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Resumo

Nós descrevemos a clivagem endógena da cromatina, juntamente com a sequenciação de alto rendimento (ChEC-seq), um método ortogonal de imunoprecipitação com cromatina (ChIP) para mapear os locais de ligação de proteínas genômicas com proteínas de fusão de nucleases microcócicas (MNase).

Resumo

O mapeamento genômico de interações proteína-DNA é crítico para a compreensão da regulação de genes, remodelação de cromatina e outros processos residente em cromatina. A reticulação de formaldeído seguida de imunoprecipitação com cromatina e sequenciação de alto rendimento (X-ChIP-seq) tem sido usada para obter muitas informações valiosas sobre a biologia do genoma. No entanto, X-ChIP-seq tem limitações notáveis ​​ligadas à reticulação e sonicação. O ChIP nativo evita essas desvantagens ao omitir reticulação, mas muitas vezes resulta em uma recuperação fraca de proteínas ligadas à cromatina. Além disso, todos os métodos baseados em ChIP estão sujeitos a considerações de qualidade de anticorpos. Métodos enzimáticos para mapear interações proteína-DNA, que envolvem a fusão de uma proteína de interesse para uma enzima modificadora de DNA, também foram utilizados para mapear interações proteína-DNA. Recentemente, combinamos um desses métodos, clivagem endógena de cromatina (ChEC), com sequenciação de alto rendimento como ChEC-seq. ChEC-seq depende da fusão de uma cromatina-assocProteína de interesse para a nuclease microcócica (MNase) para gerar clivagem de DNA direcionada na presença de cálcio nas células vivas. O ChEC-seq não se baseia na imunoprecipitação e evita possíveis preocupações com reticulação, sonicação, solubilização da cromatina e qualidade de anticorpos, ao mesmo tempo que fornece mapeamento de alta resolução com sinal mínimo de fundo. Nós imaginamos que o ChEC-seq será uma contrapartida poderosa para o ChIP, proporcionando um meio independente para validar as descobertas do ChIP-seq e descobrir novas idéias sobre a regulação genômica.

Introdução

O mapeamento dos locais de ligação dos fatores de transcrição (TFs), remodeladores de cromatina e outros fatores reguladores associados à cromatina é fundamental para entender todos os processos baseados em cromatina. Embora as abordagens de imunoprecipitação com cromatina e sequenciação de alto rendimento (ChIP-seq) tenham sido usadas para obter muitos pontos de vista importantes sobre a biologia do genoma, eles apresentam limitações notáveis. Introduzimos recentemente um método alternativo, denominado clivagem endógena de cromatina e seqüenciamento de alto rendimento (ChEC-seq) 1 , para contornar essas desvantagens.

O ChIP-seq é mais frequentemente realizado com um passo inicial de reticulação de formaldeído (X-ChIP-seq) para preservar as interações proteína-DNA. No entanto, uma série de estudos recentes indicaram que X-ChIP-seq captura interações transiente ou inespecífica proteína-DNA 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , dando origem a falsos locais de ligação positiva. Além disso, a sonicação, comumente usada para fragmentar a cromatina em experimentos X-ChIP-seq, preferencialmente cisa regiões de cromatina aberta, levando a recuperação tendenciosa de fragmentos dessas regiões 9 , 10 . A sonicação também produz uma mistura heterogênea de comprimentos de fragmentos, limitando, em última instância, a resolução do local de ligação, embora a adição de um passo de digestão com exonuclease possa melhorar muito a resolução 11 , 12 . Os métodos ChIP nativos, tais como regiões ocupadas de genomas, de cromatina naturalmente isolada purificada por afinidade (ORGÂNICO) 13 não utilizam reticulação e fragmentação de cromatina com nuclease microcócica (MNase), aliviando vieses de potencial associadas à reticulação de formaldeído e sonicação. Contudo,A solubilidade de muitas proteínas ligadas à cromatina sob as condições relativamente suaves requeridas para a extração nativa da cromatina é fraca, potencialmente levando a uma redução do alcance dinâmico e / ou falsos negativos 14 .

Enquanto várias iterações de ChIP-seq são mais comumente usadas para mapeamento genômico de interações proteína-DNA, várias técnicas de mapeamento baseadas na fusão de proteínas de interesse para várias enzimas modificadoras de DNA também foram implementadas. Uma dessas abordagens é a identificação de DNA adenina metiltransferase (DamID) 15 , em que uma proteína de ligação à cromatina de interesse é geneticamente fundida em Dam e esta fusão é expressa em células ou animais, resultando em metilação de sequências de GATC proximais a locais de ligação para a proteína. DamID é vantajoso porque não depende da imunoprecipitação e evita a reticulação, os anticorpos ou a solubilização da cromatina. Também é realizado in vivo . Contudo, A resolução de DamID é limitada à escala de kilobase e a atividade de metilação da proteína de fusão de Dam é constitutiva. Um segundo método baseado na fusão enzimática é Calling Card-seq 16 , que emprega a fusão de um fator de interesse para uma transposase, direcionando a integração específica do site para os transposões. Como DamID, o Calling Card-seq não é baseado na imunoprecipitação e, portanto, tem vantagens semelhantes, com o benefício adicional de uma maior resolução. No entanto, Calling Card-seq pode ser limitado por viés de sequência das transposases e também depende da presença de locais de restrição próximos aos locais de inserção do transposão.

Um terceiro método de fusão enzimática, desenvolvido no laboratório de Laemmli, é clivagem endógena da cromatina (ChEC) 17 . No ChEC, uma fusão entre uma proteína associada à cromatina e MNase é expressa nas células, e após a adição de cálcio para ativar a MNase, o DNA é cortado proximal aos locais de ligação para os marcadosFator ( Figura 1 ). Em conjunto com Southern Blot, o ChEC tem sido usado para caracterizar a estrutura da cromatina e a ligação de proteínas em vários loci individuais em leveduras 17 , 18 e foi combinado com análise de microarrays de baixa resolução para investigar a interação de componentes de poros nucleares com o fermento Genoma 19 . O ChEC oferece benefícios semelhantes a DamID e Calling Card-seq, e sua resolução é quase um par de bases únicas quando analisado pela extensão primária 19 . O ChEC também é controlável: a clivagem de DNA robusta por MNase depende da adição de cálcio milimolar, garantindo que o MNase seja inativo nas baixas concentrações de cálcio livres observadas em células de fermento vivas 20 .

Anteriormente, postulamos que a combinação de ChEC com sequenciação de alto rendimento (ChEC-seq) proporcionaria mapas de alta resolução de sites de ligação TF. Na verdade, ChEC-seq gerou mapas de alta resolução dos fatores reguladores gerais de fermento em broto (GRFs) Abf1, Rap1 e Reb1 em todo o genoma 1 . Também aplicamos o ChEC-seq com sucesso ao complexo Mediador modular, um coativador transcriptional global conservado e conservado 21 , expandindo a aplicabilidade dos complexos ChEC-seq para megadalton-size que não contatam diretamente o DNA e podem ser difíceis de serem mapeados pelo ChIP- Métodos baseados. O ChEC-seq é um método poderoso tanto para validação independente de resultados de ChIP-seq quanto para geração de novas idéias sobre a regulação de processos de residência de cromatina. Aqui, apresentamos um protocolo passo-a-passo para a implementação deste método em fermento em brotamento.

Protocolo

1. Geração de cepas de fermento

  1. Gerar uma cepa de fermento com o fator de interesse etiquetado com MNase.
    1. O PCR amplifica a cassete de marcação MNase do vetor desejado ( Tabela 1 ) usando a mistura de reação especificada ( Tabela 2 ) e condições de ciclagem ( Tabela 3 ). Misture 5 μL da reação de PCR e 1 μL de corante de carga de DNA 6X. Execute cada alíquota de PCR em um gel de agarose a 0,8% a 120 V durante 40 min. O tamanho esperado do produto é de ~ 2,3 kb.
    2. Transforme a cassete de marcação amplificada para a tensão de escolha usando a transformação padrão de acetato de lítio 22 e execute a seleção.
    3. Verifique a integração correta da cassete de marcação com PCR de colônia.
      1. Prepare a mistura de reação especificada ( Tabela 4 ) para o número de colônias a serem selecionadas. Mantenha-se gelado até ser necessário.
      2. Escolha uma porção de cada colônia para ser tesDeslizou-se no fundo de um tubo de PCR usando um palito de palito esterilizado ou uma pipeta.
      3. Microondas as colônias colhidas com alta potência durante 1 min.
      4. Adicione 50 μL de mistura de PCR ( Tabela 4 ) a cada colônia de microondas e pipetar para cima e para baixo para misturar. Execute PCR usando as condições de ciclagem especificadas ( Tabela 5 ).
      5. Misture os 50 μL de reação de PCR e 10 μL de corante de carga de DNA 6X diretamente em cada tubo de PCR. Executar 10 μL de cada amostra em um gel de agarose a 1% a 120 V durante 40 min. O tamanho esperado do produto é de 700 pb.
        NOTA: Se desejado, verifique a expressão apropriada da proteína de fusão MNase por Western Blot. É esperada uma mudança de ~ 20,6 kilodalton no peso molecular da proteína marcada.
  2. Gerar uma linhagem de MNase livre por clonagem baseada em homologia do promotor do gene de interesse em pGZ136 (Tabela 1) e transformação e seleção como no passo 1.1.2.
    1. AlternatiPor exemplo, montar o promotor do gene de interesse e 3xFLAG-MNase-SV40 NLS em um vetor plasmídico, transformar e selecionar como no passo 1.1.2 e cultivar a deformação na condição seletiva apropriada para a manutenção do plasmídeo.

2. ChEC

  1. À tarde / noite do dia anterior ao experimento ChEC, inocule 3 mL de levedura-peptona-dextrose (YPD) ou meio seletivo apropriado com uma única colônia da cepa que contém o fator marcado com MNase. Incubar esta cultura durante a noite (agitação de 180 RPM, 30 ° C).
  2. Na manhã do dia do experimento ChEC, diluir a cultura durante a noite em 50 mL de meio para uma densidade óptica a 600 nm (OD 600 ) de 0,2 a 0,3. Incubar esta cultura (180 RPM agitando, 30 ° C) até atingir uma DO 600 de 0,5-0,7. À medida que a cultura se aproxima do OD 600 apropriado, coloque o bloco de calor ou o banho de água a 30 ° C e comece a descongelar os aditivos Buffer A ( TaBle 6).
  3. Prepare 5 mL de aditivos Buffer A plus ( Tabela 6 ) por cultura. Mantenha o buffer A na RT durante o procedimento.
  4. Prepare tubos de microcentrífuga contendo 90 μL de solução de parada ( Tabela 7 ) e 10 μL de SDS a 10% para cada ponto de tempo a ser coletado. Para cada novo fator analisado, faça amostras a 0 s, 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min e 10 min.
  5. Decantar a cultura em um tubo cônico de 50 mL e centrifugar a 1.500 xg e a temperatura ambiente (RT) durante 1 min.
  6. Ressuspender completamente as células em 1 mL de tampão A e transferir as células ressuspensas para um tubo de microcentrífuga. Pellets ressuspensas em uma microcentrífuga a 1.500 xg e RT por 30 s.
  7. Aspirar o sobrenadante e ressuspender completamente as células em 1 mL de tampão A por pipetagem para cima e para baixo. Pellets ressuspensas em uma microcentrífuga a 1.500 xg e RT por 30 s. Repita este passo uma vez.
  8. Ressuspender completamente as células em 570 μL de tampão A. Adicionar 30 μL de 2% de digitonina(0,1% de concentração final) para facilitar a permeabilização das células e inverter para misturar.
  9. Permeabilize células em bloco de calor ou banho-maria a 30 ° C durante 5 min.
  10. Pipetar a reação para cima e para baixo para garantir uma distribuição uniforme das células. Remova uma alíquota de 100 μL de células permeabilizadas como um controle negativo para um tubo de microcentrífuga contendo solução de parada e SDS (passo 2.4) e vortex brevemente para misturar.
  11. Adicione 1,1 μL de CaCl2 1 M (concentração final 2 mM) a células permeabilizadas para ativar MNase e inverter várias vezes rapidamente ou vortex brevemente para misturar. Volte imediatamente a reação mista a 30 ° C e comece um temporizador.
  12. Em cada ponto de tempo a ser coletado, pipetar a reação para cima e para baixo para garantir uma distribuição uniforme de células, então remova uma alíquota de 100 μL de células permeabilizadas para um tubo de microcentrífuga contendo solução de parada e SDS e vortex brevemente para misturar. Para cada novo fator analisado, tome 0 s (não adicionou CaCl 2 ), 30 s1 minuto, 2,5 min, 5 min e 10 minutos.
    NOTA: Experimentos de ChEC com fatores que rapidamente escinham DNA a 30 ° C podem ser realizados a temperaturas mais baixas para diminuir a cinética de clivagem de MNase.
  13. Uma vez que todos os pontos de tempo foram coletados, adicione 4 μL de 20 mg / mL de proteinase K a cada amostra, vortex brevemente para misturar e incuba a 55 ° C durante 30 min.
  14. Adicionar 200 μL de fenol: cloroformo: álcool isoamílico a cada amostra, vortex vigorosamente para misturar e centrifugar a velocidade máxima e RT em uma microcentrífuga por 5 min.
  15. Remova cada fase aquosa (~ 150 μL) para um novo tubo. Adicione 30 μg de glicogênio e 500 μL de etanol a 100%. Vortex vigorosamente para misturar e precipitar em gelo seco durante 10 minutos ou até a solução ser viscosa.
  16. O precipitado precipitou DNA à velocidade máxima e 4 ° C em uma microcentrífuga por 10 min.
  17. Decantar sobrenadantes e granulados de lavagem com 1 mL de RT 70% de etanol.
  18. Decantar o etanol, remover o restante invando umD suavemente tocando os tubos em uma toalha de papel. Gire rapidamente as amostras usando uma centrífuga de mesa e use uma pipeta para remover o etanol residual, tomando cuidado para não perturbar a pelotização. Pellets secos ao ar à TA durante 5 min.
  19. Enquanto os grânulos estão secando, faça uma mistura principal para ressuspender os grânulos secos em 29 μL de Tris, pH 8,0 + 1 μL de RNase A 10 mg / mL cada. Digerir ARN a 37 ° C durante 20 min.
  20. Misture 1 μL de corante de carga de DNA 6X com 5 μL de cada amostra e execute um gel de agarose a 1,5% a 120 V durante 40 min.

3. Seleção de tamanho

NOTA: O objetivo da seleção de tamanho é remover fragmentos multi-kilobase de DNA genômico da amostra para ser sequenciado e enriquecer fragmentos de ~ 150 pb (aproximadamente o tamanho do DNA nucleossômico) ou menor. Na sequenciação de dados, fragmentos <400 pb são enriquecidos, com um pico notável em torno do tamanho do DNA nucleossômico (~ 150 pb) e uma distribuição máxima ou ampla de fragmentos subnucleosômicos.

  1. Para cada amostra, adicione 75 μL de contas de imobilização reversível em fase sólida (SPRI) em uma solução de polietileno glicol (PEG) 23 e pipetar para cima e para baixo 10 vezes para misturar. Incubar a contagem: mistura de DNA à TA por 5 min.
  2. Durante a incubação do talão de SPRI, prepare tubos de microcentro contendo 96 μL de Tris 10 mM, pH 8,0 e 4 μL de NaCl 5 M para cada amostra.
  3. Coloque os tubos num suporte magnético para coletar os grânulos no lado do tubo. Permitir que as pérolas coletem no lado do tubo por 2 min.
  4. Transfira cada sobrenadante para um novo tubo contendo Tris e NaCl (passo 3.2).
  5. Adicionar 200 μL de fenol: clorofórmio 25: 24: 1: álcool isoamílico a cada amostra, vórtice para misturar e centrifugar a velocidade máxima e RT em uma microcentrífuga por 5 min.
  6. Remova cada fase aquosa para um novo tubo. Adicione 30 μg de glicogênio e 500 μL de etanol a 100%. Precipitar o DNA em gelo seco durante 10 minutos ou até a solução ser viscosa.
  7. Pellet preciADN catiônico na velocidade máxima e 4 ° C em uma microcentrífuga por 10 min.
  8. Decantar os sobrenadantes e lavar os grânulos com 1 mL de etanol a 70%.
  9. Decantar o etanol, removendo o restante invando e batendo suavemente os tubos sobre uma toalha de papel. Gire rapidamente as amostras usando uma centrífuga de mesa e use uma pipeta para remover o etanol residual, tomando cuidado para não perturbar a pelotização. Pellets secos ao ar à TA durante 5 min.
  10. Ressuspender os grânulos secos em 25 μL de Tris, pH 8,0. Determine a concentração da amostra usando um teste de alta sensibilidade. Para experiências TF ChEC, o DNA 10-100 ng é rotineiramente recuperado após a seleção do tamanho.
  11. Prepare bibliotecas de seqüenciamento. Os protocolos de preparação de bibliotecas que não dependem da seleção de tamanho, como descrito anteriormente 24 , são desejáveis ​​para permitir o seqüenciamento de uma grande variedade de tamanhos de fragmentos (25-500 pb).
  12. Bibliotecas de seqüência no modo pareado. Um mínimo de 25 bases de sequência em cada extremidade é necessário para leitura de alta qualidademapeamento. Entre 1 e 2 milhões de leituras fornece cobertura suficiente para uma amostra ChEC.
    NOTA: A análise dos dados do ChEC-seq é um procedimento complexo e além do alcance deste artigo. Informações detalhadas sobre análise de dados podem ser encontradas nas publicações anteriores 1 , 21 e os scripts personalizados usados ​​para análise estão disponíveis no GitHub (https://github.com/zentnerlab/chec-seq). HOMER 25 (http://homer.salk.edu) também pode ser usado para análise de linha de comando de dados ChEC-seq.

Resultados

No caso de um experimento de ChEC bem sucedido, a análise do DNA por eletroforese em gel de agarose revelará um aumento dependente do cálcio na fragmentação do DNA ao longo do tempo, conforme indicado por manchas e eventual digestão completa do DNA genômico. Em alguns casos, observa-se uma escala de bandas semelhante à observada com uma digestão MNase tradicional após a digestão prolongada. Este é o caso da análise ChEC do Reb1, um fator regulatório geral que liga as regiõ...

Discussão

Mostramos que o ChEC pode mapear diversas classes de proteínas de levedura na cromatina e antecipar que será amplamente aplicável a diferentes famílias de TFs e outros fatores de ligação à cromatina na levedura. O ChEC-seq é vantajoso porque não requer reticulação, solubilização da cromatina ou anticorpos. Assim, o ChEC evita artefactos potencialmente presentes no X-ChIP-seq, como o artefato 3 , 4 e o Chip nativo hiper-ChIPable, como os falsos negat...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos Moustafa Saleh e Jay Tourigny pela leitura crítica do manuscrito e Steven Hahn e Steven Henikoff para orientação e apoio durante o desenvolvimento do ChEC-seq e sua aplicação ao complexo do Mediador. O SG é suportado por concessões do NIH R01GM053451 e R01GM075114 e GEZ é suportado pelos fundos de inicialização da Universidade de Indiana.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
dNTPsNEBN0447
Q5 high-fidelity DNA polymeraseNEBM0491LOther high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification.
TrackIt 1 Kb Plus DNA ladderThermoFisher Scientific10488085
Taq DNA polymeraseNEBM0273L
cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktailSigma-Aldrich11836170001It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit MNase cleavage by chelation of Ca2+.
PMSFACROS OrganicsAC215740010
Digitonin, High PurityEMD Millipore300410-250MGMake a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing.
Proteinase K, 20 mg/mLInvitrogen25530049
RNase A, 10 mg/mLThermoFisher ScientificEN0531
Ampure XP beadsBeckman CoulterA63880Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24).
MagneSphere magnetic rackPromegaZ5342

Referências

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