Lokalisierung von Odorant-Rezeptor-Genen in Locust-Antennen durch RNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung

Zusammenfassung

Dieses Papier beschreibt ein detailliertes und hochwirksames RNA- in situ- Hybridisierungsprotokoll, insbesondere für Low-Level-exprimierte Odorant Receptor (OR) -Gen sowie andere Gene in Insektenantennen unter Verwendung von Digoxigenin (DIG) -markierten oder Biotin-markierten Sonden.

Zusammenfassung

Insekten haben anspruchsvolle olfaktorische Empfangssysteme entwickelt, um exogene chemische Signale zu erfassen. Diese chemischen Signale werden von Olfactory Receptor Neurons (ORNs), die in haarähnlichen Strukturen, genannt Chemosensilla, der Antennen untergebracht sind, transduziert. Auf den ORNs-Membranen wird angenommen, dass Odorant-Rezeptoren (ORs) an Geruchscodierung beteiligt sind. So ist es möglich, die auf die ORNs lokalisierten Gene zu identifizieren, um OR-Gene zu erkennen und stellt eine fundamentale Grundlage für weitere funktionelle in situ- Studien dar. Die RNA-Expressionsniveaus von spezifischen ODER- S in Insektenantennen sind sehr niedrig und die Erhaltung von Insektengewebe für die Histologie ist eine Herausforderung. Somit ist es schwierig, ein ODER zu einem bestimmten Typ von Sensilla unter Verwendung von RNA in situ Hybridisierung zu lokalisieren. In diesem Papier wird ein detailliertes und hochwirksames RNA- in situ- Hybridisierungsprotokoll speziell für niedrig exprimierte ODER-Gene von Insekten eingeführt. Darüber hinaus ist eine spezifische OR Gen waS identifiziert durch die Durchführung von doppelfarbigen fluoreszierenden in situ- Hybridisierungsexperimenten unter Verwendung eines coexprimierenden Rezeptor-Gens, Orco , als Marker.

Einleitung

Insektenantennen, die die bedeutendsten chemosensorischen Organe sind, sind mit vielen haarähnlichen Strukturen - Sensilla - bedeckt, die von Olfactory Receptor Neurons (ORNs) innerviert werden. Auf der Membran von Insekten-ORNs werden Odorant-Rezeptoren (ODER), eine Art von Protein, das sieben Transmembran-Domänen enthält, mit einem Corezeptor (ORco) exprimiert, um ein Heteromer zu bilden, das als ein geruchshemmender Ionenkanal ^{1 , 2 , 3 fungiert} . Verschiedene ODER reagieren auf verschiedene Kombinationen der chemischen Verbindungen ^{4 , 5 , 6} .

Heuschrecken ( Locusta migratoria ) beruhen vor allem auf olfaktorischen Cues, um wichtige Verhaltensweisen auszulösen ⁷ . Heuschrecken-ODER sind Schlüsselfaktoren für das Verständnis molekularer olfaktorischer Mechanismen. Lokalisierung eines spezifischen Heuschrecken-ODER-Gens an das Neuron von aMorphologisch spezifischer Sensillum-Typ durch RNA In situ Hybridisierung (RNA ISH) ist der erste Schritt bei der Erforschung der ODER-Funktion.

RNA ISH verwendet eine markierte komplementäre RNA-Sonde zur Messung und Lokalisierung einer spezifischen RNA-Sequenz im Abschnitt von Gewebe, Zellen oder ganzen Mounts in situ und liefert Einblicke in physiologische Prozesse und Krankheitspathogenese. Digoxigenin-markierte (DIG-markierte) und Biotin-markierte RNA-Sonden wurden in der RNA-Hybridisierung weit verbreitet verwendet. Die RNA-Markierung mit Digoxigenin-11-UTP oder Biotin-16-UTP kann durch in vitro- Transkription mit SP6- und T7-RNA-Polymerasen hergestellt werden. DIG- und Biotin-markierte RNA-Sonden haben folgende Vorteile: nicht radioaktiv; Safe; stabil; hochsensibel; Hochspezifisch; Und leicht zu produzieren mit PCR und in vitro Transkription. DIG- und Biotin-markierte RNA-Sonden können chromogen und fluoreszenz nachgewiesen werden. DIG-markierte RNA-Sonden können mit Anti-Digoxigenin-Alkali nachgewiesen werdenNe Phosphatase (AP) -konjugierte Antikörper, die entweder mit den hochempfindlichen chemilumineszierenden Substraten Nitroblau Tetrazoliumchlorid / 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat-toluidinsalz (NBT / BCIP) unter Verwendung eines optischen Mikroskops oder mit 2 sichtbar gemacht werden können -Hydroxy-3-naphtoesäure-2'-phenylanilidphosphat (HNPP), gekoppelt mit 4-Chlor-2-methylbenzendiazonium-hemi-Zinkchloridsalz (Fast Red) unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops. Biotin-markierte RNA-Sonden können mit Anti-Biotin-Streptavidin-Pferd-Rettich-Peroxidase (HRP) -konjugierten Antikörpern nachgewiesen werden, die mit Fluorescein-Tyramiden unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops sichtbar gemacht werden können. Somit kann eine zweifarbige fluoreszierende in situ- Hybridisierung durchgeführt werden, um zwei Zielgene in einer Scheibe unter Verwendung von DIG- und Biotin-markierten RNA-Sonden zu detektieren.

RNA ISH mit DIG- und / oder Biotin-markierten Sonden wurde erfolgreich verwendet, um olfaktorisch verwandte Gene zu lokalisieren, wie OR , ionotroper Rezeptor, geruchsbindendes ProteinUnd sensorisches Neuronenmembranprotein, in Insektenantennen von, aber nicht beschränkt auf Drosophila melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria und die Wüstenheuschrecke Schistocera gregaria ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16} . Allerdings gibt es zwei wesentliche Herausforderungen bei der Durchführung von RNA ISH für Insekten-ODER: (1) ODER-Gene (außer ORco ) werden auf niedrigem Niveau und nur in wenigen Zellen exprimiert, was die Signaldetektion sehr schwierig macht und (2) das Insektengewebe konserviert Histologie, so dass die Morphologie erhalten bleibt und das Hintergrundgeräusch ist niedrig, kann eine Herausforderung sein. In diesem Papier ein detailliertes und effektives Protokoll beschreibt RNA ISH für die Lokalisierung von ODER-Genen in InsektAntennen präsentiert werden, einschließlich sowohl chromogene und Tyramide Signal Amplification (TSA) Erkennung.

Protokoll

HINWEIS: Zur Begrenzung des RNA-Abbaus werden Lösungen mit nass-autoklaviertem destilliertem Wasser (bei 121 ° C für 60 min) und auch Nass-Autoklaven-Materialien hergestellt.

1. Herstellung von RNA ISH Antisense und Sense Sonden

1. Ziel-Gen-Amplifikation und -Reinigung
   1. Zuerst ein 387 bp doppelsträngiges Fragment von L. migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) aus dem Plasmid, das die Volllängen -cDNA von LmigOR1 enthält, mit einer Taq- DNA-Polymerase, die Adenine zu beiden Enden der Fragmente hinzufügt, produzieren.
      1. Verwenden Sie ein 100 μl Endreaktionsvolumen, das 50 μl 2x Reaktionsmischung enthält, jeweils 4 μl Sense- und Antisense-Primer ( Tabelle 1 ), 1 μl Plasmid-Matrize und 41 μl RNase-freies H ₂ O. Verwenden Sie die folgende PCR Protokoll: 94 ° C für 5 min, gefolgt von 30 Zyklen von 94 ° C für 30 s, 55 ° C für 30 s und 72 ° C für 1 min, Gefolgt von 72 ° C für 10 min.
      2. Wiederholen Sie diese Schritte, um das 1,303 bp doppelsträngige Fragment von LmigOR2 (GenBank: JQ766966) und 1,251 bp doppelsträngiges Fragment von LmigORco (GenBank: JN989549) zu produzieren. Die in diesen Experimenten verwendeten Primer sind in Tabelle 1 dargestellt .
      3. Führen Sie PCR-Produkte auf 1,2% Agarosegele in 1x Tris-Acetat-EDTA-Puffer und visualisieren Sie mit Ethidiumbromid-Färbung.
   2. Extrahieren Sie diese PCR-Produkte mit einem Gel-Extraktions-Kit.
      1. Nach der Elektrophorese verbannen Sie die DNA-Banden aus dem Gel und legen die Gelscheiben in ein 1,5-ml-Röhrchen. Dann werden 100 μl Bindungspuffer (Puffer PN) pro 0,1 g Gelscheibe zugegeben. Vortex und inkubieren bei 50 ° C, bis die Gelscheibe vollständig aufgelöst ist.
      2. Setzen Sie eine CA2-Adsorptionskolonne in das Sammelröhrchen ein und fügen Sie 500 μl Restpuffer (Puffer BL) hinzu. Dies verbessert die Absorptionsfähigkeit und Stabilität der Silicamembran. CentriFuge bei 12.400 xg für 1 min.
      3. Das gelierte Gelgemisch wird in die Adsorptionskolonnenanordnung überführt und bei Raumtemperatur für 2 min inkubiert. Dann werden die Zentrifugenröhrchen bei 12.400 xg für 1 min zentrifugiert. Verwerfen Sie den Durchfluss und setzen Sie die Adsorptionskolonne wieder in das Sammelrohr ein.
      4. Füge 600 μl Waschlösung (Ethanol zugesetzt, Puffer PW) zweimal hinzu. Zentrifuge bei 12.400 xg für 1 min. Verwerfen Sie den Durchfluss und setzen Sie die Adsorptionskolonne wieder in das Sammelrohr ein.
      5. Das Sammelröhrchen entleeren und die Säulenanordnung bei 12.400 xg für 2 min zentrifugieren, um ein Verdampfen von restlichem Ethanol zu ermöglichen.
      6. Die Adsorptionskolonne sorgfältig auf ein sauberes 1,5 mL Zentrifugenröhrchen überführen. Das Pellet für 5-10 min trocknen und die DNA in einem geeigneten Volumen ( z. B. 30 & mgr; l) nukleasefreies Wasser auflösen.
      7. Inkubieren bei RT für 2 min. Zentrifuge bei 12.400 xg für 2 min. Die Adsorptionskolonne entsorgen und die DNA bei 4 ° C oder -20 ° C aufbewahren.
2. Konstruieren Sie die rekombinanten Plasmide
   1. Individuell das 387 bp-Fragment von LmigOR1 , 1,303 bp Fragment von LmigOR2 und 1,251 bp Fragment von LmigORco in einen T-Vektor ligieren , der Promotoren für T7 (Upstream) und SP6 (stromabwärts) RNA-Polymerasen neben der insertierten DNA unter Verwendung von T4-DNA-Ligase enthält. Bereiten Sie die folgende 10 & mgr; l-Reaktion vor: 5 & mgr; l 2x Ligationspuffer, 1 & mgr; l T-Vektor, 3 & mgr; l (~ 100 ng) der DNA des insertierten Gens und 1 & mgr; l T4-DNA-Ligase und inkubieren O / N bei 4 ° C.
   2. Füge 5 μl jedes rekombinanten Plasmids hinzu, das das 387 bp-Fragment von LmigOR1 , 1,303 bp Fragment von LmigOR2 und 1,251 bp Fragment von LmigORco getrennt in 50 μl kompetente Escherichia coli DH5α Zellen in sterilen 1,5 mL Röhrchen enthält.
      1. Mischen Sie sanft und legen Sie die Röhrchen für 30 Minuten in Eis und dann inkubieren sie für 90 s bei 42° C Übertragen Sie sie für 3 min in Eis zurück.
      2. Füge 450 & mgr; l Luria-Bertani (LB) flüssiges Medium ohne Ampicillin zu jedem Röhrchen hinzu und inkubiere sie in einem Schüttler bei 150 U / min für 1 h bei 37 ° C, um das E. coli DH5 & agr; wiederherzustellen.
      3. Nehmen Sie ein 100 & mgr; l Aliquot jeder Transformante und verwenden Sie sie, um LB-feste Substratplatten, die 50 & mgr; g / ml Ampicillin, 24 & mgr; g / ml Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) und 40 & mgr; g / ml 5-Brom-4 enthalten, zu inokulieren -chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-gal).
      4. Diese Platten in einem konstanten Inkubator bei 37 ° C für 18 h inkubieren. Screening der Ziel-rekombinanten Plasmide unter Verwendung der blau-weißen Screening-Methode. Sequenzieren Sie die Ziel-rekombinanten Plasmide unter Verwendung von Sanger-Sequenzierung und identifizieren die Insertionsrichtungen der drei ODER-Gene.
3. Wählen Sie Restriktionsendonukleasen, um rekombinante Plasmide zu linearisieren
   1. Verwenden Sie Restriktionsendonukleasen tHabe nicht nur in der multiplen Klonierungsstelle des Vektors verdauen, sondern auch die Insert-DNA nicht schneiden. In diesem Experiment werden alle 3 Gene in den T-Vektor in der Richtung eingefügt, die der des Vektors entspricht.
   2. Verwenden Sie die NcoI- Restriktionsendonuklease, um die rekombinanten Plasmide, die das 387 bp-Fragment von LmigOR1 , 1,303 bp-Fragment von LmigOR2 und 1,251 bp-Fragment von LmigORco enthalten, zu linearisieren , um die Antisense-Sonden zu erzeugen. Verwenden Sie Sp e I Restriktionsendonuklease, um die Sense-Sonden zu erzeugen.
      HINWEIS: Wenn die Insertionsrichtung dem des Vektors entspricht, wird eine eindeutige Restriktionsstelle vom Ende von T7 ausgewählt, um das rekombinante Plasmid zu linearisieren, und die SP6-RNA-Polymerase wird zur Herstellung der Antisense-Sonde verwendet. Eine einzigartige Restriktionsstelle vom Ende von SP6 wird ausgewählt, um das rekombinante Plasmid zu linearisieren, und die T7-RNA-Polymerase wird verwendet, um die Sense-Sonde herzustellen. Ansonsten, wenn die Einsteckrichtung nicht mit t übereinstimmtDie Richtung des Vektors, dann wird eine einzigartige Restriktionsstelle vom Ende von SP6 ausgewählt, um das rekombinante Plasmid zu linearisieren, und die T7-RNA-Polymerase wird zur Herstellung der Antisense-Sonde verwendet. Die einzigartige Restriktionsstelle vom Ende von T7 wird ausgewählt, um das rekombinante Plasmid zu linearisieren, und die SP6-RNA-Polymerase wird verwendet, um die Sense-Sonde herzustellen.
4. Reinigen der linearisierten rekombinanten Plasmide
   1. 20 μg jedes der drei rekombinanten Plasmide, die das 387 bp-Fragment von LmigOR1 , 1,303 bp-Fragment von LmigOR2 und 1,251 bp-Fragment von LmigORco enthalten, unter Verwendung der NcoI- Restriktionsendonuklease in einer 100 & mgr; l-Reaktion, die 10 & mgr; l 10 × Puffer, 40 & mgr; l enthält, 0,5 μg / μl Plasmid, 3 μl Nco I und 47 μl RNase-freies H ₂ O, gefolgt von einer 3- stündigen Inkubation bei 37 ° C.
   2. In ähnlicher Weise werden 20 & mgr; g von jedem dieser drei rekombinanten Plasmide uSinge die Spe I-Restriktionsendonuklease.
   3. Diese verdauten Plasmide werden unter Verwendung eines Gel-Extraktionskits, wie in 1.1.2 beschrieben, gereinigt. Bestimmen Sie die Konzentrationen dieser extrahierten linearisierten rekombinanten Plasmide durch Spektrophotometrie und stellen Sie sie auf 0,5 μg / μL ein.
5. Antisense und Sense Sonden vorbereiten
   1. Verwenden Sie das T7 / SP6-RNA-Transkriptionssystem, um Antisense- und Sense-Sonden zu erzeugen. SP6-RNA-Polymerase wird verwendet, um doppelsträngige RNA für DIG- und Biotin-markierte Antisense-Sonden für diese drei ODER-Gene unter Verwendung linearisierter rekombinanter Plasmide als Matrizen in vitro zu transkribieren. Die T7-RNA-Polymerase wird zur Herstellung von Messsonden verwendet. Die Reaktion in einem 20 & mgr; l Endvolumen, enthaltend 2 & mgr; l 10 × NTP-Mischung, 2 & mgr; l 10X Transkriptionspuffer, 1 & mgr; l RNase-Inhibitor, 2 & mgr; l T7 oder SP6-RNA-Polymerase, 4 & mgr; l 0,5 & mgr; g / & mgr; l linearisiertes Plasmid und 9 & mgr; l RNase-freies H ₂ O, gefolgt vonDurch eine 3-stündige Inkubation bei 37 ° C.
   2. Inkubieren Sie die DIG- und Biotin-markierten Antisense- und Sense-Sonden für 30 min mit 1 μl DNase bei 37 ° C. Zugabe von 2,5 μl 5 M LiCl und 75 μl absolutem Ethanol, dann inkubieren die Reaktionen für 30 min bei -70 ° C.
   3. Zentrifugieren bei 15.000 xg für 30 min bei 4 ° C. Den Überstand sorgfältig dekantieren. Füge 150 μl 70% iges Ethanol hinzu, um das Fällungsmittel zu waschen. Das 70% ige Ethanol (1 l) wird durch Zugabe von 95% Ethanol (736,8 ml) zu sterilem destilliertem Wasser (263,2 ml) hergestellt.
   4. Bei 15.000 xg für 30 min bei 4 ° C erneut zentrifugieren und das Pellet für 5-10 min bei RT lufttrocknen. Füge 25 μl RNase-freies H ₂ O hinzu, um die RNA-Antisense- und Sense-Sonden aufzulösen.
   5. Wenn die Länge des eingefügten Gens länger als 1 kb ist, dann Fragment RNA antisense und Sense-Sonden auf eine durchschnittliche Länge von ~ 300 bp durch Inkubation in einer Bicarbonat-Carbonat-Puffer-Lösungen. Die Reaktion in einem 50 μl Endvolumen durchführen, cWobei 25 & mgr; l der RNA-Sonde und 25 & mgr; l der Bicarbonat-Carbonat-Pufferlösung (80 mM NaHCO ₃ , 120 mM Na ₂ CO ₃ , pH 10,2) bei 60 ° C erhalten wurden. Die erforderliche Hydrolysezeit wird durch eine zuvor veröffentlichte Formel ^{17 gegeben} .
   6. Füge 5 μl 10% ige Essigsäure hinzu, um die Reaktion zu stoppen. In diesem Experiment, Fragment der LmigOR2 und LmigORco Antisense und Sense Sonden für 24 und 23 min, respectively.
      T = (L _o -L _f ) / kXL _o XL _f
      L _o = die Anfangsfragmentlängen in kb
      L _f = die endgültigen Fragmentlängen in kb
      K = die Geschwindigkeitskonstante für die Hydrolyse, etwa 0,11 kb ^-1 min ^-1
      T = die Hydrolysezeit in min
   7. Schließlich werden 250 μl Hybridisierungspuffer zugegeben und bei -80 ° C aufbewahrt.

2. Vorbereitung der Kryostatabschnitte

1. Precool die FreeziNg Mikrotom auf -24 ° C.
2. Wählen Sie neue, heutzutage erwachsene Heuschrecken, die aktiv sind und intakte Antennen haben. Schneiden Sie die Antennen in 2-3 mm Stücke mit sterilen Rasiermesser.
3. Setzen Sie OCT-Verbindung auf einen gefrierenden Mikrotom-Halter und legen Sie ein oder zwei Proben auf die Verbindung horizontal. Dann den Halter in das Gefriermikrotom bei -24 ° C überführen, um zu äquilibrieren, bis die Verbindung gefriert. Nehmen Sie den Halter heraus und bedecken Sie die Proben mit einer kleinen Verbindung. Übertragen Sie den Halter in das Gefriermikrotom bei -24 ° C für mindestens 10 min ( Abbildung 1 ).
   HINWEIS: Vermeiden Sie es, Blasen in der Verbindung zu bekommen.
4. Fixieren Sie den Halter mit den Proben in das Gefriermikrotom, und schneiden Sie dann die gefrorenen Proben in 12 μm dicke Scheiben bei -24 ° C.
5. Tauen Sie die Scheiben eins nach dem anderen auf die Rutschen (25 x 75 mm, nukleasefrei) und die Luft trocknen für 10 min.

3. Befestigung Sektionen

1. Nach der Vorbereitung Kryostat(~ 100 x 40 x 80 mm) und fixieren die Gewebe durch Inkubieren der Objektträger in 4% Paraformaldehydlösung (PFA) für 30 min bei 4 ° C.
2. Waschen Sie die Objektträger in 1X Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 1 min.
3. Um die alkalischen Proteine ​​zu eliminieren, werden die Objektträger für 10 min auf 0,2 M HCl übertragen.
4. Um das Oberflächenprotein von Nukleinsäure zu eliminieren, transferieren Sie die Objektträger auf 1XPBS mit 1% Triton X-100 für 2 min.
5. Waschen Sie die Folien zweimal für 30 s in 1x PBS.
6. Schließlich spülen Sie die Objektträger in Formamidlösung für 10 min bei 4 ° C ab.

4. Hybridisierung

1. Bereiten Sie die Antisense- und Sense-Sonden vor
   1. Verwenden Sie Hybridisierungspuffer, um RNA-Antisense- oder Sense-Sonden in den 1,5 mL-Nuklease-freien Röhrchen zu verdünnen. In diesem Experiment fügen Sie für alle Antisense- und Sense-Sonden ( LmigOR1, LmigOR2 und LmigOrco ) 1 μl Sonde auf 99 μ hinzuL Hybridisierungspuffer pro Folie. Im Allgemeinen erzeugt die Verwendung von 1: 100 Verdünnungen von Antisense-Sonden signifikante positive Signale und niedrige Hintergründe unter Verwendung dieses Protokolls.
   2. Für den chromogenen Nachweis die DIG-markierten Sonden einzeln verdünnen.
   3. Für die TSA-Detektion verdünnen Sie DIG-markiertes LmigOR1 mit Biotin-markierten LmigOrco- Sonden oder DIG-markiertem LmigOR2 mit Biotin-markierten LmigOR1- Sonden zusammen im Hybridisierungspuffer.
   4. Die Verdünnungen 10 min bei 65 ° C erhitzen und mindestens 5 min auf Eis geben.
2. Hybridisierung
   1. Die Folien abtropfen lassen und 100 μl verdünnte Antisense- und Sense-Sonden (Schritt 4.1) zu den Gewebeschnitten hinzufügen. Dann legen Sie Deckellippen (24 mm x 50 mm, nukleasefrei) auf die Gewebeabschnitte.
   2. Legen Sie die bedeckten Schieber horizontal in eine feuchte Schachtel (~ 300 x 180 x 50 mm ³ , Abbildung 2 ) und inkubieren Sie eineT 55 ° C für 22 h. Füge Formamidlösung oder 1X PBS zum Boden der Schachtel hinzu, um die Umgebung feucht zu halten, aber nicht die Schläuche in die Flüssigkeit eintauchen.
3. Waschen und Sperren.
   1. Nach der Hybridisierung die Deckgläser sorgfältig entfernen. Die Folien zweimal für 30 min in 0,1 × Salzlösung Natriumcitrat (SSC) bei 60 ° C waschen.
      HINWEIS: Waschen bedeutet, dass die Objektträger in einen Schiebehalter gelegt werden, der dann in einen Plastikbehälter gelegt wird und sanft auf einer Wippe aufgerührt wird (~ 50 U / min, Abbildung 2 ).
   2. Spülen Sie die Folien in 1x Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) für 30 s.
   3. Füge 1 ml 1% Blockierungsreagenz in TBS hinzu, ergänzt mit 0,03% Triton X-100 auf jedem Objektträger und inkubieren für 30 min. Verwerfen Sie dann die Sperrlösung.
4. Immunhistochemie
   1. Für den chromogenen Nachweis verwenden Sie das Blockierungsreagens in TBS, um 750 Einheiten (U) / ml Anti-Digoxigenin-AP-konjugiertes Antibiotikum zu verdünnenDy bis 1,5 U / ml AP-Lösung. 100 μl AP-Lösung pro abgedeckter (24 mm x 50 mm) Folie zugeben.
   2. Für die TSA-Detektion verwenden Sie das Blockierungsreagens in TBS, um 750 U / ml Anti-Digoxigenin-AP-konjugierter Antikörper und Anti-Biotin-Streptavidin-HRP-konjugierter Antikörper gegen die AP / HRP-Lösung zu verdünnen. 100 μl AP / HRP-Lösung pro abgedeckter (24 mm x 50 mm) Folie zugeben.
   3. Inkubieren Sie die Objektträger in einem feuchten Kasten ( Abbildung 2 ) für 60 min bei 37 ° C. Verwenden Sie die Formamidlösung oder 1X PBS, um die Kiste feucht zu halten, aber nicht matschig.

5. Färbung

1. Entfernen Sie die Deckgläser sorgfältig. Waschen Sie die Dias dreimal für 5 min in 1x TBS, ergänzt mit 0,05% Tween-20. Spülen Sie die Folien im DAP-Puffer (chromogener Nachweis: pH 9,5, TSA-Nachweis: pH 8,0) für 5 min.
2. Färbung (chromogener Nachweis)
   1. 100 & mgr; l NBT (375 & mgr; g / ml) / BCIP (188 & mgr; g / ml) Substratlösung (verdünnt in DAP;PH 9,5) auf jede Folie. Setzen Sie die Deckgläser (24 x 50 mm) sorgfältig auf die Folien auf.
   2. Inkubieren Sie die Objektträger in einem feuchten Kasten mit Substratlösung für 10 min - O / N bei 37 ° C.
      HINWEIS: Überprüfen Sie die Entwicklung, indem Sie die Folien von Zeit zu Zeit unter dem Mikroskop betrachten.
   3. Wenn die Entwicklung fertig ist, stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Objektträger in Wasser übertragen.
3. Färbung (TSA-Erkennung)
   1. Verwenden Sie eine Spritze, um das HNPP (100 μg / ml) / Fast Red (250 μg / mL) Substrat aus dem Spritzenfilter (0,22 μm, Abbildung 2 ) zu bewegen.
   2. Fügen Sie 100 μl HNPP / Fast Red Substrat pro Folie mit einem Deckglas (24 x 50 mm). Inkubieren Sie die Objektträger für 30 min mit HNPP / Fast Red Substrat bei RT.
   3. Entfernen Sie die Deckgläser sorgfältig und waschen Sie die Folien dreimal für 5 min in 1X TBS, ergänzt mit 0,05% Tween-20.
   4. 100 μl TSA-Substrat / überzogen (24 x 50 mm ² ) rutschen Inkubieren Sie die Objektträger mit TSA-Substrat für 10 min bei RT.
   5. Entfernen Sie die Deckgläser sorgfältig und waschen Sie die Folien dreimal für 5 min in 1x TBS, ergänzt mit 0,05% Tween-20.
4. Die Folien in PBS / Glycerin (1: 3) einbetten.
   HINWEIS: Nach Beendigung dieser Vorgänge sollten die Folien so schnell wie möglich beobachtet werden, da das Fluoreszenzsignal schnell abschreckt.

6. Beobachtung

1. Chromogener Nachweis
   1. Gewebeabschnitte mit einem optischen Mikroskop beachten. Wählen Sie die 10X, 20X und 40X Objektiv, um die Ergebnisse der chromogenen Erkennung zu beobachten.
   2. Verwenden Sie DP-BSW Software, um die Ergebnisse zu analysieren und die Bilder zu erfassen.
2. TSA-Erkennung
   1. Gewebeabschnitte mit einem konfokalen Mikroskop beobachten. DIG-markierte Gene sollten unter 543 nm Licht beobachtet werden, die eine rote Farbe aufweisen und Biotin-markierte Gene sein solltenBeobachtet unter 488 nm Licht, präsentiert eine grüne Farbe. Wenn sie auftauchen, präsentieren sie eine gelbe Farbe.
   2. Wählen Sie die 20X- und 40X-Objektivlinsen, um die Ergebnisse der TSA-Erkennung zu beobachten.
   3. Verwenden Sie FV1000 Software, um die Ergebnisse zu analysieren und die Bilder zu erfassen.

Ergebnisse

Bei der chromogenen Detektion wurde eine kleine Teilmenge der Antennenzellen in jedem erwachsenen Antennenabschnitt mit den DIG-markierten LmigOR1- und LmigOR2- Antisense-Sonden bezeichnet ( Abbildung 3 ). RNA ISH auf aufeinanderfolgenden Abschnitten, um LmigOR1 und LmigOR2 zu lokalisieren, zeigten, dass Antennenzellen, die die beiden Gene exprimieren , in ORN-Clustern lokalisiert wurden, die LmigORco...

Diskussion

Es ist schwer, RNA ISH zu lokalisieren, um ODER-Gene in Insektenantennen zu lokalisieren, da die Expressionsniveaus von ODER-Genen, außer ORco , sehr niedrig sind und die Histologie von Insektenantennen bewahrt wird, ist sehr schwierig. Darüber hinaus ist TSA-Erkennung auch sehr schwierig. Um diese Probleme zu lösen, sollten folgende Maßnahmen ergriffen werden. Die Antennen werden aus neu gemahlenen erwachsenen Heuschrecken ausgewählt, die dünne und weiche, natürliche Nagelhaut haben, die ihre Morphologi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
2×TSINGKETM Master Mix	TSINGKE, China	TSE004
RNase-free H2O	TIANGEN, China	RT121-02
REGULAR AGAROSE G-10	BIOWEST, SPAIN	91622
Binding buffer	TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China	DP209-02
Balance buffer	TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China	DP209-02
Wash solution	TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China	DP209-02
T Vector	Promega, USA	A362A
T4 DNA Ligase	Promega, USA	M180A
Escherichia coli DH5α	TIANGEN, China	CB101
Ampicillin	Sigma, USA	A-6140
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Inalco, USA	1758-1400
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside	SBS Genetech, China	GX1-500
Nco I	BioLabs, New England	R0193S
Spe I	BioLabs, New England	R0133M
DIG RNA Labeling Kit	Roche, Switzerland	11175025910
Biotin RNA Labeling Kit	Roche, Switzerland	11685597910
DNase	DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland	11175025910
LiCl	Sinopharm, China	10012718
Ethanol	Sinopharm, China	10009257
Acetic acid	BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China	10000292
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands	4583
Slides	TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China	FISH0010
HCl	Sinopharm, China	80070591
Millex	Millipore, USA	SLGP033RS
Tween 20	AMRESCO, USA	0777-500ML
Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt	Roche, Switzerland	11175041910
Glycerol	Sinopharm, China	10010618
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
1×Tris-acetate-EDTA	Sigma, USA	V900483-1KG	0.04mol/L Tris-Base
1×Tris-acetate-EDTA	BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China	10000292	0.12%acetic acid
1×Tris-acetate-EDTA	Sigma, USA	03677	Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)
Luria-Bertani (LB) liquid medium	Sinopharm, China	10019392	10g/L NaCl
Luria-Bertani (LB) liquid medium	MERCK, Germany	VM335231	10g/L Peptone from casein (Tryptone)
Luria-Bertani (LB) liquid medium	MERCK, Germany	VM361526	5g/L Yeast extract
LB solid substrate plate	Sinopharm, China	10019392	10g/L NaCl
LB solid substrate plate	MERCK, Germany	VM335231	10g/L Peptone from casein (Tryptone)
LB solid substrate plate	MERCK, Germany	VM361526	5g/L Yeast extract
LB solid substrate plate	WISENT ING, Canada	800-010-CG	15g/L Agar Bacteriological Grade
10×phosphate buffer saline (pH7.1)	Sinopharm, China	10019392	8.5%NaCl
10×phosphate buffer saline (pH7.1)	Sigma, USA	V900041-500G	14mM KH2PO4
10×phosphate buffer saline (pH7.1)	Sigma, USA	V900268-500G	80mM Na2HPO4
10×Tris buffered saline (pH7.5)	Sigma, USA	V900483-1KG	1M Tris-Base
10×Tris buffered saline (pH7.5)	Sinopharm, China	10019392	1.5M NaCl
Detection Buffer (DAP)       chromogenic detection pH9.5       TSA detection pH8.0	Sigma, USA	V900483-1KG	100mM Tris-Base
Detection Buffer (DAP)       chromogenic detection pH9.5       TSA detection pH8.0	Sinopharm, China	10019392	100mM NaCl
Detection Buffer (DAP)       chromogenic detection pH9.5       TSA detection pH8.0	Sigma, USA	V900020-500G	50mM MgCl2·6H2O
20×saline-sodium citrate (pH7.0)	Sinopharm, China	10019392	3M NaCl
20×saline-sodium citrate (pH7.0)	Sigma, USA	V900095-500G	0.3M Na-Citrate
4% paraformaldehyde solution (pH9.5)	Sigma, USA	V900894-100G	4% paraformaldehyde
4% paraformaldehyde solution (pH9.5)	Sigma, USA	V900182-500G	0.1M NaHCO3
Sodium Carbonate Buffer (pH10.2)	Sigma, USA	V900182-500G	80mM NaHCO3
Sodium Carbonate Buffer (pH10.2)	Sigma, USA	S7795-500G	120mM Na2CO3
Formamide Solution (pH10.2)	MPBIO, USA	FORMD002	50% Deionized Formamide
Formamide Solution (pH10.2)			5×saline-sodium citrate
Blocking Buffer in Tris buffered saline	Roche, Switzerland	11175041910	1% Blot
Blocking Buffer in Tris buffered saline	AMRESCO, USA	0694-500ML	0.03% Triton X-100
Blocking Buffer in Tris buffered saline			1×Tris buffered saline
Alkaline phosphatase solution	Roche, Switzerland	11175041910	1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody
Alkaline phosphatase solution			Blocking Buffer in Tris buffered saline
Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution	Roche, Switzerland	11175041910	1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody
Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution	TSA kit, Perkin Elmer, USA	NEL701A001KT	1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody
Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution			Blocking Buffer in Tris buffered saline
Hybridization Buffer	MPBIO, USA	FORMD002	50% Deionized Formamide
Hybridization Buffer			2×saline-sodium citrate
Hybridization Buffer	Sigma, USA	D8906-50G	10% dextran sulphate
Hybridization Buffer	invitrogen, USA	AM7119	20 µg/ml yeast t-RNA
Hybridization Buffer	Sigma, USA	D3159-10G	0.2 mg/ml herring sperm DNA
2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate	Roche, Switzerland	11758888001	1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate (10mg/ml)
2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate	Roche, Switzerland	11758888001	1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25mg/ml)
2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate			Detection Buffer
Tyramide signal amplification substrate	TSA kit, Perkin Elmer, USA	NEL701A001KT	2% fluorescein-tyramides
Tyramide signal amplification substrate	TSA kit, Perkin Elmer, USA	NEL701A001KT	Amplification Diluent
Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrument
Freezing microtome	Leica, Nussloch, Germany	Jung CM300 cryostat
Spectrophotometer	Thermo SCIENTIFIC, USA	NANODROP 2000
Optical microscope	Olympus, Tokyo, Japan	Olympus IX71microscope
Confocal microscope	Olympus, Tokyo, Japan	Olympus BX45 confocal microscope