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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Descriviamo la cedola endogena cromatina accoppiata con sequenza ad alto rendimento (ChEC-seq), un metodo ortogonale di immunoprecipitazione cromatina (ChIP) per la mappatura dei siti di legame proteico a livello genomico con proteine ​​di fusione microscopica nuclease (MNase).

Abstract

La mappatura genomica delle interazioni proteine-DNA è fondamentale per comprendere la regolazione del gene, il rimodellamento della cromatina e altri processi residenti in cromatina. La reticolazione di formaldeide seguita da immunoprecipitazione di cromatina e sequenziamento ad alta percentuale (X-ChIP-seq) è stata utilizzata per ottenere molti approfondimenti nella biologia del genoma. Tuttavia, X-ChIP-seq ha limitazioni notevoli legate alla reticolazione e alla sonicazione. Il ChIP nativo evita questi inconvenienti evitando il collegamento incrociato, ma spesso provoca una scarsa ripresa delle proteine ​​legate alla cromatina. Inoltre, tutti i metodi basati su ChIP sono soggetti a considerazioni sulla qualità degli anticorpi. I metodi enzimatici per la mappatura delle interazioni proteine-DNA, che coinvolgono la fusione di una proteina di interesse per un enzima modificante del DNA, sono stati utilizzati anche per mappare interazioni proteine-DNA. Recentemente abbiamo combinato un metodo di questo tipo, scissione endogena cromatina (ChEC), con sequenziamento ad alto rendimento come ChEC-seq. ChEC-seq si basa sulla fusione di una cromatin-assoc(MNase) per generare frammenti di DNA mirati in presenza di calcio nelle cellule viventi. La ChEC-seq non è basata sull'immunoprecipitazione e pertanto evita le potenziali preoccupazioni con il collegamento a reticolazione, la sonicazione, la solubilizzazione di cromatina e la qualità degli anticorpi, fornendo al tempo stesso una mappatura ad alta risoluzione con un minimo di segnale di fondo. Prevediamo che ChEC-seq sarà una potente controparte di ChIP, fornendo un mezzo indipendente per convalidare i risultati ChIP-seq e scoprire nuove conoscenze sulla regolazione genomica.

Introduzione

La mappatura dei siti di legame dei fattori di trascrizione (TFs), dei rimodellanti di cromatina e di altri fattori regolatori associati alla cromatina è fondamentale per comprendere tutti i processi basati sulla cromatina. Mentre sono stati utilizzati approcci di immunoprecipitazione cromatina e sequenziamento ad alta percentuale (ChIP-seq) per ottenere molte importanti conoscenze sulla biologia genoma, esse presentano limitazioni notevoli. Recentemente abbiamo introdotto un metodo alternativo, definito scissione endogena cromatina e sequenziamento ad alta percentuale (ChEC-seq) 1 , per eludere questi inconvenienti.

Il ChIP-seq viene spesso eseguito con un passo iniziale di reticolazione di formaldeide (X-ChIP-seq) per preservare interazioni proteine-DNA. Tuttavia, un certo numero di recenti studi hanno indicato che X-ChIP-seq cattura interazioni transienti o non specifiche di proteine-DNA 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , dando origine a falsi positivi siti di legame. Inoltre, la sonicazione, comunemente usata per frammentare la cromatina in esperimenti X-ChIP-seq, preferisce scavare regioni di cromatina aperta, portando a un recupero biasimo di frammenti da queste regioni 9,10. La sonicazione produce anche una miscela eterogenea di lunghezze di frammento, limitando in ultima analisi la risoluzione del sito di legame, anche se l'aggiunta di una fase di digestione di esonucleasi può notevolmente migliorare la risoluzione 11 , 12 . I metodi naturali di ChIP come le regioni occupate di genomi da cromatina (ORGANIC) 13 naturalmente isolati dall'affinità (ORGANIC) non usano la reticolazione e la frammentazione di cromatin con la nuclace micrococcica (MNase), alleviando potenziali pregiudizi associati a crosslinking e sonicazione di formaldeide. Però,La solubilità di molte proteine ​​legate alla cromatina sotto le condizioni relativamente lievi richieste per l'estrazione natu- rale di cromatina è scarsa, potenzialmente in grado di ridurre la dinamica e / o falsi negativi 14 .

Mentre varie iterazioni di ChIP-seq sono più comunemente utilizzate per la mappatura genoma di interazioni proteine-DNA, sono state implementate anche diverse tecniche di mappatura basate sulla fusione di proteine ​​di interesse per vari enzimi che modificano il DNA. Un tale approccio è l'identificazione di DNA adenina metiltransferasi (DamID) 15 , in cui una proteina di interesse di cromatina di interesse è geneticamente fusa alla diga e questa fusione è espressa in cellule o animali, con conseguente metilazione di sequenze GATC prossimali ai siti di legame della proteina. DamID è vantaggioso in quanto non si basa sull'immunoprecipitazione e quindi evita il collegamento a reticolazione, gli anticorpi o la solubilizzazione di cromatina. Viene anche eseguito in vivo . però, La risoluzione di DamID è limitata alla scala di kilobase e l'attività di metilazione della proteina di fusione della diga è costitutiva. Un secondo metodo basato sulla fusione enzimatica è Calling Card-seq 16 , che impiega fusione di un fattore di interesse per una transposa, orientando l'integrazione specifica del sito di transposoni. Come DamID, Calling Card-seq non è basato su immunoprecipitazione e quindi ha vantaggi simili, con il vantaggio aggiunto di una maggiore risoluzione. Tuttavia, Calling Card-seq può essere limitato da biases di sequenza di transposasi ed è anche dipendente dalla presenza di siti di restrizione vicini ai siti di inserimento di transposone.

Un terzo metodo di fusione enzimatica, sviluppato nel laboratorio Laemmli, è la scissione endogena cromatina (ChEC) 17 . In ChEC, una fusione tra una proteina associata alla cromatina e il MNase viene espressa in cellule, e dopo l'aggiunta di calcio per attivare MNase, il DNA viene ceduto prossimale ai siti di legame per il taggedFattore ( figura 1 ). In combinazione con il blotting del sud, la ChEC è stata usata per caratterizzare la struttura della cromatina e la legatura di proteine ​​in un certo numero di singoli loci nel lievito 17 , 18 ed è stata combinata con analisi microarray a bassa risoluzione per sondare l'interazione dei componenti dei pori nucleari con il lievito Genoma 19 . ChEC offre vantaggi simili a DamID e Calling Card-seq, e la sua risoluzione è quasi una coppia di base quando viene analizzata dall'estensione primer 19 . ChEC è inoltre controllabile: la robusta sequenza del DNA da parte di MNase dipende dall'aggiunta di calcio millimolare, assicurando che MNase sia inattivo alle basse concentrazioni di calcio libere osservate nelle cellule di lievito vivo 20 .

In precedenza, abbiamo affermato che la combinazione di ChEC con sequenza ad alto rendimento (ChEC-seq) fornirà mappe ad alta risoluzione di siti di legame TF. Anzi, ChEC-seq ha generato mappe ad alta risoluzione dei fattori di regolazione generale del lievito (GRF) Abf1, Rap1 e Reb1 attraverso il genoma 1 . Abbiamo anche applicato con successo ChEC-seq al complesso modulare Mediator, un coattivatore globale trascrizionale 21 essenzialmente conservato, espandendo l'applicabilità di ChEC-seq a complessi di dimensione megadalton che non contattano direttamente il DNA e possono essere difficili da mappare con ChIP- Basati su metodi. ChEC-seq è un metodo potente sia per la convalida indipendente dei risultati ChIP-seq che per la generazione di nuove conoscenze nella regolazione dei processi residenti in cromatina. Qui esempiamo un protocollo passo per passo per l'attuazione di questo metodo nel lievito in erba.

Protocollo

1. Generazione di ceppi di lievito

  1. Genera un ceppo di lievito che porta il fattore di interesse tagliato con MNase.
    1. PCR amplifica la cassetta di contrassegno MNase dal vettore desiderato ( Tabella 1 ) usando la miscela di reazione specificata ( Tabella 2 ) e le condizioni di ciclo ( Tabella 3 ). Mescolare 5 μL della reazione PCR e 1 μL di colorante carica DNA 6X. Eseguire ogni aliquota di PCR su un gel agarosio 0,8% a 120 V per 40 min. La dimensione del prodotto prevista è di ~ 2,3 kb.
    2. Trasformare la cassetta di etichettatura amplificata nel ceppo di scelta usando la trasformazione standard di acetato di litio 22 e eseguire la selezione.
    3. Verificare l'integrazione corretta del cassetto di codifica con colonia PCR.
      1. Preparare la miscela di reazione specificata ( Tabella 4 ) per il numero di colonie da sottoporre a screening. Continuare a girare fino a quando non sia necessario.
      2. Scegli una porzione di ciascuna colonia per essere provataNella parte inferiore di un tubo PCR utilizzando uno stuzzicadenti sterile o una punta pipetta.
      3. Microonde le colonie selezionate ad alta potenza per 1 min.
      4. Aggiungere 50 μL di miscela PCR ( Tabella 4 ) a ciascuna colonia microelastica e pipetta su e giù per mescolare. Eseguire il PCR utilizzando le condizioni di ciclo specificate ( Tabella 5 ).
      5. Mescolare 50 μL di reazione PCR e 10 μL di colorante di caricamento del DNA da 6X direttamente in ciascun tubo PCR. Eseguire 10 μl di ogni campione su un gel agarosico al 1% a 120 V per 40 min. La dimensione del prodotto prevista è di ~ 700 bp.
        NOTA: Se si desidera, verificare l'espressione appropriata della proteina di fusione MNase mediante blotting occidentale. Si prevede un cambiamento di ~ 20,6 kilodalton nel peso molecolare della proteina taggata.
  2. Generare un ceppo di MNase libero mediante clonazione a base omologica del promotore del gene di interesse in pGZ136 (Tabella 1) e trasformazione e selezione come nel punto 1.1.2.
    1. alternati, Assemblare il promotore del gene di interesse e NLS di 3xFLAG-MNase-SV40 in un vettore plasmide, trasformare e selezionare come nel punto 1.1.2 e sviluppare il ceppo nella condizione appropriata selettiva per mantenere il plasmide.

2. ChEC

  1. Nel pomeriggio / sera del giorno prima dell'esperimento ChEC, inoculare 3 mL di lievito-peptone-dextrose (YPD) o di un mezzo selettivo appropriato con una singola colonia del ceppo che porta il fattore tagliato a MNase. Incubare questa coltura durante la notte (180 giri / min di scuotimento, 30 ° C).
  2. Nella mattina del giorno dell'esperimento ChEC, diluire la coltura durante la notte in 50 ml di media a una densità ottica a 600 nm (OD 600 ) di 0,2-0,3. Incubare questa coltura (180 rpm agitando, 30 ° C) fino a raggiungere un OD 600 di 0,5-0,7. Poiché la cultura si avvicina all'appropriato OD 600 , impostare il blocco termico o il bagno d'acqua a 30 ° C e avviare il disgelo del tampone A additivi ( TaBle 6).
  3. Preparare 5 mL di Tampone A e gli additivi ( Tabella 6 ) per coltura. Tenere il buffer A a RT durante la procedura.
  4. Preparare i tubi microfuge contenenti 90 μL di soluzione di arresto ( tabella 7 ) e 10 μL di SDS 10% per ogni punto temporale da raccogliere. Per ogni nuovo fattore analizzato, prendete campioni a 0 s, 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min e 10 min.
  5. Coltura la decantazione in un tubo conico da 50 mL e centrifuga a 1.500 xg e la temperatura ambiente (RT) per 1 minuto.
  6. Riposizionare completamente le cellule in 1 mL di Tampone A e trasferire le cellule risospese in un tubo microfugo. Le pellicole hanno risospeso le cellule in una microfuga a 1.500 xg e RT per 30 s.
  7. Aspirare il surnatante e riposare completamente le cellule in 1 mL di Tampone A pipettando verso l'alto e verso il basso. Le pellicole hanno risospeso le cellule in una microfuga a 1.500 xg e RT per 30 s. Ripetere questa fase una sola volta.
  8. Riposizionare completamente le cellule in 570 μl di Tampone A. Aggiungere 30 μl di 2% di digitonina(0,1% di concentrazione finale) per facilitare la permeabilizzazione delle cellule e invertire la miscela.
  9. Permeabilizzare le cellule in blocco termico o in bagno d'acqua a 30 ° C per 5 min.
  10. Pipettare la reazione verso l'alto e verso il basso per assicurare una distribuzione uniforme di celle. Rimuovere una aliquota da 100 μl di cellule permeabilizzate come un controllo negativo a un tubo microfugo contenente soluzione di arresto e SDS (fase 2.4) e vortex brevemente per mescolare.
  11. Aggiungere 1,1 μL di 1 M CaCl2 (concentrazione finale 2 mM) alle cellule permeabilizzate per attivare MNase e invertire più volte rapidamente o vorticarsi brevemente per mescolare. Immediatamente restituire la reazione mista a 30 ° C e avviare un timer.
  12. Ad ogni punto temporale da raccogliere, pipettare la reazione verso l'alto e verso il basso per assicurare una distribuzione uniforme delle cellule, quindi rimuovere una aliquota di cellule permeabilizzate da 100 μl in un tubo microfugo contenente soluzione di arresto e SDS e vorticare brevemente per mescolare. Per ogni nuovo fattore analizzato, prendere 0 s (nessun CaCl2 aggiunto), 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min e 10 minuti di tempo.
    NOTA: Esperimenti di ChEC con fattori che rapidamente fendono il DNA a 30 ° C possono essere eseguiti a temperature più basse per rallentare la cinetica di scissione di MNase.
  13. Una volta raccolti tutti i punti di tempo, aggiungere a ciascun campione 4 μL di 20 mg / mL proteinasi K, vorticare brevemente per mescolare e incubare a 55 ° C per 30 minuti.
  14. Aggiungere a ciascun campione 200 μl di 25: 24: 1 fenolo: cloroformio: isoamilico, vorticare vigorosamente per mescolare e centrifugare a velocità massima e RT in microfuga per 5 min.
  15. Rimuovere ogni fase acquosa (~ 150 μL) in un nuovo tubo. Aggiungere 30 μg di glicogeno e 500 μl di etanolo al 100%. Vortex vigorosamente per mescolare e precipitare su ghiaccio secco per 10 minuti o fino a quando la soluzione è viscosa.
  16. Il pellet ha precipitato il DNA a velocità massima e 4 ° C in microfuga per 10 min.
  17. Diluenti supernatanti e lavare pellet con 1 ml di etanolo RT 70%.
  18. Decantare l'etanolo, rimuovendo il resto invertendo unD toccando delicatamente i tubi su un tovagliolo di carta. Campionare brevemente campioni utilizzando una centrifuga a benchtop e utilizzare una pipetta per rimuovere l'etanolo residuo, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Pelletri asciutti all'aria per RT per 5 min.
  19. Mentre i pellets stanno asciugando, fanno un master mix per riposizionare pellet essiccati in 29 μl di Tris, pH 8.0 + 1 μL di 10 mg / mL RNasi A ciascuno. Digest RNA a 37 ° C per 20 minuti.
  20. Mescolare 1 μl di colorante di carica del DNA 6X con 5 μl di ciascun campione e eseguire su un gel agarosio al 1,5% a 120 V per 40 min.

3. Selezione delle dimensioni

NOTA: L'obiettivo della selezione delle dimensioni è quello di rimuovere frammenti multi-kilobase di DNA genomico dal campione da sequenziare ed arricchire frammenti di ~ 150 bp (circa la dimensione del DNA nucleosomale) o più piccoli. Nei dati di sequenziamento, i frammenti <400 bp sono arricchiti, con un picco notevole intorno alla dimensione del DNA nucleosomale (~ 150 bp) e una distribuzione di picco o ampia di frammenti subnucleosomiali.

  1. Ad ogni campione aggiungere 75 μL di branchi di immobilizzazione reversibile a fase solida (SPRI) in una soluzione di polietilenglicole (PEG) 23 e pipettare su e giù per 10 volte per mescolare. Incubare il tallone: ​​miscela DNA a RT per 5 min.
  2. Durante l'incubazione del becco SPRI, preparare tubi microfuge contenenti 96 μl di 10 mM Tris, pH 8,0 e 4 μL di 5 M NaCl per ogni campione.
  3. Posizionare i tubi in un rack magnetico per raccogliere le perline sul lato del tubo. Lasciare che le perle si raccolgano sul lato del tubo per 2 min.
  4. Trasferire ogni supernatante ad un nuovo tubo contenente Tris e NaCl (fase 3.2).
  5. Aggiungere a ciascun campione 200 μl di 25: 24: 1 fenolo: cloroformio: isoamilico, vorticarsi per mescolare e centrifugare alla velocità massima e RT in microfuga per 5 min.
  6. Rimuovere ogni fase acquosa in un nuovo tubo. Aggiungere 30 μg di glicogeno e 500 μl di etanolo al 100%. Precipitare il DNA sul ghiaccio secco per 10 minuti o fino a quando la soluzione è viscosa.
  7. Pellet preciDNA a velocità massima e 4 ° C in microfuga per 10 min.
  8. Superannanti di decantazione e lavaggi con 1 ml di etanolo al 70%.
  9. Decantate l'etanolo, rimuovendo il resto invertendo e toccando delicatamente i tubi su un tovagliolo di carta. Campionare brevemente campioni utilizzando una centrifuga a benchtop e utilizzare una pipetta per rimuovere l'etanolo residuo, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Pelletri asciutti all'aria per RT per 5 min.
  10. Ripopolare i pellet essiccati in 25 μl di Tris, pH 8,0. Determinare la concentrazione del campione usando un test di alta sensibilità. Per esperimenti di TF ChEC, 10-100 ng di DNA viene recuperato normalmente dopo la selezione delle dimensioni.
  11. Preparare le librerie di sequenziamento. I protocolli di preparazione della biblioteca che non si basano sulla selezione delle dimensioni, come descritto in precedenza 24 , sono desiderabili per consentire la sequenza di una vasta gamma di frammenti di dimensioni (25-500 bp).
  12. Librerie di sequenza in modalità terminale parallela. Per la lettura di alta qualità è necessario un minimo di 25 basi di sequenza su ciascuna estremitàMappatura. Tra 1 e 2 milioni di letture fornisce copertura sufficiente per un campione di ChEC.
    NOTA: L'analisi dei dati di ChEC-seq è una procedura complessa e oltre l'ambito di questo articolo. Informazioni dettagliate sull'analisi dei dati possono essere trovate nelle pubblicazioni precedenti 1 , 21 e gli script personalizzati utilizzati per l'analisi sono disponibili su GitHub (https://github.com/zentnerlab/chec-seq). HOMER 25 (http://homer.salk.edu) può anche essere utilizzato per l'analisi della riga di comando dei dati ChEC-seq.

Risultati

Nel caso di un esperimento di successo di ChEC, l'analisi del DNA mediante elettroforesi con agarosio gel rivelerà un aumento calcio-dipendente della frammentazione del DNA in tempo, come indicato dalla macerazione e eventuale completa digestione del DNA genomico. In alcuni casi, una scala di bande simili a quella osservata con una digestione tradizionale di MNase viene osservata dopo una digestione estesa. Questo è il caso per l'analisi ChEC di Reb1, un fattore di regolazione ...

Discussione

Abbiamo dimostrato che la ChEC può mappare diverse classi di proteine ​​di lievito sulla cromatina e anticipare che sarà generalmente applicabile a diverse famiglie di TF e altri fattori leganti di cromatina nel lievito. ChEC-seq è vantaggioso in quanto non richiede un collegamento reticolato, solubilizzazione di cromatina o anticorpi. Così, ChEC evita gli artefatti potenzialmente presenti in X-ChIP-seq, come gli artefatti hyper-ChIPable 3 , 4 e ChIP nat...

Divulgazioni

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Riconoscimenti

Ringraziamo Moustafa Saleh e Jay Tourigny per una lettura critica del manoscritto e Steven Hahn e Steven Henikoff per la tutorship e il supporto durante lo sviluppo del ChEC-seq e la sua applicazione al complesso Mediator. SG è supportato da NIH concede R01GM053451 e R01GM075114 e GEZ è supportato dai fondi di avvio di Indiana University.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
dNTPsNEBN0447
Q5 high-fidelity DNA polymeraseNEBM0491LOther high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification.
TrackIt 1 Kb Plus DNA ladderThermoFisher Scientific10488085
Taq DNA polymeraseNEBM0273L
cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktailSigma-Aldrich11836170001It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit MNase cleavage by chelation of Ca2+.
PMSFACROS OrganicsAC215740010
Digitonin, High PurityEMD Millipore300410-250MGMake a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing.
Proteinase K, 20 mg/mLInvitrogen25530049
RNase A, 10 mg/mLThermoFisher ScientificEN0531
Ampure XP beadsBeckman CoulterA63880Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24).
MagneSphere magnetic rackPromegaZ5342

Riferimenti

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