Localisation des gènes des récepteurs odorants dans les antennes acridiennes par ARN<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation

Résumé

Cet article décrit un protocole d'hybridation in situ ARN détaillé et hautement efficace, en particulier pour les gènes de récepteur à l'odorant (OR) à faible niveau, ainsi que d'autres gènes, dans les antennes d'insectes utilisant des sondes marquées par de la digoxigénine (DIG) ou biotinées.

Résumé

Les insectes ont développé des systèmes sophistiqués d'accueil olfactif pour détecter les signaux chimiques exogènes. Ces signaux chimiques sont transduits par Olfactory Receptor Neurons (ORN) logés dans des structures capillaires, appelées chemosensilla, des antennes. Sur les membranes des ORN, on pense que les récepteurs à l'odorant (OR) sont impliqués dans le codage des odeurs. Ainsi, être capable d'identifier les gènes localisés dans les ORN est nécessaire pour reconnaître les gènes OU, et constitue une base fondamentale pour d'autres études fonctionnelles in situ . Les niveaux d'expression d'ARN d' OR spécifiques dans les antennes d'insectes sont très faibles et la conservation des tissus d'insectes pour l'histologie est difficile. Ainsi, il est difficile de localiser un OR à un type spécifique de sensilla en utilisant l'hybridation in situ de l' ARN. Dans cet article, un protocole d'hybridation in situ ARN détaillé et très efficace, en particulier pour les gènes OU à faible expression des insectes, est introduit. En outre, un OR spécifique Gène waS identifiés en effectuant des expériences d'hybridation in situ fluorescentes à double couleur en utilisant un gène de récepteur coextratifiant, Orco , comme marqueur.

Introduction

Les antennes à insectes, qui sont les organes chimiosensibles les plus importants, sont recouvertes de nombreuses structures capillaires - appelées sensilla - qui sont innervées par les neurones récepteurs olfactifs (ORN). Sur la membrane des ORN d'insectes, les récepteurs odorants (OR), un type de protéine contenant sept domaines transmembranaires, sont exprimés avec un corecepteur (ORco) pour former un hétérother qui fonctionne comme un canal ionique ^{1 , 2 , 3} odorant-gated. Différentes OR répondent à différentes combinaisons de composés chimiques ^{4 , 5 , 6} .

Les langoustes ( Locusta migratoria ) s'appuient principalement sur des indices olfactifs pour déclencher des comportements importants ⁷ . Les OR sont des facteurs clés pour la compréhension des mécanismes moléculaires olfactifs. Localiser un gène spécifique OR acridien au neurone d'unLe type sensillum morphologiquement spécifique par ARN In Situ Hybridization (RNA ISH) est la première étape dans l'exploration de la fonction OR.

L'ARN ISH utilise une sonde d'ARN complémentaire marquée pour mesurer et localiser une séquence d'ARN spécifique dans une section de tissu, des cellules ou des montures entières in situ , fournissant des informations sur les processus physiologiques et la pathogenèse de la maladie. Les sondes d'ARN marquées à la digoxigénine (DIG-marquées) et à la biotine ont été largement utilisées dans l'hybridation d'ARN. L'étiquetage de l'ARN avec la digoxigénine-11-UTP ou la biotine-16-UTP peut être préparé par transcription in vitro avec des ARN polymérases SP6 et T7. Les sondes d'ARN marquées par DIG et biotine présentent les avantages suivants: non radioactifs; sûr; stable; très sensible; Très spécifique; Et facile à produire en utilisant la PCR et la transcription in vitro . Les sondes d'ARN marquées par des DIG et des biotines peuvent être détectées de manière chromogène et fluorescente. Les sondes d'ARN marquées par DIG peuvent être détectées avec de l'anti-digoxigénine AlkaliNe phosphatase (AP) - anticorps conjugués qui peuvent être visualisés soit avec des substrats chimioluminescents très sensibles, chlorure de nitroblue tétrazolium / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine (NBT / BCIP) en utilisant un microscope optique ou avec 2 -hydroxy-3-naphtoïque-2'-phénylanilide phosphate (HNPP) couplé au sel de chlorure de hemi-zinc de 4-chloro-2-méthylbenzènediazonium (Fast Red) en utilisant un microscope confocal. Les sondes d'ARN marquées par la biotine peuvent être détectées avec des anticorps conjugués anti-biotine et streptavidine avec des peroxydases de pistax (HRP) qui peuvent être visualisés avec des fluorescéine-tyramides à l'aide d'un microscope confocal. Ainsi, une hybridation fluorescente in situ à deux couleurs peut être effectuée pour détecter deux gènes cibles dans une tranche en utilisant des sondes d'ARN marquées par DIG et biotine.

L'ARN ISH avec des sondes marquées par DIG et / ou biotine a été utilisé avec succès pour localiser des gènes liés à l'olfactif, tels que l' OR , le récepteur ionotropique, la protéine de liaison aux odeursEt la protéine membranaire des neurones sensoriels, dans les antennes d'insectes, mais sans s'y limiter, Drosophila melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria et la crique du désert Schistocera gregaria ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16} . Cependant, il existe deux défis importants lors de l'exécution de l'ARN ISH pour les OR d'insecte: (1) Les gènes OU (sauf ORco ) sont exprimés à des niveaux faibles et seulement dans quelques cellules, ce qui rend la détection du signal très difficile et (2) la préservation des tissus d'insectes pour L'histologie, de sorte que la morphologie est préservée et que le bruit de fond est faible, peut être difficile. Dans cet article, un protocole détaillé et efficace décrivant l'ARN ISH pour la localisation des gènes OU dans les insectesDes antennes sont présentées, y compris la détection chromogène et l'amplification du signal Tyramide (TSA).

Protocole

NOTE: Pour limiter la dégradation de l'ARN, préparer des solutions en utilisant de l'eau distillée autoclavée humide (à 121 ° C pendant 60 min) et également des matériaux autoclave humides.

1. Préparation des sondes antisens et sentiques RNA ISH

1. Amplification et purification des gènes cible
   1. Premièrement, produire un fragment bicaténaire de 387 pb de L. migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) à partir du plasmide contenant l'ADNc complet de LmigOR1 avec une ADN polymerase Taq qui ajoute des adénines aux deux extrémités des fragments.
      1. Utiliser un volume de réaction final de 100 μL, contenant 50 μL de mélange réactionnel 2x, 4 μL chacun d'amorces sens et anti-sens ( Tableau 1 ), 1 μl de gabarit plasmidique et 41 μL d'H ₂ O exempt de RNase. Utiliser la PCR suivante Protocole: 94 ° C pendant 5 minutes, suivi de 30 cycles de 94 ° C pendant 30 s, 55 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 1 min, Suivi de 72 ° C pendant 10 min.
      2. Répétez ces étapes pour produire le fragment double brin de 1,303 pb de LmigOR2 (GenBank: JQ766966) et le fragment double brin de 1,251 pb de LmigORco (GenBank: JN989549). Les amorces utilisées dans ces expériences sont présentées dans le tableau 1 .
      3. Exécuter des produits de PCR sur 1,2% de gels d'agarose dans un tampon 1x Tris-acétate-EDTA et visualiser l'utilisation de coloration au bromure d'éthidium.
   2. Extrayez ces produits de PCR en utilisant un kit d'extraction de gel.
      1. Après électrophorèse, ajouter des bandes d'ADN du gel et placer les tranches de gel dans un tube de 1,5 ml. Ensuite, ajouter 100 μl de tampon de liaison (Buffer PN) pour 0,1 g de tranche de gel. Vortex et incuber à 50 ° C jusqu'à ce que la tranche de gel soit complètement dissoute.
      2. Insérez une colonne d'adsorption CA2 dans le tube de collecte et ajoutez 500 μL de tampon de balance (Buffer BL). Cela améliore la capacité d'absorption et la stabilité de la membrane de la silice. CentriÀ 12 400 xg pendant 1 min.
      3. Transférer le mélange de gel dissous dans l'assemblage de la colonne d'adsorption et incuber à la température ambiante pendant 2 min. Ensuite, centrifuger les tubes à 12 400 xg pendant 1 min. Jeter l'écoulement et réinsérer la colonne d'adsorption dans le tube de collecte.
      4. Ajouter 600 μL de solution de lavage (éthanol ajouté, Buffer PW) deux fois. Centrifuger à 12 400 xg pendant 1 min. Jeter l'écoulement et réinsérer la colonne d'adsorption dans le tube de collecte.
      5. Videz le tube de collecte et recentrifiez l'assemblage de la colonne à 12 400 xg pendant 2 minutes pour permettre l'évaporation de tout éthanol résiduel.
      6. Transférer soigneusement la colonne d'adsorption à un tube de centrifugation propre de 1,5 mL. Sécher à l'air la pastille pendant 5 à 10 minutes et redissoudre l'ADN dans un volume approprié ( par exemple 30 μL) d'eau exempte de nuclease.
      7. Incuber à TA pendant 2 min. Centrifuger à 12 400 xg pendant 2 min. Rejeter la colonne d'adsorption et stocker l'ADN à 4 ° C ou -20 ° C.
2. Construire les plasmides recombinants
   1. Individuellement ligaturer le fragment de 387 pb de LmigOR1, 1303 bp fragment de LmigOR2 et 1251 pb fragment de LmigORco dans un vecteur de T qui contient des promoteurs de T7 ( en amont) et SP6 ( en aval) des ARN polymérases adjacentes à l'ADN inséré en utilisant l' ADN ligase T4. Préparer la réaction 10 μL suivante: 5 μL de tampon de ligature 2x, 1 μL de vecteur T, 3 μL (~ 100 ng) de l'ADN du gène inséré et 1 μL d'ADN ligase T4, et incuber O / N à 4 ° C.
   2. Ajouter 5 ul de chaque plasmide recombinant contenant le fragment de 387 pb de LmigOR1, fragment 1303 pb du fragment LmigOR2 et 1251 pb de LmigORco séparément dans 50 pl de cellules compétentes d' Escherichia coli DH5a dans des tubes stériles de 1,5 ml.
      1. Mélanger doucement et mettre les tubes dans de la glace pendant 30 min, puis les incuber pendant 90 s à 42° C. Transformez-les en glace pendant 3 min.
      2. Ajouter 450 μL de milieu liquide Luria-Bertani (LB) sans ampicilline à chaque tube et les incuber dans un agitateur à 150 tr / min pendant 1 h à 37 ° C pour restaurer le E. coli DH5α.
      3. Prendre une aliquote de 100 μL de chaque transformant et les utiliser pour inoculer des plaques de substrat solide LB contenant 50 μg / mL d'ampicilline, 24 μg / mL de ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) isopropylique et 40 μg / mL de 5-bromo-4 -chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal).
      4. Incuber ces plaques dans un incubateur constant à 37 ° C pendant 18 h. Écran des plasmides recombinants cibles en utilisant la méthode de criblage bleu-blanc. Séquencez les plasmides recombinants cibles en utilisant le séquençage de Sanger et identifiez les directions des insertions des trois OR.
3. Sélectionnez les endonucléases de restriction pour linéariser les plasmides recombinants
   1. Utiliser des endonucléases de restriction tIl suffit non seulement de digérer dans le site de clonage multiple du vecteur, mais aussi de ne pas couper l'ADN de l'insert. Dans cette expérience, tous les 3 gènes sont insérés dans le vecteur T dans la direction correspondant à celle du vecteur.
   2. Utiliser l'endonucléase de restriction Nco I pour linéariser les plasmides recombinants contenant le fragment 387 pb de LmigOR1 , le fragment de LmigOR2 de 1,303 pb et le fragment de LmigORCO de 1,251 pb pour produire les sondes antisens. Utilisez l'endonucléase de restriction Sp e I pour produire les sondes sens.
      NOTE: Si la direction d'insertion correspond à celle du vecteur, un site de restriction unique à partir de la fin de T7 est sélectionné pour linéariser le plasmide recombinant et l'ARN polymérase SP6 est utilisée pour préparer la sonde antisens. Un site de restriction unique à partir de la fin de SP6 est choisi pour linéariser le plasmide recombinant, et l'ARN polymérase T7 est utilisée pour préparer la sonde de détection. Sinon, si la direction de l'insertion ne correspond pas à tLa direction du vecteur, puis un site de restriction unique à partir de la fin de SP6 est choisi pour linéariser le plasmide recombinant et l'ARN polymérase T7 est utilisée pour préparer la sonde antisens. Le site de restriction unique à partir de la fin de T7 est choisi pour linéariser le plasmide recombinant, et l'ARN polymérase SP6 est utilisée pour préparer la sonde de détection.
4. Purifier les plasmides recombinants linéarisés
   1. Digest 20 pg de chacun des trois plasmides recombinants contenant le fragment de 387 pb du fragment LmigOR1, 1303 pb de LmigOR2 et le fragment 1251 bp de LmigORco en utilisant la restriction Nco I endonucléase dans une réaction de 100 ul contenant 10 ul de 10 x tampon, 40 ul de plasmide de 0,5 pg / pl, 3 pl de Nco I et 47 ul de RNase h ₂ O, suivie d'une incubation de 3 h à 37 ° C.
   2. De même, digérer 20 μg de chacun de ces trois plasmides recombinants, vousChantez l'endonucléase de restriction Spe I.
   3. Purifier ces plasmides digérés en utilisant un kit d'extraction de gel tel que décrit au 1.1.2. Déterminer les concentrations de ces plasmides recombinants linéarisés extraits par spectrophotométrie et ajuster à 0,5 μg / μL.
5. Préparer des sondes antisens et sensorielles
   1. Utilisez le système de transcription de l'ARN T7 / SP6 pour générer des sondes antisens et sens. L'ARN polymérase SP6 est utilisée pour transcrire l'ARN bicaténaire pour les sondes antisens marquées par la DIG et la biotine pour ces trois gènes OR utilisant des plasmides recombinants linéarisés comme matrice in vitro . L'ARN polymérase T7 est utilisée pour produire des sondes sens. Effectuer la réaction dans un volume final de 20 μL, contenant 2 μL de mélange 10 fois NTP, 2 μL de 10X tampon de transcription, 1 μl d'inhibiteur de RNase, 2 μl d'ARN polymérase T7 ou SP6, 4 μL de 0,5 μg / μL de plasmide linéarisé et 9 μL de H ₂ O exempt de RNase, suiviPar incubation de 3 h à 37 ° C.
   2. Incuber les sondes antisens et senseuses marquées par DIG et biotine pendant 30 minutes avec 1 μL d'ADNase à 37 ° C. Ajouter 2,5 μL de LiCl 5 M et 75 μL d'éthanol absolu, puis incuber les réactions pendant 30 min à -70 ° C.
   3. Centrifuger à 15 000 xg pendant 30 min à 4 ° C. Découper soigneusement le surnageant. Ajouter 150 μL d'éthanol à 70% pour laver le précipitant. Préparer l'éthanol à 70% (1 L) en ajoutant de l'éthanol à 95% (736,8 mL) à de l'eau distillée stérile (263,2 ml).
   4. Centrifuger à 15 000 xg pendant 30 min à 4 ° C à nouveau et sécher à l'air libre la pastille pendant 5 à 10 minutes à la température ambiante. Ajouter 25 μL d'H ₂ O exempt de RNase pour dissoudre les sondes antisens et sens de l'ARN.
   5. Si la longueur du gène inséré est supérieure à 1 kb, par la suite, fragmenter les sondes antisens et sondes ARN à une longueur moyenne de ~ 300 pb par incubation dans des solutions tampons bicarbonate-carbonate. Effectuer la réaction dans un volume final de 50 μL, contenant 25 ul de la sonde d'ARN et 25 ul de 60 ° C à la solution de tampon bicarbonate-carbonate de (80 mM de NaHCO _3, 120 mM de Na ₂ CO _3, de pH 10,2). Le temps d'hydrolyse requis est donné par une formule ¹⁷ précédemment publiée.
   6. Ajouter 5 μL d'acide acétique à 10% pour arrêter la réaction. Dans cette expérience, fragmenter les sondes antisens et sens LmigOR2 et LmigORco pendant 24 et 23 minutes, respectivement.
      T = (L _o -L _f ) / kXL _o XL _f
      L _o = longueur initiale des fragments en kb
      L _f = la longueur finale des fragments en kb
      K = la constante de vitesse pour l'hydrolyse, environ 0,11 kb ^-1 min ^-1
      T = temps d'hydrolyse en min
   7. Enfin, ajouter 250 μl de tampon d'hybridation et stocker à -80 ° C.

2. Préparation des sections de cryostat

1. Precool le freeziNg microtome à -24 ° C.
2. Sélectionnez de nouveaux criquets mous adultes qui sont actifs et ont des antennes intactes. Couper les antennes en morceaux de 2-3 mm à l'aide de rasoirs stériles.
3. Mettre le composé OCT sur un support de microtome à congélation et mettre un ou deux échantillons sur le composé à l'horizontale. Ensuite, transférez le support dans le microtome de congélation à -24 ° C pour équilibrer jusqu'à ce que le composé gèle. Retirez le support et recouvrez les échantillons avec un petit composé. Transférer le support dans le microtome de congélation à -24 ° C à nouveau pendant au moins 10 min ( Figure 1 ).
   REMARQUE: Évitez d'obtenir des bulles dans le composé.
4. Fixez le support avec les échantillons dans le microtome de congélation, puis sectionnez les échantillons congelés dans des tranches de 12 μm d'épaisseur à -24 ° C.
5. Décongeler les tranches une à une sur les diapositives (25 x 75 mm, sans nuclease) et sécher à l'air pendant 10 min.

3. Fixation des sections

1. Après la préparation du cryostat, Mettez les diapositives dans un récipient en plastique (~ 100 x 40 x 80 mm) et réparez les tissus en incubant les diapositives dans une solution de paraformaldéhyde à 4% (PFA) pendant 30 minutes à 4 ° C.
2. Laver les diapositives dans une solution salée tamponnée au phosphate 1X (PBS) pendant 1 min.
3. Pour éliminer les protéines alcalines, transférez les diapositives à 0,2 M HCl pendant 10 min.
4. Pour éliminer la protéine de surface de l'acide nucléique, transférez les diapositives à 1XPBS avec 1% de Triton X-100 pendant 2 min.
5. Lavez les diapositives deux fois pendant 30 s en 1x PBS.
6. Enfin, rincer les lames dans la solution de formamide pendant 10 min à 4 ° C.

4. Hybridation

1. Préparer les sondes antisens et sens
   1. Utilisez un tampon d'hybridation pour diluer des sondes antisens ou sens dans l'ARN dans les tubes sans nuclease de 1,5 ml. Dans cette expérience, pour toutes les sondes antisens et sens ( LmigOR1, LmigOR2 et LmigOrco ), ajouter 1 μL de sonde à 99 μL tampon d'hybridation par diapositive. D'une manière générale, l'utilisation de dilutions 1: 100 de sondes antisens produit des signaux positifs significatifs et de faibles antécédents utilisant ce protocole.
   2. Pour la détection chromogène, diluer individuellement les sondes marquées par DIG.
   3. Pour la détection TSA, diluer LmigOR1 marqué au DIG avec des sondes LmigOrco marquées par la biotine ou LmigOR2 marqué au DIG avec des sondes LmigOR1 marquées par la biotine ensemble dans le tampon d'hybridation.
   4. Chauffer les dilutions pendant 10 min à 65 ° C et les mettre sur de la glace pendant au moins 5 min.
2. Hybridation
   1. Vidangez les glissières et ajoutez 100 μL de sondes antisens diluées et sens (étape 4.1) aux sections de tissu. Ensuite, placez les lamelles (24 mm x 50 mm, sans nuclease) sur les sections de tissu.
   2. Placez les diapositives couvertes horizontalement dans une boîte humide (~ 300 x 180 x 50 mm ³ , Figure 2 ) et incupez uneT 55 ° C pendant 22 h. Ajouter la solution de formamide ou 1X PBS au fond de la boîte pour garder l'environnement humide, mais ne pas immerger les glissières dans le liquide.
3. Lavage et blocage.
   1. Après l'hybridation, retirez soigneusement les lamelles. Laver les diapositives deux fois pendant 30 min dans une citrate de sodium salée (SSC) 0,1x à 60 ° C.
      REMARQUE: le lavage permet de placer les glissières dans un porte-coulisseau qui est ensuite placé dans un récipient en plastique et agité doucement sur une bascule (~ 50 tours par minute, figure 2 ).
   2. Rincer les glissières dans une solution salée tamponnée à tris (TBS) pendant 30 s.
   3. Ajouter 1 mL de réactif bloquant à 1% dans du TBS additionné de Triton X-100 à 0,03% sur chaque diapositive et incuber pendant 30 minutes. Ensuite, jetez la solution de blocage.
4. Immunohistochimie.
   1. Pour la détection chromogène, utiliser un réactif de blocage dans le TBS pour diluer 750 unités (U) / mL Anti-digoxigenine AP-anti-anti-conjugaisonDy à 1,5 U / mL AP solution. Ajouter 100 μL de solution AP par coulisseau couvert (24 mm x 50 mm).
   2. Pour la détection TSA, utiliser un réactif de blocage dans le TBS pour diluer 750 U / mL d'anticorps conjugués anti-digoxigénine AP et anticorps conjugué anti-biotine streptavidine HRP à la solution AP / HRP. Ajouter 100 μL de solution AP / HRP par diaphragme couvert (24 mm x 50 mm).
   3. Incuber les glissières dans une boîte humide ( Figure 2 ) pendant 60 min à 37 ° C. Utilisez la solution de formamide ou 1X PBS pour garder la boîte humide mais pas détrempée.

5. Coloration

1. Retirez les lamelles avec précaution. Laver les diapositives trois fois pendant 5 min dans 1x TBS additionné de 0,05% de Tween-20. Rincer les glissières dans du tampon DAP (détection chromogène: pH 9,5, détection TSA: pH 8,0) pendant 5 min.
2. Coloration (détection chromogène)
   1. Ajouter 100 μL de solution de substrat NBT (375 μg / mL) / BCIP (188 μg / mL) (diluée dans DAP;PH 9,5) à chaque diapositive. Placez soigneusement des lamelles (24 x 50 mm) sur les glissières.
   2. Incuber les diapositives dans une boîte humide avec une solution de substrat pendant 10 min - O / N à 37 ° C.
      REMARQUE: Vérifiez le développement en regardant les diapositives de temps en temps sous le microscope.
   3. Lorsque le développement est prêt, arrête la réaction en transférant les diapositives dans l'eau.
3. Coloration (détection TSA)
   1. Utilisez une seringue pour déplacer le substrat HNPP (100 μg / mL) / Fast Red (250 μg / mL) à partir du filtre de la seringue (0,22 μm, Figure 2 ).
   2. Ajouter 100 μL de HNPP / Fast Red substrat par glissière recouvert d'une lamelle (24 x 50 mm). Incuber les diapositives pendant 30 min avec HNPP / Fast Red substrat à la RT.
   3. Retirez les lamelles avec soin et lavez les diapositives trois fois pendant 5 minutes dans 1X TBS additionné de 0,05% de Tween-20.
   4. Utiliser 100 μL de substrat TSA / recouvert (24 x 50 mm ² ) glisser. Incuber les glissières avec un substrat TSA pendant 10 min à la RT.
   5. Retirez les lamelles avec soin et lavez les diapositives trois fois pendant 5 min dans 1x TBS additionné de 0,05% de Tween-20.
4. Incorporer les glissières dans du PBS / glycerol (1: 3).
   REMARQUE: après avoir terminé ces procédures, les diapositives doivent être observées dès que possible parce que le signal fluorescent s'arrête rapidement.

6. Observation

1. Détection chromogène
   1. Observez les sections de tissu à l'aide d'un microscope optique. Choisissez les lentilles d'objectif 10X, 20X et 40X pour observer les résultats de la détection chromogène.
   2. Utilisez le logiciel DP-BSW pour analyser les résultats et capturer les images.
2. Détection TSA
   1. Observer les coupes de tissus à l'aide d'un microscope confocal. Les gènes marqués par DIG doivent être observés sous une lumière de 543 nm, présentant une couleur rouge, et les gènes marqués par la biotine devraient êtreObservé sous une lumière de 488 nm, présentant une couleur verte. Quand ils émergent, ils présentent une couleur jaune.
   2. Choisissez les lentilles d'objectif 20X et 40X pour observer les résultats de la détection TSA, respectivement.
   3. Utilisez le logiciel FV1000 pour analyser les résultats et capturer les images.

Résultats

Avec une détection chromogène, un petit sous-ensemble des cellules antenales dans chaque section antenale adulte a été désigné par les sondes antisens LmigOR1 et LmigOR2 marquées par DIG ( Figure 3 ). RNA ISH sur des sections consécutives pour localiser LmigOR1 et LmigOR2 a montré que les cellules antenales exprimant les deux gènes étaient situées dans des grappes d'ORN exprimant LmigORco ...

Discussion

Il est difficile d'effectuer l'ARN ISH pour localiser les gènes OU dans les antennes d'insectes car les niveaux d'expression des gènes OR, à l'exception de l' ORco , sont très faibles et la conservation des tranches histologiques d'antennes d'insectes est très difficile. En outre, la détection TSA est également très délicate. Pour résoudre ces problèmes, les mesures suivantes devraient être prises. Les antennes sont sélectionnées à partir de criquets adultes nouvel...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
2×TSINGKETM Master Mix	TSINGKE, China	TSE004
RNase-free H2O	TIANGEN, China	RT121-02
REGULAR AGAROSE G-10	BIOWEST, SPAIN	91622
Binding buffer	TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China	DP209-02
Balance buffer	TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China	DP209-02
Wash solution	TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China	DP209-02
T Vector	Promega, USA	A362A
T4 DNA Ligase	Promega, USA	M180A
Escherichia coli DH5α	TIANGEN, China	CB101
Ampicillin	Sigma, USA	A-6140
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Inalco, USA	1758-1400
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside	SBS Genetech, China	GX1-500
Nco I	BioLabs, New England	R0193S
Spe I	BioLabs, New England	R0133M
DIG RNA Labeling Kit	Roche, Switzerland	11175025910
Biotin RNA Labeling Kit	Roche, Switzerland	11685597910
DNase	DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland	11175025910
LiCl	Sinopharm, China	10012718
Ethanol	Sinopharm, China	10009257
Acetic acid	BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China	10000292
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands	4583
Slides	TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China	FISH0010
HCl	Sinopharm, China	80070591
Millex	Millipore, USA	SLGP033RS
Tween 20	AMRESCO, USA	0777-500ML
Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt	Roche, Switzerland	11175041910
Glycerol	Sinopharm, China	10010618
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
1×Tris-acetate-EDTA	Sigma, USA	V900483-1KG	0.04mol/L Tris-Base
1×Tris-acetate-EDTA	BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China	10000292	0.12%acetic acid
1×Tris-acetate-EDTA	Sigma, USA	03677	Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)
Luria-Bertani (LB) liquid medium	Sinopharm, China	10019392	10g/L NaCl
Luria-Bertani (LB) liquid medium	MERCK, Germany	VM335231	10g/L Peptone from casein (Tryptone)
Luria-Bertani (LB) liquid medium	MERCK, Germany	VM361526	5g/L Yeast extract
LB solid substrate plate	Sinopharm, China	10019392	10g/L NaCl
LB solid substrate plate	MERCK, Germany	VM335231	10g/L Peptone from casein (Tryptone)
LB solid substrate plate	MERCK, Germany	VM361526	5g/L Yeast extract
LB solid substrate plate	WISENT ING, Canada	800-010-CG	15g/L Agar Bacteriological Grade
10×phosphate buffer saline (pH7.1)	Sinopharm, China	10019392	8.5%NaCl
10×phosphate buffer saline (pH7.1)	Sigma, USA	V900041-500G	14mM KH2PO4
10×phosphate buffer saline (pH7.1)	Sigma, USA	V900268-500G	80mM Na2HPO4
10×Tris buffered saline (pH7.5)	Sigma, USA	V900483-1KG	1M Tris-Base
10×Tris buffered saline (pH7.5)	Sinopharm, China	10019392	1.5M NaCl
Detection Buffer (DAP)       chromogenic detection pH9.5       TSA detection pH8.0	Sigma, USA	V900483-1KG	100mM Tris-Base
Detection Buffer (DAP)       chromogenic detection pH9.5       TSA detection pH8.0	Sinopharm, China	10019392	100mM NaCl
Detection Buffer (DAP)       chromogenic detection pH9.5       TSA detection pH8.0	Sigma, USA	V900020-500G	50mM MgCl2·6H2O
20×saline-sodium citrate (pH7.0)	Sinopharm, China	10019392	3M NaCl
20×saline-sodium citrate (pH7.0)	Sigma, USA	V900095-500G	0.3M Na-Citrate
4% paraformaldehyde solution (pH9.5)	Sigma, USA	V900894-100G	4% paraformaldehyde
4% paraformaldehyde solution (pH9.5)	Sigma, USA	V900182-500G	0.1M NaHCO3
Sodium Carbonate Buffer (pH10.2)	Sigma, USA	V900182-500G	80mM NaHCO3
Sodium Carbonate Buffer (pH10.2)	Sigma, USA	S7795-500G	120mM Na2CO3
Formamide Solution (pH10.2)	MPBIO, USA	FORMD002	50% Deionized Formamide
Formamide Solution (pH10.2)			5×saline-sodium citrate
Blocking Buffer in Tris buffered saline	Roche, Switzerland	11175041910	1% Blot
Blocking Buffer in Tris buffered saline	AMRESCO, USA	0694-500ML	0.03% Triton X-100
Blocking Buffer in Tris buffered saline			1×Tris buffered saline
Alkaline phosphatase solution	Roche, Switzerland	11175041910	1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody
Alkaline phosphatase solution			Blocking Buffer in Tris buffered saline
Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution	Roche, Switzerland	11175041910	1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody
Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution	TSA kit, Perkin Elmer, USA	NEL701A001KT	1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody
Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution			Blocking Buffer in Tris buffered saline
Hybridization Buffer	MPBIO, USA	FORMD002	50% Deionized Formamide
Hybridization Buffer			2×saline-sodium citrate
Hybridization Buffer	Sigma, USA	D8906-50G	10% dextran sulphate
Hybridization Buffer	invitrogen, USA	AM7119	20 µg/ml yeast t-RNA
Hybridization Buffer	Sigma, USA	D3159-10G	0.2 mg/ml herring sperm DNA
2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate	Roche, Switzerland	11758888001	1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate (10mg/ml)
2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate	Roche, Switzerland	11758888001	1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25mg/ml)
2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate			Detection Buffer
Tyramide signal amplification substrate	TSA kit, Perkin Elmer, USA	NEL701A001KT	2% fluorescein-tyramides
Tyramide signal amplification substrate	TSA kit, Perkin Elmer, USA	NEL701A001KT	Amplification Diluent
Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrument
Freezing microtome	Leica, Nussloch, Germany	Jung CM300 cryostat
Spectrophotometer	Thermo SCIENTIFIC, USA	NANODROP 2000
Optical microscope	Olympus, Tokyo, Japan	Olympus IX71microscope
Confocal microscope	Olympus, Tokyo, Japan	Olympus BX45 confocal microscope