Геномное картирование белково-ДНК-взаимодействий с ChEC-seq in<em&gt; Разное</em

Мы описываем эндогенное расщепление хроматина в сочетании с высокопроизводительным секвенированием (ChEC-seq), хромопатическим иммунопреципитацией (ChIP) -ортогональным методом для картирования сайтов связывания с белками генома с гибридными белками с микрококковой нуклеазой (MNase).

Аннотация

Геномное картирование взаимодействия белок-ДНК имеет решающее значение для понимания регуляции генов, ремоделирования хроматина и других хроматиновых резидентных процессов. Сформирование формальдегида с последующей иммунопреципитацией хроматина и секвенированием с высокой пропускной способностью (X-ChIP-seq) было использовано для получения многих ценных сведений о биологии генома. Однако X-ChIP-seq имеет значительные ограничения, связанные с сшиванием и ультразвуком. Родной ChIP избегает этих недостатков, исключая сшивание, но часто приводит к плохому восстановлению связанных с хроматином белков. Кроме того, все методы на основе ChIP подвержены соображениям качества антител. Для картирования белково-ДНК-взаимодействий также использовались ферментативные методы картирования белково-ДНК-взаимодействий, которые включают слияние белка, представляющего интерес для модифицирующего ДНК фермента. Недавно мы объединили один такой метод - хроническое эндогенное расщепление (ChEC), с высокопроизводительным секвенированием как ChEC-seq. ChEC-seq полагается на слияние хроматина-ассоциированногоКоторый представляет интерес для микрококковой нуклеазы (МНКазы) для получения целенаправленного расщепления ДНК в присутствии кальция в живых клетках. ChEC-seq не основан на иммунопреципитации и поэтому обходит потенциальные проблемы с сшиванием, ультразвуком, солюбилизацией хроматина и качеством антител, обеспечивая при этом отображение высокого разрешения с минимальным фоновым сигналом. Мы предполагаем, что ChEC-seq станет мощным партнером ChIP, предоставляя независимые средства, позволяющие как проверять результаты ChIP-seq, так и открывать новые представления о геномном регулировании.

Введение

Сопоставление сайтов связывания факторов транскрипции (ТФ), ремоделиров хроматина и других связанных с хроматином регуляторных факторов является ключом к пониманию всех процессов на основе хроматина. В то время как подходы хромотанового иммунопреципитации и высокопроизводительного секвенирования (ChIP-seq) были использованы для получения многих важных сведений о биологии генома, они имеют значительные ограничения. Недавно мы представили альтернативный метод, называемый эндогенным расщеплением хроматина и секвенированием с высокой пропускной способностью (ChEC-seq) ¹ , чтобы обойти эти недостатки.

ChIP-seq чаще всего проводят с начальной стадией поперечной сшивки формальдегида (X-ChIP-seq) для сохранения взаимодействия белок-ДНК. Однако в ряде недавних исследований было показано, что X-ChIP-seq захватывает переходные или неспецифические белково-ДНК-взаимодействия ² ^, ³ ^, ⁴ ^, ⁵ ^{, ⁶ ^, ⁷ ^, ⁸ , что приводит к появлению ложноположительных сайтов связывания. Кроме того, обработка ультразвуком, обычно используемая для фрагментации хроматина в экспериментах X-ChIP-seq, предпочтительно сдвигает области открытого хроматина, что приводит к необъективному извлечению фрагментов из этих областей ⁹ ^, ¹⁰ . Ультразвук также дает гетерогенную смесь длин фрагментов, в конечном счете ограничивая разрешение сайта-сайта, хотя добавление стадии экстрагирования экзонуклеазой может значительно улучшить разрешение ¹¹ ^, ¹² . Нативные методы ChIP, такие как оккупированные области геномов из очищенного от аффинности естественно выделенного хроматина (ORGANIC) ¹³ , не используют сшивание и фрагмент хроматина с микрококковой нуклеазой (MNase), уменьшая потенциальные смещения, связанные с сшиванием формальдегида и ультразвуком. Однако,Растворимость многих белков, связанных хроматинами, в относительно мягких условиях, необходимых для естественной экстракции хроматина, является плохим, что потенциально приводит к уменьшению динамического диапазона и / или ложных негативов ¹⁴ .}

В то время как различные итерации ChIP-seq наиболее часто используются для картирования белок-ДНК в геноме, были также реализованы несколько методов картирования, основанных на слиянии белков, представляющих интерес для различных модифицирующих ДНК ферментов. Одним из таких подходов является идентификация ДНК-аденин-метилтрансферазы ДНК (DamID) ¹⁵ , где интересующий хроматин белок, представляющий интерес, генетически слит с плотиной, и этот синтез экспрессируется в клетках или животных, что приводит к метилированию последовательностей GATC, близких к сайтам связывания белка. DamID выгодно тем, что он не полагается на иммунопреципитацию и поэтому избегает сшивания, антител или солюбилизации хроматина. Он также выполняется in vivo . Однако, Разрешение DamID ограничено шкалой килобаз, и метилирующая активность слитого белка плотины является конститутивной. Второй способ, основанный на ферментативном слиянии, - это Calling Card-seq ¹⁶ , в котором используется слияние интересующего фактора с транспозазой, направляя специфическую для сайта интеграцию транспозонов. Подобно DamID, Calling Card-seq не основан на иммунопреципитации и, следовательно, имеет схожие преимущества, с дополнительным преимуществом повышенного разрешения. Однако Call-Card-seq может быть ограничена последовательными смещениями транспозаз и также зависит от наличия сайтов рестрикции, близких к сайтам вставки транспозонов.

Третий метод ферментативного слияния, разработанный в лаборатории Laemmli, представляет собой эндогенное расщепление хроматина (ChEC) ¹⁷ . В ChEC слияние между хроматин-ассоциированным белком и MNase экспрессируется в клетках, а после добавления кальция для активации MNase ДНК расщепляется проксимально к сайтам связывания для меченыхФактора ( рис. 1 ). В сочетании с Саузерн-блоттингом ChEC использовался для характеристики структуры хроматина и связывания белка в ряде отдельных локусов в дрожжах ¹⁷ ^, ¹⁸ и был объединен с микроматричным анализом с низким разрешением для зондирования взаимодействия компонентов ядерных пор с дрожжами Геном ¹⁹ . ChEC предлагает преимущества, подобные DamID и Calling Card-seq, и его разрешение почти однопалубной пары при анализе с помощью расширения ¹⁹ праймера. ChEC также контролируема: надежное расщепление ДНК с помощью MNase зависит от добавления миллимолярного кальция, гарантируя, что MNase неактивен при низких концентрациях свободного кальция, наблюдаемых в живых дрожжевых клетках ²⁰ .

Ранее мы предположили, что объединение ChEC с высокопроизводительным секвенированием (ChEC-seq) обеспечит карты с высоким разрешением сайтов привязки TF. Действительно, ChEC-seq генерирует карты высокого разрешения почкообразующих общих регуляторных факторов (GRF) Abf1, Rap1 и Reb1 в геноме ¹ . Мы также успешно применили ChEC-seq к модульному медиаторному комплексу, сохраняющемуся, существенному глобальному транскрипционному коактиватору ²¹ , расширяющему применимость ChEC-seq к комплексам размером в мегадальтон, которые напрямую не связаны с ДНК и могут быть трудно отображены ChIP- Основанные методы. ChEC-seq является мощным методом как для независимой проверки результатов ChIP-seq, так и для генерации новых представлений о регулировании хроматин-резидентных процессов. Здесь мы представляем пошаговый протокол для реализации этого метода в почкодоносных дрожжах.

протокол

1. Генерация дрожжевых штаммов

Генерируйте дрожжевой штамм, несущий фактор интереса, помеченный MNase.
1. ПЦР амплифицируют кассету для маркировки MNase из желаемого вектора ( таблица 1 ), используя указанную реакционную смесь ( таблица 2 ) и условия циклирования ( таблица 3 ). Смешайте 5 мкл реакции ПЦР и 1 мкл 6X-загружающего ДНК ДНК. Проводите каждую аликвоту ПЦР на 0,8% агарозном геле при 120 В в течение 40 мин. Ожидаемый размер продукта ~ 2,3 кб.
2. Преобразуйте усиленную кассету с мечением в выбранный штамм, используя стандартное преобразование ²² ацетата лития и выполняйте селекцию.
3. Проверьте правильность интеграции кассеты с мечением с колониальной ПЦР.
  1. Подготовьте указанную реакционную смесь ( таблица 4 ) для количества колоний, подлежащих скринингу. Держите на льду, пока это не понадобится.
  2. Выберите часть каждой колонии, которая будетВ нижней части ПЦР-трубки, используя стерильную зубочистку или наконечник пипетки.
  3. Микроволны выбрали колонии при высокой мощности в течение 1 мин.
  4. Добавьте 50 мкл ПЦР-смеси ( таблица 4 ) в каждую микроволновую колонию и пипетку вверх и вниз для смешивания. Выполните ПЦР с использованием указанных условий циклирования ( Таблица 5 ).
  5. Смешайте 50 мкл реакции ПЦР и 10 мкл 6X ДНК-загружающего красителя непосредственно в каждой ПЦР-трубке. Прогон 10 мкл каждого образца на 1% агарозном геле при 120 В в течение 40 мин. Ожидаемый размер продукта ~ 700 б.п.
    ПРИМЕЧАНИЕ. При желании проверьте правильную экспрессию слитого белка MNase через вестерн-блоттинг. Ожидается сдвиг молекулярной массы меченого белка на 20,6 килодальтона.
Генерируют свободный штамм MNase путем гомологического клонирования промотора интересующего гена в pGZ136 (таблица 1) и трансформации и отбора, как на этапе 1.1.2.
1. AlternatiСобирают промотор интересующего гена и 3 × FLAG-MNase-SV40 NLS в вектор плазмиды, трансформируют и выбирают так же, как на этапе 1.1.2, и вырабатывают штамм в соответствующем селективном состоянии для поддержания плазмиды.

2. ЧЕК

Во второй половине дня / вечером за день перед экспериментом ChEC инокулируйте 3 мл дрожжево-пептон-декстрозы (YPD) или подходящую селективную среду с одной колонией штамма, несущей фактор, меченный MNase. Инкубируйте эту культуру в течение ночи (180 об / мин встряхивания, 30 ° C).
Утром дня эксперимента ChEC разбавьте ночную культуру до 50 мл среды до оптической плотности при 600 нм (OD ₆₀₀ ) 0,2-0,3. Инкубируйте эту культуру (180 об / мин встряхивания, 30 ° C), пока она не достигнет OD ₆₀₀ 0,5-0,7. По мере приближения культуры к соответствующему OD ₆₀₀ , установите тепловой блок или водяную баню до 30 ° C и начните оттаивать добавки буфера A ( Ta6).
Подготовьте 5 мл добавок Buffer A plus ( таблица 6 ) на культуру. Храните буфер A при RT во время процедуры.
Подготовьте микроцентрифужные пробирки, содержащие 90 мкл стоп-раствора ( таблица 7 ) и 10 мкл 10% SDS для каждого момента времени, который должен быть собран. Для каждого нового анализируемого фактора берут образцы через 0 с, 30 с, 1 мин, 2,5 мин, 5 мин и 10 мин.
Декантируют культуру в 50 мл коническую трубку и центрифугируют при 1500 мкг и комнатной температуре (RT) в течение 1 мин.
Тщательно ресуспендируйте клетки в 1 мл буфера А и перенесите ресуспендированные клетки в микроцентрифужную пробирку. Гранулы ресуспендировали клетки в микроцентрифуге при 1500 мкг и RT в течение 30 с.
Супернатант аспирации и тщательно ресуспендировать клетки в 1 мл буфера А путем пипетирования вверх и вниз. Гранулы ресуспендировали клетки в микроцентрифуге при 1500 мкг и RT в течение 30 с. Повторите этот шаг один раз.
Тщательно ресуспендировать клетки в 570 мкл буфера А. Добавить 30 мкл 2% дигитонина(Конечная концентрация 0,1%) для облегчения проницаемости клеток и инвертирования для смешивания.
Пермеабилизируйте клетки в тепловом блоке или водяной бане при 30 ° С в течение 5 мин.
Пипетируйте реакцию вверх и вниз, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток. Удалите 100 мкл аликвоты пермеабилизированных клеток в качестве отрицательного контроля в микроцентрифужную пробирку, содержащую стоп-раствор и SDS (шаг 2.4), и вихрь коротко для смешивания.
Добавьте 1,1 мкл 1 М CaCl ₂ (2 мМ конечной концентрации) в пермеабилизированные клетки для активации MNase и инвертируйте несколько раз быстро или вихрь коротко для смешивания. Немедленно возвратите смешанную реакцию при 30 ° C и запустите таймер.
В каждый момент времени, который нужно собрать, пипетируйте реакцию вверх и вниз, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток, затем удалите 100 мкл аликвоты пермеабилизированных клеток в микроцентрифужную пробирку, содержащую стоп-раствор, и SDS и вихрь, чтобы перемешать. Для каждого нового анализируемого фактора возьмите 0 с (без добавления CaCl ₂ ), 30 с, 1 мин, 2,5 мин, 5 мин и 10 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ. ЧИК-эксперименты с факторами, которые быстро расщепляют ДНК при 30 ° С, могут быть выполнены при более низких температурах, чтобы замедлить кинетику расщепления MNase.
После того как все точки времени были собраны, добавьте 4 мкл 20 мг / мл протеиназы К в каждый образец, вихрь кратковременно перемешивают и инкубируют при 55 ° С в течение 30 мин.
Добавьте к каждому образцу 200 мкл 25: 24: 1 фенола: хлороформ: изоамиловый спирт, энергично перемешивают, центрифугируют с максимальной скоростью и RT в микроцентрифуге в течение 5 мин.
Удалите каждую водную фазу (~ 150 мкл) в новую пробирку. Добавьте 30 мкг гликогена и 500 мкл 100% этанола. Вихрь энергично перемешивают и осаждают на сухом льду в течение 10 мин или до тех пор, пока раствор не станет вязким.
Гранулы осаждали ДНК с максимальной скоростью и 4 ° С в микроцентрифуге в течение 10 мин.
Декантирующие супернатанты и промывные гранулы с 1 мл 70% этанола RT.
Декантированный этанол, удаляющий остаток путем инвертированияD аккуратно постукивая трубками на бумажном полотенце. Кратко открутите образцы с помощью настольной центрифуги и используйте пипетку для удаления остаточного этанола, следя за тем, чтобы не повредить таблетку. Воздушно-сухие гранулы для РТ в течение 5 мин.
В то время как гранулы сушат, сделайте основную смесь для ресуспендирования высушенных гранул в 29 мкл Трис, pH 8,0 + 1 мкл 10 мг / мл РНКазы А каждый. Дайджест РНК при 37 ° С в течение 20 мин.
Смешайте 1 мкл 6X загружающего ДНК красителя с 5 мкл каждого образца и бегите на 1,5% агарозном геле при 120 В в течение 40 мин.

3. Выбор размера

ПРИМЕЧАНИЕ. Цель выбора размера заключается в удалении фрагментов из нескольких килобаз геномной ДНК из образца, подлежащего секвенированию, и обогащения фрагментов ~ 150 б.п. (примерно размер нуклеосомной ДНК) или меньше. В данных секвенирования фрагменты <400 б.п. обогащены, с заметным пиком вокруг размера нуклеосомной ДНК (~ 150 п.о.) и пиковым или широким распределением субнуклеосомных фрагментов.

<ол>

Для каждого образца добавьте 75 мкл твердофазных гранул с обратимой иммобилизацией (SPRI) в растворе ²³ полиэтиленгликоля (ПЭГ) и пипеткой вверх и вниз 10 раз для смешивания. Инкубируйте гранулу: смесь ДНК при комнатной температуре в течение 5 мин.

Во время инкубации шариков SPRI готовят микрофьюзовые пробирки, содержащие 96 мкл 10 мМ Трис, рН 8,0 и 4 мкл 5 М NaCl для каждого образца.

Поместите трубки в магнитную стойку, чтобы собрать бусины со стороны трубки. Позвольте бусинам собирать на стороне трубки в течение 2 мин.

Перенесите каждый супернатант в новую пробирку, содержащую трис и NaCl (шаг 3.2).

Добавьте к каждому образцу 200 мкл 25: 24: 1 фенол: хлороформ: изоамиловый спирт, вихрь для смешивания и центрифугу с максимальной скоростью и RT в микроцентрифуге в течение 5 мин.

Удалите каждую водную фазу в новую пробирку. Добавьте 30 мкг гликогена и 500 мкл 100% этанола. Осаждайте ДНК на сухом льду в течение 10 мин или до тех пор, пока раствор не станет вязким.

ПеллетыНасыщенной ДНК с максимальной скоростью и 4 ° С в микроцентрифуге в течение 10 мин.

Декантируют супернатанты и промывают гранулы 1 мл 70% этанола.

Декантируйте этанол, удалив остаток, инвертируя и осторожно постукивая по трубам на бумажном полотенце. Кратко открутите образцы с помощью настольной центрифуги и используйте пипетку для удаления остаточного этанола, следя за тем, чтобы не повредить таблетку. Воздушно-сухие гранулы для РТ в течение 5 мин.

Ресуспендируют высушенные гранулы в 25 мкл Трис, pH 8,0. Определите концентрацию образца, используя высокочувствительный анализ. Для экспериментов TF ChEC ДНК 10-100 нг регулярно восстанавливается после выбора размера.

Подготовьте библиотеки секвенирования. Желательно, чтобы протоколы подготовки библиотек, которые не зависят от выбора размера, как описано ранее ²⁴ , позволяют упорядочивать большой диапазон размеров фрагментов (25-500 пар оснований).

Библиотеки последовательностей в режиме сопряжения. Для качественного чтения требуется минимум 25 оснований последовательности на каждом концеотображение. От 1 до 2 миллионов чтений обеспечивает достаточный охват образца ЧЭО.
ПРИМЕЧАНИЕ. Анализ данных ChEC-seq является сложной процедурой и выходит за рамки данной статьи. Подробную информацию о анализе данных можно найти в предыдущих публикациях ¹ ^, ²¹ , а пользовательские сценарии, используемые для анализа, доступны в GitHub (https://github.com/zentnerlab/chec-seq). HOMER ²⁵ (http://homer.salk.edu) также может использоваться для анализа данных ChEC-seq в командной строке.

Результаты

В случае успешного эксперимента ChEC анализ ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле выявит зависимое от кальция увеличение фрагментации ДНК в течение времени, о чем свидетельствует размывание и возможное полное переваривание геномной ДНК. В некоторых случаях пос...

Обсуждение

Мы показали, что ChEC может отображать различные типы дрожжевых белков на хроматине и предвидеть, что он будет широко применяться к различным семействам TF и другим хроматин-связывающим факторам у дрожжей. ChEC-seq выгоден тем, что он не требует сшивки, солюбилизации хроматина или антител....

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Мустафу Салеха и Джей Туиньи за критическое чтение рукописи и Стивена Хана и Стивена Хеникова за наставничество и поддержку во время разработки ChEC-seq и его применения к медиаторскому комплексу. SG поддерживается грантами NIH R01GM053451 и R01GM075114, а GEZ поддерживается фондами запуска Университета штата Индиана.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
dNTPs	NEB	N0447
Q5 high-fidelity DNA polymerase	NEB	M0491L	Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification.
TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder	ThermoFisher Scientific	10488085
Taq DNA polymerase	NEB	M0273L
cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	11836170001	It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit MNase cleavage by chelation of Ca²⁺.
PMSF	ACROS Organics	AC215740010
Digitonin, High Purity	EMD Millipore	300410-250MG	Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing.
Proteinase K, 20 mg/mL	Invitrogen	25530049
RNase A, 10 mg/mL	ThermoFisher Scientific	EN0531
Ampure XP beads	Beckman Coulter	A63880	Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24).
MagneSphere magnetic rack	Promega	Z5342