Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تصف هذه الورقة رنا مفصلة وفعالة للغاية في بروتوكول التهجين الموضعي وخاصة بالنسبة لمستوى منخفض الجينات مستقبلات رائحة، فضلا عن الجينات الأخرى، في هوائيات الحشرات باستخدام ديجوكسيجينين (ديغ) - الملصقة أو تحقيقات المسمى البيوتين.

Abstract

وقد طورت الحشرات أنظمة استقبال شمية متطورة لتشعر بإشارات كيميائية خارجية. يتم ترانزدوسد هذه الإشارات الكيميائية من قبل الخلايا العصبية مستقبلات الشمية (أورنز) الموجود في هياكل تشبه الشعر، ودعا تشيموسنسيلا، من الهوائيات. على الأغشية أورنس، ويعتقد أن مستقبلات أودورانت (أورس) أن تشارك في ترميز الرائحة. وبالتالي، فإن القدرة على تحديد الجينات المترجمة إلى أورن ضروري للاعتراف أو الجينات، ويوفر أساسا أساسيا لمزيد من الدراسات الوظيفية في الموقع . مستويات التعبير الحمض النووي الريبي من أور أور محددة في هوائيات الحشرات منخفضة جدا، والحفاظ على الأنسجة الحشرية للأنسجة هو التحدي. وبالتالي، فإنه من الصعب توطين أور إلى نوع معين من سنسيلا باستخدام الحمض النووي الريبي في التهجين الموضع . في هذه الورقة، يتم عرض رنا مفصلة وفعالة للغاية في بروتوكول التهجين الموضعي وخاصة بالنسبة منخفضة التعبير أو الجينات من الحشرات. بالإضافة إلى ذلك، أور محددة جين واs التي تم تحديدها عن طريق إجراء مزدوجة اللون الفلورسنت في الموقع التهجين التجارب باستخدام المشترك التعبير عن الجينات مستقبلات، أوركو ، كعلامة.

Introduction

يتم تغطية هوائيات الحشرات، والتي هي أهم الأجهزة الحسية الكيميائية، مع العديد من الهياكل تشبه الشعر - دعا سنسيلا - التي يتم إدارتها من قبل الخلايا العصبية مستقبلات الشمية (أورنس). على غشاء أورنس الحشرات، يتم التعبير عن مستقبلات أودورانت (أورس)، وهو نوع من البروتين يحتوي على سبعة مجالات الغشاء، مع كورسيبتور (أوركو) لتشكيل هيتيرومر الذي يعمل كقناة أيون الرائحة بوابات 1 ، 2 ، 3 . استجابات مختلفة تستجيب لمجموعات مختلفة من المركبات الكيميائية 4 ، 5 ، 6 .

الجراد ( لوكستا ميغراتوريا ) تعتمد أساسا على العظة حاسة الشم لتحريك السلوكيات الهامة 7 . الجراد الصحراوي الجراد هي العوامل الرئيسية لفهم آليات الشمية الجزيئية. إضفاء الطابع المحلي على الجينات أو الجينات المحددة على الخلايا العصبيةنوع سينسيلوم محددة شكليا من قبل الحمض النووي الريبي في الموقع التهجين (رنا إيش) هو الخطوة الأولى في استكشاف وظيفة أورس.

يستخدم رنا إيش التحقيق المسمى الحمض النووي الريبي التكميلي لقياس وتوطين تسلسل الحمض النووي الريبي معين في قسم من الأنسجة والخلايا أو يتصاعد كله في الموقع ، وتوفير رؤى في العمليات الفسيولوجية والمرض المرضية. وقد استخدمت على نطاق واسع ديغوكيجينين المسمى (ديغ المسمى) وتحقيقات رنا البيوتين المسمى على نطاق واسع في التهجين الحمض النووي الريبي. يمكن إعداد رنا وضع العلامات مع ديغوكيجينين-11-أوتب أو البيوتين 16-أوتب عن طريق النسخ في المختبر مع SP6 و T7 رنا بوليميراز. DIG- والبيوتين المسمى الحمض النووي الريبي تحقيقات لها المزايا التالية: غير المشعة. آمنة؛ مستقرة. حساس للغاية؛ محددة للغاية؛ وسهلة لإنتاج باستخدام ير والنسخ في المختبر . DIG- وبيوتين المسمى رنا تحقيقات يمكن أن يكون الكروموجيني وكشف فلورزنتلي. يمكن الكشف عن تحقيقات رنا المسمى ديغ مع مكافحة ديغوكيجينين القلوين فوسفاتيز (أب) الأجسام المضادة -conjugated التي يمكن تصور إما مع ركائز تشيميلومينسنت حساسة للغاية نيتروبلو كلوريد تيترازوليوم / 5 برومو 4-كلورو 3-إندوليل الفوسفات الملح التولودين (نبت / بسيب) باستخدام المجهر الضوئي أو مع 2 -hydroxy-3-نفتوك أسيد-2'-فنيلانيليد الفوسفات (هنب) إلى جانب 4-كلورو-2-ميثيل بنزينزيونيوم نصف كلوريد الزنك الملح (سريع الأحمر) باستخدام المجهر متحد البؤر. يمكن الكشف عن تحقيقات رنا البيوتين المسمى مع مكافحة البيوتين ستريبتافيدين الفجل الحصان البيروكسيديز (هرب) الأجسام المضادة -conjugated التي يمكن تصور مع فلوريسئين-تيراميدس باستخدام المجهر متحد البؤر. وهكذا، يمكن أن يؤديها ثنائي اللون الفلورسنت في التهجين الموضعي للكشف عن اثنين من الجينات المستهدفة في شريحة واحدة باستخدام DIG- والبيوتين المسمى الحمض النووي الريبي تحقيقات.

وقد استخدمت إيش رنا مع DIG- و / أو تحقيقات البيوتين المسمى بنجاح لتوطين الجينات ذات الصلة حاسة الشم، مثل أور ، مستقبلات المؤلمة، بروتين ملزمة الرائحةوبروتين غشاء الخلايا العصبية الحسية، في هوائيات الحشرات، ولكن ليس على سبيل الحصر، ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر ، الأنوفيلة غامبيا ، L. ميغراتوريا والجراد الصحراوي ششيستوسيرا غريغاريا 8 ، 9 ، 10 ، 11 ، 12 ، 13 ، 14 ، 15 ، 16 . ومع ذلك، هناك اثنين من التحديات الكبيرة عند تنفيذ إيش الحمض النووي الريبي ل أورس الحشرات: (1) أو الجينات (باستثناء أوركو ) وأعرب عن مستويات منخفضة وفقط في عدد قليل من الخلايا، مما يجعل الكشف عن إشارة صعبة للغاية، و (2) الحفاظ على الأنسجة الحشرات ل الأنسجة، بحيث يتم الحفاظ على التشكل والضجيج الخلفية منخفضة، يمكن أن يكون تحديا. في هذا البحث ورقة مفصلة وفعالة تصف إيش الحمض النووي الريبي لتوطين أو الجينات في الحشراتيتم عرض هوائيات، بما في ذلك كل من كروموجينيك وتيراميد إشارة التضخيم (تسا) الكشف.

Protocol

ملاحظة: للحد من تدهور الحمض النووي الريبي، وإعداد الحلول باستخدام الماء المقطر تعقيمها الرطبة (عند 121 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة) وأيضا مواد الأوتوكلاف الرطب.

1. إعداد الحمض النووي الريبي إيش التحسس والمسببات تحسس

  1. الهدف التضخيم الجيني وتنقية
    1. أولا، تنتج 387 نقطة أساس مزدوجة تقطعت بهم السبل جزء من L. ميغراتوريا OR1 ( LmigOR1 ، بنك الجينات: JQ766965) من البلازميد التي تحتوي على كامل كدنا من LmigOR1 مع البلمرة دنا طق أن يضيف أدينين إلى كلا طرفي شظايا.
      1. استخدام 100 ميكرولتر حجم رد الفعل النهائي، التي تحتوي على 50 ميكرولتر من مزيج رد فعل 2X، 4 ميكرولتر لكل من الاشعاعات والرموز المضادة ( الجدول 1 )، 1 ميكرولتر من قالب البلازميد، و 41 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية H 2 O. استخدام ير التالية بروتوكول: 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، تليها 30 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، تليها 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
      2. كرر هذه الخطوات لإنتاج جزء من ال 1230 بب ثنائي السلك من LmigOR2 (بنك الجينات: JQ766966) و 1،251 نقطة أساس مزدوجة تقطعت بهم السبل جزء من لميغوركو (بنك الجينات: JN989549). يتم عرض الاشعال المستخدمة في هذه التجارب في الجدول 1 .
      3. تشغيل المنتجات ير على المواد الهلامية الاغاروز 1.2٪ في 1X تريس-أسيتات-إدتا العازلة وتصور باستخدام إثيديوم بروميد تلطيخ.
    2. استخراج هذه المنتجات ير باستخدام مجموعة استخراج هلام.
      1. بعد الكهربائي، العصابات الحمض النووي استئصال من هلام ووضع شرائح هلام في أنبوب 1.5 مل. ثم، إضافة 100 ميكرولتر من العازلة ملزمة (عازلة ين) لكل 0.1 غرام من شريحة هلام. دوامة واحتضان عند 50 درجة مئوية حتى يتم حل شريحة هلام تماما.
      2. إدراج عمود الامتصاص CA2 في أنبوب جمع وإضافة 500 ميكرولتر من العازلة التوازن (العازلة بل). هذا يحسن القدرة على امتصاص واستقرار غشاء السيليكا. Centriفوج في 12400 x ج لمدة 1 دقيقة.
      3. نقل خليط هلام الذائبة إلى التجمع العمود الامتزاز واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة. ثم، أنابيب الطرد المركزي في 12،400 x ج لمدة 1 دقيقة. تجاهل تدفق من خلال وإعادة إدراج عمود الامتزاز في أنبوب جمع.
      4. إضافة 600 ميكرولتر من محلول غسل (وأضاف الإيثانول، العازلة بو) مرتين. أجهزة الطرد المركزي في 12400 x ج لمدة 1 دقيقة. تجاهل تدفق من خلال وإعادة إدراج عمود الامتزاز في أنبوب جمع.
      5. إفراغ أنبوب جمع و ريسريفوج عمود التجميع في 12400 x ج لمدة 2 دقيقة للسماح التبخر من أي الإيثانول المتبقية.
      6. نقل بعناية عمود الامتزاز إلى 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي نظيفة. الهواء الجاف بيليه لمدة 5-10 دقيقة، ويعيد حل الحمض النووي في حجم مناسب (على سبيل المثال، 30 ميكرولتر) من نوكليس خالية من المياه.
      7. احتضان في رت لمدة 2 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي في 12،400 x ج لمدة 2 دقيقة. تجاهل عمود الامتصاص وتخزين الحمض النووي في 4 درجات مئوية أو -20 درجة مئوية.
  2. بناء البلازميدات المؤتلف
    1. بشكل فردي ليغات جزء 387 بب من LmigOR1 ، 1،303 جزء من شظايا LmigOR2 و 1،251 جزء من شظايا لميغوركو إلى متجه T الذي يحتوي على المروجين ل T7 (المنبع) و SP6 (المصب) بوليمرات الحمض النووي الريبي المتاخمة للحمض النووي المدرجة باستخدام T4 الحمض النووي ليغاز. إعداد رد فعل 10 ميكرولتر التالية: 5 ميكرولتر من العازلة ربط 2X، 1 ميكرولتر من متجه T، 3 ميكرولتر (~ 100 نانوغرام) من الحمض النووي الجينات المدرجة و 1 ميكرولتر من ليغاز الحمض النووي T4، واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية.
    2. إضافة 5 ميكرولتر من كل البلازميد المؤتلف التي تحتوي على جزء 387 بب من LmigOR1 ، 1،303 جزء من شظايا LmigOR2 و 1،251 جزء بب من لميغوركو بشكل منفصل إلى 50 ميكرولتر من الخلايا القولونية DH5α المختصة في العقيمة 1.5 مل أنابيب.
      1. مزيج بلطف ووضع الأنابيب في الجليد لمدة 30 دقيقة ثم احتضان لهم لمدة 90 ثانية في 42° C. نقلها مرة أخرى إلى الجليد لمدة 3 دقائق.
      2. إضافة 450 ميكرولتر من لوريا-بيرتاني (لب) وسط السائل دون أمبيسيلين إلى كل أنبوب واحتضان لهم في شاكر في 150 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية لاستعادة E. القولونية DH5α.
      3. أخذ قسامة 100 ميكرولتر من كل المحولات واستخدامها لتطعيم لب الركيزة الصلبة لوحات تحتوي على 50 ميكروغرام / مل الأمبيسلين، 24 ميكروغرام / مل الآيزوبروبيل β-D-1-ثيوغالاكتوبيرانوسيد (إيبت)، و 40 ميكروغرام / مل 5-برومو-4 كلورو-3-إندوليل-β-D-غالاكتوبيرانوسيد (X-غال).
      4. احتضان هذه اللوحات في حاضنة ثابتة عند 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة. شاشة البلازميدات المؤتلف الهدف باستخدام طريقة الفحص الأزرق والأبيض. تسلسل البلازميدات المؤتلف الهدف باستخدام تسلسل سانجر وتحديد ثلاثة أور الجينات إدراج الاتجاهات.
  3. حدد إندونوكليسيس تقييد لخطي البلازميدات المؤتلف
    1. استخدام إندونوكليسيس تقييد tقبعة هضم ليس فقط في موقع الاستنساخ متعددة من ناقلات ولكن أيضا لا قطع الحمض النووي إدراج. في هذه التجربة، يتم إدراج جميع الجينات 3 في ناقلات T في الاتجاه المقابل لتلك المتجه.
    2. استخدام نكو I إندونوكلياز تقييد لخطي البلازميدات المؤتلف التي تحتوي على جزء 387 بب من LmigOR1 ، 1،303 جزء من شظايا LmigOR2 و 1،251 جزء من شظايا لميغوركو لإنتاج تحقيقات المكافحة . استخدام سب e I إندونوكلياز تقييد لإنتاج تحقيقات الشعور.
      ملاحظة: إذا كان الاتجاه إدراج يتوافق مع المتجه، ثم يتم تحديد موقع تقييد فريد من نهاية T7 لخطي البلازميد المؤتلف و SP6 رنا بوليميراز يستخدم لتحضير مسبار مضاد للحساسية. يتم تحديد موقع تقييد فريد من نهاية SP6 لخطي البلازميد المؤتلف، ويستخدم البوليميراز T7 رنا لإعداد مسبار المعنى. وإلا، إذا كان اتجاه الإدراج لا يتوافق مع tهو اتجاه ناقلات، ثم يتم تحديد موقع تقييد فريد من نهاية SP6 لخطي البلازميد المؤتلف ويستخدم T7 رنا بوليميراز لإعداد مسبار مضاد للحساسية. يتم تحديد موقع تقييد فريد من نهاية T7 لخطي البلازميد المؤتلف، ويستخدم SP1 رنا بوليميراز لإعداد التحقيق المعنى.
  4. تنقية البلازميدات المؤتلف الخطي
    1. ملخص 20 ميكروغرام لكل من البلازميدات المؤتلف ثلاثة تحتوي على جزء 387 نقطة أساس من LmigOR1، 1303 سنة مضت جزء من LmigOR2 و1،251 سنة مضت جزء من LmigORco باستخدام تقييد نوكلياز داخلية ضابط صف أنا في تفاعل 100 ميكرولتر أن يحتوي على 10 ميكرولتر من 10X العازلة، 40 ميكرولتر من 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر البلازميد، 3 ميكرولتر من ضباط الصف الأول و47 ميكرولتر من ريبونوكلياز الحرة-H 2 O، تليها الحضانة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية.
    2. وبالمثل، هضم 20 ميكروغرام من كل من هذه البلازميدات المؤتلف ثلاثة شالغناء تقييد نوكلياز داخلية جمعية مهندسي البترول I.
    3. تنقية هذه البلازميدات هضمها باستخدام مجموعة استخراج هلام كما هو موضح في 1.1.2. تحديد تركيزات هذه المستخلصات البلازميدات المؤتلف الخطي بواسطة الطيفي وضبط 0.5 ميكروجرام / ميكرولتر.
  5. إعداد تحقيقات الحسية والمعنى
    1. استخدام نظام النسخ T7 / SP6 الحمض النووي الريبي لتوليد المجسات المضادة للحساسية والشعور. يستخدم SP6 الحمض النووي الريبي البلمرة لنسخ الحمض النووي الريبي المزدوج تقطعت بهم السبل ل DIG- والبيوتين المسمى المكابس المضادة للجينات لهذه الجينات ثلاثة أور باستخدام البلازميدات المؤتلف الخطي كنماذج في المختبر . يتم استخدام بوليميراز رنا T7 لإنتاج تحقيقات الشعور. أداء التفاعل في 20 ميكرولتر الحجم النهائي، التي تحتوي على 2 ميكرولتر من مزيج نتب 10X، 2 ميكرولتر من 10X عازلة النسخ، 1 ميكرولتر من المانع ريبونوكلياز، 2 ميكرولتر من T7 أو SP6 رنا بوليميراز، 4 ميكرولتر من 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر البلازميد الخطي و 9 ميكرولتر خالية من ريبونوكلياز H 2 O، تليهابواسطة حضانة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية.
    2. احتضان DIG- والبيوتين المسمى المضاد والشعور تحقيقات لمدة 30 دقيقة مع 1 ميكرولتر الدناز في 37 درجة مئوية. إضافة 2.5 ميكرولتر من 5 M ليكل و 75 ميكرولتر من الايثانول المطلق، ثم احتضان ردود الفعل لمدة 30 دقيقة في -70 درجة مئوية.
    3. أجهزة الطرد المركزي في 15،000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. صبغ بعناية طاف. إضافة 150 ميكرولتر من الايثانول 70٪ لغسل مرسب. إعداد الايثانول 70٪ (1 لتر) بإضافة 95٪ من الإيثانول (736.8 مل) إلى الماء المقطر المعقم (263.2 مل).
    4. أجهزة الطرد المركزي في 15،000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية مرة أخرى والهواء الجاف بيليه لمدة 5-10 دقيقة في رت. إضافة 25 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية H 2 O إلى حل الحمض النووي الريبي المضادات والمسببات الشعور.
    5. إذا كان طول الجين إدراج أطول من 1 كيلو بايت، في وقت لاحق جزء الحمض النووي الريبي المضاد والحس تحقيقات لمتوسط ​​طول ~ 300 بب في الحضانة في حلول كربونات كربونات كربونات. أداء رد فعل في 50 ميكرولتر الحجم النهائي، جالحصول على 25 ميكرولتر من التحقيق الحمض النووي الريبي و 25 ميكرولتر من محلول العازلة كربونات كربونات (80 ملي ناهكو 3 ، 120 ملي نا 2 كو 3 ، ودرجة الحموضة 10.2) عند 60 درجة مئوية. ويعطى وقت التحلل المطلوب من الصيغة التي تم نشرها سابقا 17 .
    6. إضافة 5 ميكرولتر من حمض الخليك 10٪ لوقف رد فعل. في هذه التجربة، شظية LmigOR2 و لميغوركو تحقيقات المكافحة والحس لمدة 24 و 23 دقيقة، على التوالي.
      t = (L o -L f ) / ككسل o زل f
      L o = أطوال الشظايا الأولية بالكيلو بايت
      L f = أطوال الشظايا النهائية في كيلو بايت
      k = ثابت معدل التحلل المائي، حوالي 0.11 كيلو بايت -1 دقيقة -1
      t = الوقت التحلل في دقيقة
    7. وأخيرا، إضافة 250 ميكرولتر من العازلة التهجين وتخزينها في -80 درجة مئوية.

2. إعداد أقسام البرد

  1. بريكول و فريزينغ مشراح إلى -24 درجة مئوية.
  2. حدد الجراد الكبار الجرح النشط التي هي نشطة ولها هوائيات سليمة. قطع الهوائيات إلى قطع 2-3 ملم باستخدام شفرات الحلاقة المعقمة.
  3. وضع مجمع أكتوبر على حامل مشراح تجميد ووضع واحد أو اثنين من العينات على المجمع أفقيا. ثم، نقل حامل في مشراح تجميد في -24 درجة مئوية لتتوازن حتى يتجمد المجمع. إخراج حامل وتغطية العينات مع القليل من المركب. نقل حامل في مشراح تجميد في -24 درجة مئوية مرة أخرى لمدة لا تقل عن 10 دقيقة ( الشكل 1 ).
    ملاحظة: تجنب الحصول على فقاعات في المجمع.
  4. إصلاح حامل مع العينات في مشراح تجميد، ثم قسم العينات المجمدة في 12 ميكرون سميكة شرائح في -24 درجة مئوية.
  5. ذوبان الجليد جبل شرائح واحدا تلو الآخر على الشرائح (25 × 75 مم؛ نوكليس خالية) والهواء الجاف لمدة 10 دقيقة.

3. تحديد الأقسام

  1. بعد إعداد البردأقسام، ووضع الشرائح في حاوية بلاستيكية (~ 100 × 40 × 80 ملم)، وإصلاح الأنسجة عن طريق احتضان الشرائح في الحل بارافورمالدهيد 4٪ (بفا) لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  2. غسل الشرائح في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (بس) لمدة 1 دقيقة.
  3. للقضاء على البروتينات القلوية، ونقل الشرائح إلى 0.2 M حمض الهيدروكلوريك لمدة 10 دقيقة.
  4. للقضاء على البروتين السطح من الحمض النووي، ونقل الشرائح إلى 1XPBS مع 1٪ تريتون X-100 لمدة 2 دقيقة.
  5. غسل الشرائح مرتين لمدة 30 ثانية في برنامج تلفزيوني 1X.
  6. أخيرا، شطف الشرائح في حل فورماميد لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.

4. التهجين

  1. إعداد مسبار المضاد والشعور
    1. استخدام العازلة التهجين لتمييع الحمض النووي الريبي المضاد أو تحقيقات في أنابيب 1.5 مل نوكليس خالية. في هذه التجربة، لجميع المجسات المضادة للحساسية والشعور ( LmigOR1، LmigOR2، و لميغوركو )، إضافة 1 ميكرولتر من التحقيق إلى 99 μL التهجين العازلة في الشريحة. عموما، استخدام التخفيفات 1: 100 من تحقيقات مضادة تنتج إشارات إيجابية كبيرة وخلفيات منخفضة باستخدام هذا البروتوكول.
    2. للكشف عن الكروموجين، تمييع تحقيقات ديغ المسمى بشكل فردي.
    3. للكشف عن TSA، وتمييع DIG المسمى LmigOR1 مع تحقيقات LmigOrco المسمى البيوتين أو المسمى DIG-LmigOR2 مع المسمى البيوتين LmigOR1 تحقيقات معا في المنطقة العازلة التهجين.
    4. تسخين التخفيفات لمدة 10 دقيقة عند 65 درجة مئوية ووضعها على الجليد لمدة لا تقل عن 5 دقائق.
  2. تهجين
    1. استنزاف الشرائح وإضافة 100 ميكرولتر من المخفف المخفف والمسبار الشعور (الخطوة 4.1) إلى أقسام الأنسجة. ثم، كوفرسليبس مكان (24 مم × 50 مم؛ نوكليس خالية) على أقسام الأنسجة.
    2. وضع الشرائح المغطاة أفقيا في مربع رطب (~ 300 × 180 × 50 مم 3 ؛ الشكل 2 ) واحتضانt 55 درجة مئوية لمدة 22 ساعة. إضافة حل فورماميد أو برنامج تلفزيوني 1X إلى الجزء السفلي من مربع للحفاظ على البيئة رطبة، ولكن لا تغمر الشرائح في السائل.
  3. غسل ومنع.
    1. بعد التهجين، وإزالة كوفرسليبس بعناية. غسل الشرائح مرتين لمدة 30 دقيقة في 0.1X سترات الصوديوم المالحة (سك) عند 60 درجة مئوية.
      ملاحظة: الغسل يعني وضع الشرائح في حامل الشريحة التي يتم وضعها بعد ذلك في وعاء من البلاستيك ويهيج بلطف على الروك (~ 50 دورة في الدقيقة، الشكل 2 ).
    2. شطف الشرائح في 1X تريس-بوفيرد المالحة (تبس) لمدة 30 ثانية.
    3. إضافة 1 مل من 1٪ كاشف حجب في تبس تستكمل مع 0.03٪ تريتون X-100 على كل شريحة، واحتضان لمدة 30 دقيقة. ثم، تجاهل الحل عرقلة.
  4. المناعية.
    1. للكشف عن الكروموجين، واستخدام كاشف حظر في تبس لتمييع 750 وحدة (U) / مل مكافحة ديغوكيجينين AP- مترافق أنتيبودي إلى 1.5 U / مل حل أب. إضافة 100 ميكرولتر من حل أب لكل مغطاة (24 مم × 50 ملم) الشريحة.
    2. للكشف تسا، واستخدام كاشف حظر في تبس لتخفيف 750 U / مل من الأجسام المضادة المضادة ديغوكيجينين AP- مترافق ومكافحة البيوتين ستريبتافيدين الأجسام المضادة مترافق HRP- إلى الحل أب / هرب. إضافة 100 ميكرولتر من الحل أب / هرب لكل مغطاة (24 مم × 50 مم) الشريحة.
    3. احتضان الشرائح في مربع رطب ( الشكل 2 ) لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية. استخدام حل فورماميد أو برنامج تلفزيوني 1X للحفاظ على مربع رطبة ولكن ليس خبيث.

5. تلطيخ

  1. إزالة كوفرسليبس بعناية. غسل الشرائح ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في تبس 1X تستكمل مع 0.05٪ توين 20. شطف الشرائح في داب العازلة (الكشف اللوني: الرقم الهيدروجيني 9.5؛ كشف تسا: الرقم الهيدروجيني 8.0) لمدة 5 دقائق.
  2. تلطيخ (كشف كروموجينيك)
    1. إضافة 100 ميكرولتر من نبت (375 ميكروغرام / مل) / بسيب (188 ميكروغرام / مل) محلول الركيزة (المخفف في داب.الرقم الهيدروجيني 9.5) إلى كل شريحة. وضع كوفرسليبس بعناية (24 × 50 ملم) على الشرائح.
    2. احتضان الشرائح في مربع رطب مع حل الركيزة لمدة 10 دقيقة - O / N عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: تحقق من التنمية من خلال النظر في الشرائح من وقت لآخر تحت المجهر.
    3. عندما تكون التنمية جاهزة، وقف رد فعل عن طريق نقل الشرائح في الماء.
  3. تلطيخ (كشف تسا)
    1. استخدام حقنة لنقل هنب (100 ميكروغرام / مل) / سريع الأحمر (250 ميكروغرام / مل) الركيزة من مرشح حقنة (0.22 ميكرون؛ الشكل 2 ).
    2. إضافة 100 ميكرولتر من هنب / الركيزة الحمراء السريعة في كل شريحة مغطاة ساترة (24 × 50 مم). احتضان الشرائح لمدة 30 دقيقة مع هنب / الركيزة الحمراء السريعة في رت.
    3. إزالة كوفرسليبس بعناية، وغسل الشرائح ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في تبس 1X تستكمل مع 0.05٪ توين -20.
    4. استخدام 100 ميكرولتر من الركيزة تسا / مغطاة (24 × 50 مم 2 ) الشريحة. احتضان الشرائح مع الركيزة تسا لمدة 10 دقيقة في رت.
    5. إزالة كوفرسليبس بعناية، وغسل الشرائح ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في تبس 1X تستكمل مع 0.05٪ توين -20.
  4. تضمين الشرائح في برنامج تلفزيوني / الجلسرين (1: 3).
    ملاحظة: بعد الانتهاء من هذه الإجراءات، ينبغي مراعاة الشرائح في أقرب وقت ممكن لأن إشارة الفلورسنت سوف يطفئ بسرعة.

6 - الملاحظة

  1. كشف الكروموجينيك
    1. مراقبة أقسام الأنسجة باستخدام المجهر الضوئي. اختيار العدسات الهدف 10X، 20X، و 40X لمراقبة نتائج الكشف الكروموجينيك.
    2. استخدام برنامج دب-بسو لتحليل النتائج والتقاط الصور.
  2. كشف تسا
    1. مراقبة أقسام الأنسجة باستخدام المجهر متحد البؤر. وينبغي ملاحظة الجينات المسمى ديغ تحت 543 ضوء نانومتر، وتقديم اللون الأحمر، ويجب أن تكون الجينات المسمى بيوتينلوحظ تحت 488 نانومتر الضوء، وتقديم اللون الأخضر. عندما تظهر، فإنها تقدم اللون الأصفر.
    2. اختيار العدسات الهدف 20X و 40X لمراقبة نتائج الكشف تسا، على التوالي.
    3. استخدام برنامج FV1000 لتحليل النتائج والتقاط الصور.

النتائج

مع الكشف الكروموجيني، تم تعيين مجموعة فرعية صغيرة من خلايا أنتينال في كل قسم أنتينال الكبار من قبل LmigOR1 ديغ المسمى و LmigOR2 تحقيقات مضادات ( الشكل 3 ). رنا إيش على أقسام متتالية لتوطين LmigOR1 و LmigOR2 أظهرت أن خلاي...

Discussion

من الصعب إجراء رنا إيش لتوطين أو جينات في هوائيات الحشرات لأن مستويات التعبير من الجينات أور، باستثناء أوركو ، منخفضة جدا والحفاظ على شرائح نسيجية من هوائيات الحشرات من الصعب جدا. وبالإضافة إلى ذلك، كشف تسا هو أيضا صعبة جدا. ولمعالجة هذه المشاكل، ينبغي اتخاذ الت...

Disclosures

المؤلفين ليس لديهم ما يكشف أو أي تضارب المصالح الأخرى.

Acknowledgements

ويدعم هذا العمل من منحة من مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية في الصين (No.31472037). إن ذكر الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية في هذه المقالة هو فقط لغرض تقديم معلومات محددة ولا يعني التوصية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Materials
2×TSINGKETM Master MixTSINGKE, ChinaTSE004
RNase-free H2OTIANGEN, ChinaRT121-02
REGULAR AGAROSE G-10BIOWEST, SPAIN91622
Binding bufferTIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, ChinaDP209-02
Balance bufferTIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, ChinaDP209-02
Wash solutionTIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, ChinaDP209-02
T VectorPromega, USAA362A
T4 DNA LigasePromega, USAM180A
Escherichia coli DH5αTIANGEN, ChinaCB101
AmpicillinSigma, USAA-6140
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosideInalco, USA1758-1400
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranosideSBS Genetech, ChinaGX1-500
Nco IBioLabs, New EnglandR0193S
Spe IBioLabs, New EnglandR0133M
DIG RNA Labeling KitRoche, Switzerland11175025910
Biotin RNA Labeling KitRoche, Switzerland11685597910
DNaseDIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland11175025910
LiClSinopharm, China10012718
EthanolSinopharm, China10009257
Acetic acidBEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China10000292
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands4583
SlidesTINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, ChinaFISH0010
HClSinopharm, China80070591
MillexMillipore, USASLGP033RS
Tween 20AMRESCO, USA0777-500ML
Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine saltRoche, Switzerland11175041910
GlycerolSinopharm, China10010618
NameCompanyCatalog NumberComments
Solutions
1×Tris-acetate-EDTASigma, USAV900483-1KG0.04mol/L Tris-Base
1×Tris-acetate-EDTABEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China100002920.12%acetic acid
1×Tris-acetate-EDTASigma, USA03677Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)
Luria-Bertani (LB) liquid mediumSinopharm, China1001939210g/L NaCl
Luria-Bertani (LB) liquid mediumMERCK, GermanyVM33523110g/L Peptone from casein (Tryptone)
Luria-Bertani (LB) liquid mediumMERCK, GermanyVM3615265g/L Yeast extract
LB solid substrate plateSinopharm, China1001939210g/L NaCl
LB solid substrate plateMERCK, GermanyVM33523110g/L Peptone from casein (Tryptone)
LB solid substrate plateMERCK, GermanyVM3615265g/L Yeast extract
LB solid substrate plateWISENT ING, Canada800-010-CG15g/L Agar Bacteriological Grade
10×phosphate buffer saline (pH7.1)Sinopharm, China100193928.5%NaCl
10×phosphate buffer saline (pH7.1)Sigma, USAV900041-500G14mM KH2PO4
10×phosphate buffer saline (pH7.1)Sigma, USAV900268-500G80mM Na2HPO4
10×Tris buffered saline (pH7.5)Sigma, USAV900483-1KG1M Tris-Base
10×Tris buffered saline (pH7.5)Sinopharm, China100193921.5M NaCl
Detection Buffer (DAP)       chromogenic detection pH9.5       TSA detection pH8.0Sigma, USAV900483-1KG100mM Tris-Base
Detection Buffer (DAP)       chromogenic detection pH9.5       TSA detection pH8.0Sinopharm, China10019392100mM NaCl
Detection Buffer (DAP)       chromogenic detection pH9.5       TSA detection pH8.0Sigma, USAV900020-500G50mM MgCl2·6H2O
20×saline-sodium citrate (pH7.0)Sinopharm, China100193923M NaCl
20×saline-sodium citrate (pH7.0)Sigma, USAV900095-500G0.3M Na-Citrate
4% paraformaldehyde solution (pH9.5)Sigma, USAV900894-100G4% paraformaldehyde
4% paraformaldehyde solution (pH9.5)Sigma, USAV900182-500G0.1M NaHCO3
Sodium Carbonate Buffer (pH10.2)Sigma, USAV900182-500G80mM NaHCO3
Sodium Carbonate Buffer (pH10.2)Sigma, USAS7795-500G120mM Na2CO3
Formamide Solution (pH10.2)MPBIO, USAFORMD00250% Deionized Formamide
Formamide Solution (pH10.2)5×saline-sodium citrate
Blocking Buffer in Tris buffered salineRoche, Switzerland111750419101% Blot
Blocking Buffer in Tris buffered salineAMRESCO, USA0694-500ML0.03% Triton X-100
Blocking Buffer in Tris buffered saline1×Tris buffered saline
Alkaline phosphatase solutionRoche, Switzerland111750419101.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody
Alkaline phosphatase solutionBlocking Buffer in Tris buffered saline
Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solutionRoche, Switzerland111750419101.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody
Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solutionTSA kit, Perkin Elmer, USANEL701A001KT1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody
Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solutionBlocking Buffer in Tris buffered saline
Hybridization BufferMPBIO, USAFORMD00250% Deionized Formamide
Hybridization Buffer2×saline-sodium citrate
Hybridization BufferSigma, USAD8906-50G10% dextran sulphate
Hybridization Bufferinvitrogen, USAAM711920 µg/ml yeast t-RNA
Hybridization BufferSigma, USAD3159-10G0.2 mg/ml herring sperm DNA
2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrateRoche, Switzerland117588880011% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate (10mg/ml)
2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrateRoche, Switzerland117588880011% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25mg/ml)
2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrateDetection Buffer
Tyramide signal amplification substrateTSA kit, Perkin Elmer, USANEL701A001KT2% fluorescein-tyramides
Tyramide signal amplification substrateTSA kit, Perkin Elmer, USANEL701A001KTAmplification Diluent
NameCompanyCatalog NumberComments
Instrument
Freezing microtomeLeica, Nussloch, GermanyJung CM300 cryostat
SpectrophotometerThermo SCIENTIFIC, USANANODROP 2000
Optical microscopeOlympus, Tokyo, JapanOlympus IX71microscope
Confocal microscopeOlympus, Tokyo, JapanOlympus BX45 confocal microscope

References

  1. Sato, K., et al. Insect olfactory receptors are heteromeric ligand-gated ion channels. Nature. 452 (7190), 1002-1006 (2008).
  2. Smart, R., et al. Drosophila odorant receptors are novel seven transmembrane domain proteins that can signal independently of heterotrimeric G proteins. Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 770-780 (2008).
  3. Wicher, D., et al. Drosophila odorant receptors are both ligand-gated and cyclic-nucleotide-activated cation channels. Nature. 452 (7190), 1007-1011 (2008).
  4. Carey, A. F., Wang, G., Su, C. Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464 (7258), 66-71 (2010).
  5. Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
  6. Wang, G., Carey, A. F., Carlson, J. R., Zwiebel, L. J. Molecular basis of odor coding in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4418-4423 (2010).
  7. Hassanali, A., Njagi, P. G., Bashir, M. O. Chemical ecology of locusts and related acridids. Annu Rev Entomol. 50, 223-245 (2005).
  8. Schaeren-Wiemers, N., Gerfin-Moser, A. A single protocol to detect transcripts of various types and expression levels in neural tissue and cultured cells: in situ hybridization using digoxigenin-labeled cRNA probes. Histochemistry. 100 (6), 431-440 (1993).
  9. Vosshall, L. B., Amrein, H., Morozov, P. S., Rzhetsky, A., Axel, R. A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna. Cell. 96 (5), 725-736 (1999).
  10. Yang, Y., Krieger, J., Zhang, L., Breer, H. The olfactory co-receptor Orco from the migratory locust (Locusta migratoria) and the desert locust (Schistocerca gregaria): identification and expression pattern. Int J Biol Sci. 8 (2), 159-170 (2012).
  11. Schultze, A., et al. The co-expression pattern of odorant binding proteins and olfactory receptors identify distinct trichoid sensilla on the antenna of the malaria mosquito Anopheles gambiae. PLoS One. 8 (7), e69412 (2013).
  12. Xu, H., Guo, M., Yang, Y., You, Y., Zhang, L. Differential expression of two novel odorant receptors in the locust (Locusta migratoria). BMC Neurosci. 14, 50 (2013).
  13. Saina, M., Benton, R. Visualizing olfactory receptor expression and localization in Drosophila. Methods Mol Biol. 1003, 211-228 (2013).
  14. Guo, M., Krieger, J., Große-Wilde, E., Mißbach, C., Zhang, L., Breer, H. Variant ionotropic receptors are expressed in olfactory sensory neurons of coeloconic sensilla on the antenna of the desert locust (Schistocerca gregaria). Int J Biol Sci. 10 (1), 1-14 (2013).
  15. You, Y., Smith, D. P., Lv, M., Zhang, L. A broadly tuned odorant receptor in neurons of trichoid sensilla in locust, Locusta migratoria. Insect Biochem Mol Biol. 79, 66-72 (2016).
  16. Jiang, X., Pregitzer, P., Grosse-Wilde, E., Breer, H., Krieger, J. Identification and characterization of two "Sensory Neuron Membrane Proteins" (SNMPs) of the desert locust, Schistocerca gregaria (Orthoptera: Acrididae). J Insect Sci. 16 (1), 33 (2016).
  17. Angerer, L. M., Angerer, R. C., Wilkinson, D. G. In situ. hybridization to cellular RNA with radiolabelled RNA probes. In situ hybridization. , 2 (1992).
  18. Komminoth, P., Merk, F. B., Leav, I., Wolfe, H. J., Roth, J. Comparison of 35S- and digoxigenin-labeled RNA and oligonucleotide probes for in situ hybridization. Expression of mRNA of the seminal vesicle secretion protein II and androgen receptor genes in the rat prostate. Histochemistry. 98 (4), 217-228 (1992).
  19. Leary, J. J., Brigati, D. J., Ward, D. C. Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing biotin-labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on nitrocellulose: Bio-blots. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (13), 4045-4049 (1983).
  20. Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Cell. 117 (7), 965-979 (2004).
  21. Jones, W. D., Nguyen, T. A., Kloss, B., Lee, K. J., Vosshall, L. B. Functional conservation of an insect odorant receptor gene across 250 million years of evolution. Curr Biol. 15 (4), R119-R121 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

125

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved