومات (~ 150 نقطة أساس) وتوزيع ذروة أو واسعة من شظايا تحت نوكليوسومال.

<رأ>
  • لكل عينة، إضافة 75 ميكرولتر من الصلبة المرحلة عكسها الشلل (سبري) الخرز في البولي ايثيلين غليكول (بيج) حل 23 والماصة صعودا وهبوطا 10 مرات لخلط. احتضان حبة: خليط الحمض النووي في رت لمدة 5 دقائق.
  • خلال الحضانة حبة سبري، وإعداد أنابيب ميكروفوج تحتوي على 96 ميكرولتر من 10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.0 و 4 ميكرولتر من 5 M كلوريد الصوديوم لكل عينة.
  • وضع أنابيب في رف المغناطيسي لجمع الخرز على جانب الأنبوب. السماح للخرز لجمع على جانب الأنبوب لمدة 2 دقيقة.
  • نقل كل طاف إلى أنبوب جديد يحتوي على تريس و كلوريد الصوديوم (الخطوة 3.2).
  • إضافة 200 ميكرولتر من 25: 24: 1 الفينول: الكلوروفورم: الكحول الإيزواميلي إلى كل عينة، دوامة لخلط، وأجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة و رت في ميكروفوج لمدة 5 دقائق.
  • إزالة كل مرحلة مائي إلى أنبوب جديد. إضافة 30 ميكروغرام من الجليكوجين و 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪. يعجل الحمض النووي على الجليد الجاف لمدة 10 دقيقة أو حتى حل لزج.
  • بيليه بريسيالحمض النووي بيتاتد في أقصى سرعة و 4 درجات مئوية في ميكروفوج لمدة 10 دقيقة.
  • سوبيرناتانتس صب وغسل الكريات مع 1 مل من الايثانول 70٪.
  • صب الإيثانول، وإزالة المتبقية عن طريق عكس وبلطف التنصت الأنابيب على منشفة ورقية. تدور لفترة وجيزة عينات باستخدام الطرد المركزي بينشتوب واستخدام ماصة لإزالة الإيثانول المتبقية، مع الحرص على عدم إزعاج بيليه. الهواء الجاف الكريات ل رت لمدة 5 دقائق.
  • ريسوسبيند الكريات المجففة في 25 ميكرولتر من تريس، ودرجة الحموضة 8.0. تحديد تركيز العينة باستخدام فحص حساسية عالية. للتجارب تف تشيك، يتم استرداد 10-100 نانوغرام الحمض النووي بشكل روتيني بعد اختيار الحجم.
  • إعداد مكتبات التسلسل. بروتوكولات إعداد المكتبة التي لا تعتمد على اختيار الحجم، كما هو موضح سابقا 24 ، من المرغوب فيه للسماح تسلسل مجموعة كبيرة من أحجام الشظايا (25-500 بي بي).
  • مكتبات التسلسل في وضع نهاية مقترنة. وهناك حاجة إلى 25 قاعدة على الأقل من تسلسل على كل نهاية لقراءة عالية الجودةرسم الخرائط. ما بين 1 و 2 مليون يقرأ يوفر تغطية كافية لعينة تشيك.
    ملاحظة: تحليل بيانات تشيك-سيق هو إجراء معقد وخارج نطاق هذه المقالة. ويمكن الاطلاع على معلومات مفصلة عن تحليل البيانات في المنشورات السابقة 1 ، 21 ، والنصوص المخصصة المستخدمة للتحليل متاحة على جيثب (https://github.com/zentnerlab/chec-seq). هومر 25 (http://homer.salk.edu) يمكن أن تستخدم أيضا لتحليل سطر الأوامر للبيانات تشيك-سيق.

    • النتائج

    في حالة تجربة تشيك ناجحة، وتحليل الحمض النووي من قبل الاغاروز هلام الكهربائي تكشف عن زيادة تعتمد على الكالسيوم في تجزئة الحمض النووي على مدى الوقت، كما هو مبين من قبل تلطيخ والهضم النهائي النهائي من الحمض النووي الجيني. في بعض الحالات، لوحظ سلم ?...

    Discussion

    لقد أظهرنا أن تشيك يمكن تعيين فئات متنوعة من البروتينات الخميرة على الكروماتين، وتوقع أنه سيتم تطبيقها على نطاق واسع على عائلات مختلفة من صناديق الاستئناف وغيرها من العوامل ملزم الكروماتين في الخميرة. تشيك-سيق هو مفيد في أنه لا يتطلب كروسلينكينغ، لونين سولوبيليزات?...

    Disclosures

    الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

    Acknowledgements

    نشكر مصطفى صالح وجاي توريغني على قراءة نقدية للمخطوطة وستيفن هان وستيفن هينيكوف للحصول على الإرشاد والدعم خلال تطوير تشيك-سيق وتطبيقه على مجمع الوسيط. ويدعم سغ من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01GM053451 و R01GM075114 و جيز هو معتمد من قبل صناديق بدء تشغيل جامعة إنديانا.

    Materials

    NameCompanyCatalog NumberComments
    dNTPsNEBN0447
    Q5 high-fidelity DNA polymeraseNEBM0491LOther high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification.
    TrackIt 1 Kb Plus DNA ladderThermoFisher Scientific10488085
    Taq DNA polymeraseNEBM0273L
    cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktailSigma-Aldrich11836170001It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit MNase cleavage by chelation of Ca2+.
    PMSFACROS OrganicsAC215740010
    Digitonin, High PurityEMD Millipore300410-250MGMake a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing.
    Proteinase K, 20 mg/mLInvitrogen25530049
    RNase A, 10 mg/mLThermoFisher ScientificEN0531
    Ampure XP beadsBeckman CoulterA63880Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24).
    MagneSphere magnetic rackPromegaZ5342

    References

    1. Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nat Commun. 6, 8733 (2015).
    2. Chen, J., et al. Single-Molecule Dynamics of Enhanceosome Assembly in Embryonic Stem Cells. Cell. 156 (6), 1274-1285 (2014).
    3. Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (46), 18602-18607 (2013).
    4. Park, D., Lee, Y., Bhupindersingh, G., Iyer, V. R. Widespread Misinterpretable ChIP-seq Bias in Yeast. PLoS ONE. 8 (12), 83506 (2013).
    5. Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2015).
    6. Krebs, W., et al. Optimization of transcription factor binding map accuracy utilizing knockout-mouse models. Nucleic Acids Res. 42 (21), 13051-13060 (2014).
    7. Paul, E., Zhu, Z. I., Landsman, D., Morse, R. H. Genome-Wide Association of Mediator and RNA Polymerase II in Wild-Type and Mediator Mutant Yeast. Mol Cell Biol. 35 (1), 331-342 (2015).
    8. Worsley Hunt, R., Wasserman, W. W. Non-targeted transcription factors motifs are a systemic component of ChIP-seq datasets. Genome Biol. 15 (7), 412 (2014).
    9. Vega, V. B., Cheung, E., Palanisamy, N., Sung, W. -. K. Inherent Signals in Sequencing-Based Chromatin-ImmunoPrecipitation Control Libraries. PLoS ONE. 4 (4), 5241 (2009).
    10. Teytelman, L., et al. Impact of Chromatin Structures on DNA Processing for Genomic Analyses. PLoS ONE. 4 (8), 6700 (2009).
    11. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive Genome-wide Protein-DNA Interactions Detected at Single-Nucleotide Resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
    12. He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotech. 33 (4), 395-401 (2015).
    13. Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin. Nat Methods. 11 (2), 203-209 (2014).
    14. Skene, P. J., Hernandez, A. E., Groudine, M., Henikoff, S. The nucleosomal barrier to promoter escape by RNA polymerase II is overcome by the chromatin remodeler Chd1. eLife. 3, 02042 (2014).
    15. Aughey, G. N., Southall, T. D. Dam it's good! DamID profiling of protein-DNA interactions. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (1), 25-37 (2016).
    16. Wang, H., Mayhew, D., Chen, X., Johnston, M., Mitra, R. D. Calling Cards enable multiplexed identification of the genomic targets of DNA-binding proteins. Genome Res. 21 (5), 748-755 (2011).
    17. Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. ChIC and ChEC: Genomic Mapping of Chromatin Proteins. Mol Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
    18. Merz, K., et al. Actively transcribed rRNA genes in S. cerevisiae are organized in a specialized chromatin associated with the high-mobility group protein Hmo1 and are largely devoid of histone molecules. Genes Dev. 22 (9), 1190-1204 (2008).
    19. Schmid, M., et al. Nup-PI: The Nucleopore-Promoter Interaction of Genes in Yeast. Mol Cell. 21 (3), 379-391 (2006).
    20. Dunn, T., Gable, K., Beeler, T. Regulation of cellular Ca2+ by yeast vacuoles. J Biol Chem. 269 (10), 7273-7278 (1994).
    21. Grünberg, S., Henikoff, S., Hahn, S., Zentner, G. E. Mediator binding to UASs is broadly uncoupled from transcription and cooperative with TFIID recruitment to promoters. The EMBO Journal. 35 (22), 2435-2446 (2016).
    22. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
    23. Rohland, N., Reich, D. Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).
    24. Orsi, G. A., Kasinathan, S., Zentner, G. E., Henikoff, S., Ahmad, K., Ausubel, F. M., et al. Mapping regulatory factors by immunoprecipitation from native chromatin. Current protocols in molecular biology. 110, 21-25 (2015).
    25. Heinz, S., et al. Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
    26. Kungulovski, G., et al. Application of histone modification-specific interaction domains as an alternative to antibodies. Genome Res. 24 (11), 1842-1853 (2014).
    27. Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells. Nat. Protocols. 2 (6), 1467-1478 (2007).
    28. Feeser, E. A., Wolberger, C. Structural and Functional Studies of the Rap1 C-Terminus Reveal Novel Separation-of-Function Mutants. J Mol Biol. 380 (3), 520-531 (2008).
    29. Neph, S., et al. An expansive human regulatory lexicon encoded in transcription factor footprints. Nature. 489 (7414), 83-90 (2012).
    30. Mountjoy, K. G., Kong, P. L., Taylor, J. A., Willard, D. H., Wilkison, W. O. Melanocortin receptor-mediated mobilization of intracellular free calcium in HEK293 cells. Physiol Genomics. 5 (1), 11-19 (2001).
    31. Seurin, D., Lombet, A., Babajko, S., Godeau, F., Ricort, J. -. M. Insulin-Like Growth Factor Binding Proteins Increase Intracellular Calcium Levels in Two Different Cell Lines. PLoS ONE. 8 (3), e59323 (2013).
    32. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging Calcium in Neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
    33. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotech. 32 (4), 347-355 (2014).
    34. Filion, G. J., et al. Systematic Protein Location Mapping Reveals Five Principal Chromatin Types in Drosophila Cells. Cell. 143 (2), 212-224 (2010).
    35. van Bemmel, J. G., et al. A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila. Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).
    36. Izzo, A., et al. The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells. Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Explore More Articles

    124

    This article has been published

    Video Coming Soon

    JoVE Logo

    Privacy

    Terms of Use

    Policies

    Contact Us

    Recommend to library

    JoVE NEWSLETTERS

    Research

    Education

    Authors

    Librarians

    ABOUT JoVE

    Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved