Localizzazione dei geni del recettore degli odoranti nell&#39;antenna di Locust da RNA<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione

Riepilogo

Questo articolo descrive un protocollo dettagliato e altamente efficace di ibridazione in RNA in situ , in particolare per i geni espressi a basso livello del recettore dell'Odorant (OR), così come altri geni, nelle antenne degli insetti utilizzando digoxigenina (DIG) o sonde con biotina.

Abstract

Gli insetti hanno evoluto sofisticati sistemi di accoglienza olfattiva per sensibilizzare i segnali chimici esogeni. Questi segnali chimici sono trasdolati da Neuroni Receptor Olfattivi (ORNs) alloggiati in strutture di capelli, chiamate chemosensilla, delle antenne. Nelle membrane delle ORN, si ritiene che i recettori ordoranti (OR) siano coinvolti nella codifica degli odori. Quindi, essere in grado di identificare i geni localizzati alle ORN è necessario per riconoscere i geni OR e costituisce una base fondamentale per ulteriori studi funzionali in situ . I livelli di espressione di RNA di OR specifici nelle antenne insettici sono molto basse e la conservazione del tessuto degli insetti per l'istologia è impegnativa. Pertanto, è difficile localizzare un OR ad un tipo specifico di sensilla usando l'ibridazione RNA in situ . In questo articolo viene introdotto un protocollo dettagliato e altamente efficace di RNA in situ di ibridazione in particolare per i geni OR insoddisfatti di espressione debole. Inoltre, uno specifico OR Gene waS identificata condurre esperimenti di ibridazione in situ fluorescenti a doppio colore usando un gene recettore co-esprimente, Orco , come marker.

Introduzione

Le antenne degli insetti, che sono gli organi chemo-senoriali più importanti, sono ricoperti da molte strutture del capello, chiamate sensilla, che sono innervate dai neuroni dell'orecchio olfattivo (ORN). Sulla membrana degli ORN insetti, i recettori ordoranti (OR), un tipo di proteina contenente sette domini transmembranti, vengono espressi con un coreceptore (ORco) per formare un eteromero che funge da canale ionico ^{1 , 2 , 3} . ORs differenti rispondono a diverse combinazioni di composti chimici ^{4 , 5 , 6} .

Le locuste ( Locusta migratoria ) si basano principalmente sulle indicazioni olfattive per attivare comportamenti importanti ⁷ . Gli OR Locust sono fattori chiave per comprendere i meccanismi olfattivi molecolari. Localizzare una specifica locusta OR gene al neurone di aTipo sensilismo morfologicamente specifico da RNA In Hybridization In Situ (RNA ISH) è il primo passo per esplorare la funzione OR.

RNA ISH utilizza una sonda RNA complementare etichettata per misurare e localizzare una sequenza specifica di RNA in sezione di tessuti, cellule o montanti interi in situ , fornendo approfondimenti nei processi fisiologici e nella patogenesi della malattia. Sono state ampiamente utilizzate sonde RNA con etichettatura digossigenina (DIG-etichettata) e biotina. L'etichettatura di RNA con digoxigenina-11-UTP o biotina-16-UTP può essere preparata mediante trascrizione in vitro con le polimerasi RNA di SP6 e T7. Le sonde RNA con DIG e biotina hanno i seguenti vantaggi: non radioattivi; sicuro; stabile; Altamente sensibile; Altamente specifiche; E facile da produrre usando PCR e trascrizione in vitro . Le sonde RNA con DIG e biotina possono essere rilevate in modo cromogeno e fluorescente. Le sonde RNA con etichetta DIG possono essere rilevate con anti-digoxigenin AlkaliNe anticorpi concomitanti con fosfatasi (AP) che possono essere visualizzati con substrati chemiluminescenti altamente sensibili nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato toluidina (NBT / BCIP) utilizzando un microscopio ottico o con 2 Acido-2-fenilanilide fosfato (HNPP) accoppiato con sale di cloruro di emiciclo 4-chloro-2-methylbenzenediazonium (Fast Red) utilizzando un microscopio confocale. Le sonde RNA con biotina possono essere rilevate con anticorpi coniugati con anti-biotina streptavidina per rade di rapa perossidasi (HRP) che possono essere visualizzati con tiramidi di fluoresceina usando un microscopio confocale. Così, l'ibridazione in situ fluorescente a doppio colore può essere eseguita per rilevare due geni bersaglio in una fetta usando sonde RNA etichette DIG e biotina.

RNA ISH con sonde DIG e / o biotina è stato utilizzato con successo per localizzare i geni correlati agli olfattivi, come OR , recettore ionotropico, proteina legante odoranteE proteine ​​della membrana del neurone sensoriale, nelle antenne insettuali di, ma non solo, Drosophila melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria e la locusta di deserto Schistocera gregaria ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16} . Tuttavia, ci sono due sfide sostanziali quando si esegue RNA ISH per gli OR di insetti: (1) OR geni (ad eccezione di ORco ) sono espressi a bassi livelli e solo in poche cellule, rendendo molto rilevante il rilevamento del segnale e (2) Istologia, tale che la morfologia sia preservata e il rumore di fondo è basso, può essere impegnativo. In questo documento un protocollo dettagliato ed efficace che descrive RNA ISH per localizzare i geni OR in insettoVengono presentate antenne, tra cui sia la rilevazione cromatica e la tastatura del segnale di tiramide (TSA).

Protocollo

NOTA: per limitare il degrado del RNA, preparare le soluzioni utilizzando acqua distillata autoclavata a umido (a 121 ° C per 60 min) e anche materiali autoclave a umido.

1. Preparazione di RNA ISH Antisense e Sense Probes

1. Amplificazione e purificazione del gene target
   1. Innanzitutto, produrre un frammento a doppio filamento di L. migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) dal plasmide contenente il cDNA di LmigOR1 a piena lunghezza con una polimerasi Taq DNA che aggiunge adenine a entrambe le estremità dei frammenti.
      1. Utilizzare un volume di reazione di 100 μL, contenente 50 μL di miscela di reazione 2x, 4 μl di ciascuno dei sensori di senso e antisenso ( Tabella 1 ), 1 μL di plasmide template e 41 μL di H ₂ O senza RNasi. Utilizzare il seguente PCR Protocollo: 94 ° C per 5 minuti, seguito da 30 cicli di 94 ° C per 30 s, 55 ° C per 30 s e 72 ° C per 1 min, Seguita da 72 ° C per 10 min.
      2. Ripetere questi passaggi per produrre il frammento a doppio filamento di 1,303 bp di LmigOR2 (GenBank: JQ766966) e 1,251 bp frammento a doppio filamento di LmigORco (GenBank: JN989549). I primer utilizzati in questi esperimenti sono presentati nella Tabella 1 .
      3. Eseguire i prodotti PCR su gel agarosio dell'1,2% in tampone 1x Tris-acetato-EDTA e visualizzare utilizzando la colorazione del bromuro di etidio.
   2. Estrarre questi prodotti PCR utilizzando un kit di estrazione del gel.
      1. Dopo l'elettroforesi, inserire le fasce di DNA di accisa dal gel e inserire le fette di gel in un tubo da 1,5 mL. Quindi aggiungere 100 μl di buffer di legame (Buffer PN) per 0,1 g di fetta di gel. Vorticali e incubare a 50 ° C fino a quando la fetta di gel è completamente sciolta.
      2. Inserire una colonna di adsorbimento CA2 nel tubo di raccolta e aggiungere 500 μL di buffer di bilanciamento (Buffer BL). Ciò migliora la capacità di assorbimento e la stabilità della membrana di silice. CentriSi muove a 12.400 xg per 1 min.
      3. Trasferire la miscela di gel dissolta al gruppo di colonna di adsorbimento e incubare a temperatura ambiente per 2 min. Poi, centrifuga i tubi a 12.400 xg per 1 min. Scartare il flusso e reinserire la colonna di adsorbimento nel tubo di raccolta.
      4. Aggiungere due volte 600 μL di soluzione di lavaggio (aggiunta di etanolo, Tampone PW). Centrifugare a 12.400 xg per 1 min. Eliminare il flusso e reinserire la colonna di adsorbimento nel tubo di raccolta.
      5. Svuotare il tubo di raccolta e recuperare nuovamente la colonna a 12.400 xg per 2 minuti per consentire l'evaporazione di qualsiasi etanolo residuo.
      6. Trasferire con cautela la colonna di adsorbimento in un tubo centrifugo da 1,5 ml. Asciugare a pellet il pellet per 5-10 min e ricollegare il DNA in un volume adatto ( ad esempio, 30 μL) di acqua priva di nucleasi.
      7. Incubare a RT per 2 min. Centrifugare a 12.400 xg per 2 min. Scartare la colonna di adsorbimento e memorizzare il DNA a 4 ° C o -20 ° C.
2. Costruire i plasmidi ricombinanti
   1. Individualmente lega il frammento di 387 bp di LmigOR1 , frammento di 1,303 bp di LmigOR2 e 1,251 bp frammento di LmigORco in un vettore T che contiene promotori per polimerasi RNA a T7 (a monte) e SP6 (a valle) adiacenti al DNA inserito usando ligasi del DNA di T4. Preparare la seguente 10 μL di reazione: 5 μL di tampone di legatura 2x, 1 μL di T vettore, 3 μL (~100 ng) del DNA del gene inserito e 1 μl di T4 ligasi DNA e incubare O / N a 4 ° C.
   2. Aggiungere 5 μl di ciascun plasmide ricombinante contenente il frammento di 387 bp di LmigOR1 , 1,303 bp di LmigOR2 e 1,251 bp di LmigORco separatamente in 50 μl di competenti Escherichia coli DH5α in tubi sterili da 1,5 ml.
      1. Mescolare delicatamente e mettere i tubi in ghiaccio per 30 minuti e poi incubarli per 90 s a 42° C. Trasferirli nuovamente in ghiaccio per 3 minuti.
      2. Aggiungere a ciascun tubo 450 μl di mezzo liquido Luria-Bertani (LB) senza ampicillina e incubarli in un agitatore a 150 giri / min per 1 h a 37 ° C per ripristinare l' E. coli DH5α.
      3. Prendere un'aliquota di 100 μl di ciascun trasformante e utilizzarle per inoculare le lastre di substrato solido di LB contenenti ampicillina da 50 μg / ml, 24 μg / mL isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) e 40 μg / ml 5-bromo-4 -chloro-3-indolil-β-D-galattopiranoside (X-gal).
      4. Incubare queste piastre in un incubatore costante a 37 ° C per 18 h. Schermate i plasmidi ricombinanti di destinazione utilizzando il metodo di screening blu-bianco. Sequenza dei plasmidi ricombinanti di destinazione utilizzando sequenziamento di Sanger e identificazione delle direzioni di inserto di tre geni OR.
3. Selezionare endonucleasi di restrizione per linearizzare i plasmidi ricombinanti
   1. Usare endonucleasi di restrizione tIl cappello non solo digerisce nel sito di clonazione multiplo del vettore ma anche non taglia il DNA dell'inserto. In questo esperimento, tutti i 3 geni vengono inseriti nel vettore T nella direzione corrispondente a quella del vettore.
   2. Utilizzare l'endonucleasi di restrizione Nco I per linearizzare i plasmidi ricombinanti contenenti il ​​frammento di 387 bp di LmigOR1 , 1,303 bp di LmigOR2 e 1,251 bp di LmigORco per produrre le sonde antisenso. Utilizzare l'endonucleasi di restrizione Sp e I per produrre le sonde di sensazione.
      NOTA: Se la direzione dell'inserto corrisponde a quella del vettore, viene selezionato un sito di restrizione univoco dalla fine di T7 per linearizzare il plasmide ricombinante e la polimerasi RNA di SP6 viene utilizzata per preparare la sonda antisenso. Un sito unico di restrizione dalla fine dello SP6 viene scelto per linearizzare il plasmide ricombinante e la polimerasi RNA T7 viene utilizzata per preparare la sonda di sensazione. Altrimenti, se la direzione dell'inserto non corrisponde a tLa direzione del vettore, quindi un sito unico di restrizione dalla fine di SP6 viene scelto per linearizzare il plasmide ricombinante e la polimerasi RNA T7 viene utilizzata per preparare la sonda antisenso. Il sito unico di restrizione dalla fine di T7 viene scelto per linearizzare il plasmide ricombinante e la polimerasi RNA di SP6 viene utilizzata per preparare la sonda di senso.
4. Purificando i plasmidi ricombinanti linearizzati
   1. Digest 20 μg ciascuno dei tre plasmidi ricombinanti contenenti il ​​387 bp frammento di LmigOR1 , 1,303 bp frammento di LmigOR2 e 1,251 bp frammento di LmigORco utilizzando l'endonucleasi restriction Nco I in una reazione di 100 μl che contiene 10 μL di tampone 10x, 40 μL di 0,5 μg / μl di plasmide, 3 μL di Nco I e 47 μl di H ₂ O senza RNasi, seguita da un'incubazione di 3 ore a 37 ° C.
   2. Allo stesso modo, digerire 20 μg di ciascuno di questi tre plasmidi ricombinanti uCantare l'endonucleasi di restrizione Spe I.
   3. Purificare questi plasmidi digeriti usando un kit di estrazione del gel come descritto in 1.1.2. Determinare le concentrazioni di questi plasmidi ricombinanti linearizzati estratti mediante spettrofotometria e regolare a 0,5 μg / μL.
5. Preparare antisenso e sonde sensoriali
   1. Utilizzare il sistema di trascrizione RNA T7 / SP6 per generare sonde antisenso e sensori. La polimerasi RNA SP6 è usata per trascrivere RNA a doppio filamento per le sonde antisense DIG e biotina per questi tre geni OR utilizzando plasmidi ricombinanti linearizzati come modelli in vitro . La polimerasi RNA T7 viene utilizzata per produrre sonde di senso. Eseguire la reazione in un volume finale di 20 μl, contenente 2 μL di 10 volte NTP mix, 2 μL di 10X buffer di trascrizione, 1 μL di inibitore della RNasi, 2 μL di T7 o SP6 RNA polimerasi, 4 μL di 0,5 μg / μl di plasmidi linearizzati e 9 μL H ₂ O senza RNasi, seguitiDa un incubo di 3 ore a 37 ° C.
   2. Incubare le sonde antisense e sensori con DIG e biotina per 30 min con 1 μl DNasi a 37 ° C. Aggiungere 2,5 μL di 5 M LiCl e 75 μl di etanolo assoluto, quindi incubare le reazioni per 30 minuti a -70 ° C.
   3. Centrifugare a 15.000 xg per 30 minuti a 4 ° C. Decanta con cautela il surnatante. Aggiungere 150 μl di etanolo al 70% per lavare il precipitante. Preparare l'etanolo al 70% (1 L) aggiungendo l'etanolo al 95% (736.8 mL) in acqua distillata sterile (263.2 mL).
   4. Centrifugare a 15.000 xg per 30 minuti a 4 ° C e asciugare in aria il pellet per 5-10 min a RT. Aggiungere 25 μL di H ₂ O senza RNasi per sciogliere le sonde antisense e sensori RNA.
   5. Se la lunghezza del gene inserito è più lunga di 1 kb, successivamente frammenti di RNA antisenso e sensori a una lunghezza media di ~ 300 bp per incubazione in soluzioni di tampone bicarbonato-carbonato. Eseguire la reazione in un volume finale di 50 μL, cCon 25 μL di sonda RNA e 25 μL di soluzione tampone bicarbonato-carbonato (80 mM NaHCO ₃ , 120 mM Na ₂ CO ₃ , pH 10,2) a 60 ° C. Il tempo di idrolisi richiesto è dato da una formula pubblicata in precedenza ¹⁷ .
   6. Aggiungere 5 μl di 10% di acido acetico per fermare la reazione. In questo esperimento, frammentare i LmigOR2 e LmigORco antisense e sonde di sensazione per 24 e 23 minuti, rispettivamente.
      T = (L _o -L _f ) / kXL _o XL _f
      L _o = lunghezza iniziale del frammento in ca.
      L _f = lunghezza del frammento finale in ca.
      K = la costante di velocità per l'idrolisi, circa 0,11 kb ^-1 min ^-1
      T = tempo di idrolisi in min
   7. Infine, aggiungere 250 μl di tampone di ibridazione e conservare a -80 ° C.

2. Preparazione delle Sezioni del Cryostat

1. Precool il freeziNg del microtomo a -24 ° C.
2. Selezionare le nuove locuste di adulazione adulta che sono attive e che hanno antenne intatte. Tagliare le antenne in pezzi da 2-3 mm utilizzando i rasoi sterili.
3. Mettere il composto OCT su un supporto di microtomo congelante e mettere uno o due campioni sul composto orizzontalmente. Quindi, trasferire il supporto nel microtomo a congelamento a -24 ° C per equilibrare fino a quando il composto si blocca. Estrarre il supporto e coprire i campioni con un piccolo composto. Trasferire il titolare nel microtomo di congelamento a -24 ° C per almeno 10 minuti ( Figura 1 ).
   NOTA: Evitare di ottenere bolle nel composto.
4. Fissare il supporto con i campioni nel microtomo di congelamento, quindi dividere i campioni congelati in fette di 12 μm a -24 ° C.
5. Fissare le fette uno ad uno su diapositive (25 x 75 mm, senza nucleasi) e asciugare all'aria per 10 min.

3. Sezioni di fissaggio

1. Dopo aver preparato il criostatoMettere le diapositive in un contenitore di plastica (~ 100 x 40 x 80 mm) e fissare i tessuti incubando le diapositive in soluzione 4% di paraformaldeide (PFA) per 30 minuti a 4 ° C.
2. Lavare le diapositive in 1X saline fosfato-bufferizzato (PBS) per 1 minuto.
3. Per eliminare le proteine ​​alcaline, trasferire le diapositive a 0,2 M HCl per 10 minuti.
4. Per eliminare la proteina superficiale dell'acido nucleico, trasferire le diapositive a 1XPBS con 1% di Triton X-100 per 2 min.
5. Lavare le diapositive due volte per 30 s in 1x PBS.
6. Infine, sciacquare le diapositive in soluzione formamide per 10 minuti a 4 ° C.

4. Ibridazione

1. Preparare le sonde antisenso e sensore
   1. Utilizzare un tampone di ibridazione per diluire le sonde di antisense o sensori di RNA nei tubi da 1,5 mL senza nucleasi. In questo esperimento, per tutte le sonde antisense e sensori ( LmigOR1, LmigOR2 e LmigOrco ), aggiungere 1 μL di sonda a 99 μL buffer di ibridazione per diapositiva. Generalmente, l'uso di diluizioni 1: 100 di sonde antisenso produce significativi segnali positivi e bassi sfondi utilizzando questo protocollo.
   2. Per il rilevamento cromogenico, provvedere a diluire singolarmente le sonde DIG-etichettate.
   3. Per il rilevamento TSA, diluire DIG marcato LmigOR1 con sonde LmigOrco marcati con biotina o DIG marcato LmigOR2 con biotina marcata LmigOR1 sonde insieme nel tampone di ibridazione.
   4. Scaldare le diluizioni per 10 minuti a 65 ° C e metterle in ghiaccio per almeno 5 min.
2. ibridazione
   1. Scolare le diapositive e aggiungere 100 μL di sonde antisense e sensori diluiti (fase 4.1) alle sezioni del tessuto. Quindi, posizionare le copertine (24 mm x 50 mm, senza nucleasi) sulle sezioni del tessuto.
   2. Posizionare i vetri coperti orizzontalmente in una scatola umida (~ 300 x 180 x 50 mm ³ ; figura 2 ) e incubare unaT 55 ° C per 22 ore. Aggiungere una soluzione di formamide o 1X PBS al fondo della scatola per mantenere l'ambiente umido, ma non immergere le diapositive nel liquido.
3. Lavaggio e blocco.
   1. Dopo l'ibridazione, rimuovete con attenzione le copertine. Lavare le diapositive due volte per 30 minuti in 0,1 x Saline Sodio Citrato (SSC) a 60 ° C.
      NOTA: Lavatrice significa mettere le diapositive in un supporto di scorrimento che viene poi posizionato in un contenitore di plastica e agitato leggermente su un bilanciere (~ 50 rpm; Figura 2 ).
   2. Sciacquare le diapositive in 1x Tris-Buffered Saline (TBS) per 30 s.
   3. Aggiungere 1 ml di reagente di blocco dell'1% in TBS completato con 0,03% di Triton X-100 su ciascuna diapositiva e incubare per 30 min. Quindi, scartare la soluzione di blocco.
4. Immunoistochimica.
   1. Per il rilevamento cromogenico, utilizzare il reagente di bloccaggio in TBS per diluire 750 unità (U) / mL anti-digoxigenina AP-coniugato antiboDa due a 1,5 U / ml soluzione AP. Aggiungere 100 μL di soluzione AP per scivolo coperto (24 mm x 50 mm).
   2. Per la rilevazione di TSA, utilizzare il reagente bloccante in TBS per diluire 750 U / mL di anticorpi anti-digoxigenin AP coniugati e anti-biotina streptavidina HRP-coniugata contro la soluzione AP / HRP. Aggiungere 100 μL di soluzione AP / HRP per uno scivolo coperto (24 mm x 50 mm).
   3. Incubare le diapositive in una scatola umida ( Figura 2 ) per 60 minuti a 37 ° C. Utilizzare la soluzione formamide o 1X PBS per mantenere la scatola umida ma non soglia.

5. Colorazione

1. Rimuovere con attenzione i coperchietti. Lavare le diapositive tre volte per 5 min in 1x TBS integrato con 0,05% di Tween-20. Sciacquare le diapositive in DAP-buffer (rilevazione cromogena: pH 9,5; rilevazione TSA: pH 8,0) per 5 min.
2. Colorazione (rilevazione cromogena)
   1. Aggiungere 100 μL di soluzione NBT (375 μg / mL) / BCIP (188 μg / mL) di substrato (diluito in DAP;PH 9,5) a ogni diapositiva. Posizionare con attenzione i coperchi (24 x 50 mm) sulle diapositive.
   2. Incubare le diapositive in una scatola umida con soluzione di substrato per 10 min - O / N a 37 ° C.
      NOTA: Controllare lo sviluppo guardando le diapositive di tanto in tanto sotto il microscopio.
   3. Quando lo sviluppo è pronto, arrestare la reazione trasferendo le diapositive in acqua.
3. Colorazione (rilevazione TSA)
   1. Utilizzare una siringa per spostare il substrato HNPP (100 μg / mL) / Fast Red (250 μg / mL) dal filtro della siringa (0,22 μm; Figura 2 ).
   2. Aggiungere 100 μL di substrato HNPP / Fast Red per diapositiva ricoperta da una copertura (24 x 50 mm). Incubare le diapositive per 30 min con substrato HNPP / Fast Red a RT.
   3. Rimuovere con cura i vetrini e lavare le diapositive tre volte per 5 minuti in 1X TBS integrato con 0,05% di Tween-20.
   4. Utilizzare 100 μl di substrato TSA / coperto (24 x 50 mm ² ) scorrevole. Incubare le diapositive con substrato TSA per 10 minuti a RT.
   5. Rimuovere le copertine con cura e lavare le diapositive tre volte per 5 min in 1x TBS con 0,05% di Tween-20.
4. Incorporare le diapositive in PBS / glicerolo (1: 3).
   NOTA: Dopo aver terminato queste procedure, le diapositive devono essere osservate il più presto possibile perché il segnale fluorescente si spegnerà rapidamente.

6. Osservazione

1. Rilevamento cromogeno
   1. Osservare le sezioni del tessuto utilizzando un microscopio ottico. Scegli le lenti obiettivo 10X, 20X e 40X per osservare i risultati del rilevamento cromogeno.
   2. Utilizzare il software DP-BSW per analizzare i risultati e acquisire le immagini.
2. Rilevamento TSA
   1. Osservare le sezioni del tessuto utilizzando un microscopio confocale. I geni con etichetta DIG devono essere osservati sotto la luce di 543 nm, presentando un colore rosso e i geni biotinici devono essereOsservata sotto la luce di 488 nm, presentante un colore verde. Quando emergono, presentano il colore giallo.
   2. Scegli le lenti obiettivo 20X e 40X per osservare rispettivamente i risultati del rilevamento TSA.
   3. Utilizzare il software FV1000 per analizzare i risultati e acquisire le immagini.

Risultati

Con rilevazione cromogenica, un piccolo sottoinsieme delle cellule antenne in ogni sezione antenne adulta è stato indicato con le sonde antisense LmigOR1 e LmigOR2 ( Figura 3 ) con DIG. RNA ISH su sezioni consecutive per localizzare LmigOR1 e LmigOR2 ha mostrato che le cellule antennali che esprimono i due geni si trovavano nei cluster ORN che esprimevano LmigORco , indicando che il putativo LmigOR1 e

Discussione

È difficile eseguire RNA ISH per localizzare i geni OR nelle antenne degli insetti perché i livelli di espressione di geni OR, ad eccezione di ORco , sono molto bassi e che preservano fette istologiche di antenne insettiche è molto difficile. Inoltre, il rilevamento di TSA è anche molto complicato. Per risolvere questi problemi, occorre prendere le seguenti misure. Le antenne sono scelte da locuzioni adulte di recente molting che presentano cuticole sottili e morbide di antenne, che mantengono la loro morfo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
2×TSINGKETM Master Mix	TSINGKE, China	TSE004
RNase-free H2O	TIANGEN, China	RT121-02
REGULAR AGAROSE G-10	BIOWEST, SPAIN	91622
Binding buffer	TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China	DP209-02
Balance buffer	TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China	DP209-02
Wash solution	TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China	DP209-02
T Vector	Promega, USA	A362A
T4 DNA Ligase	Promega, USA	M180A
Escherichia coli DH5α	TIANGEN, China	CB101
Ampicillin	Sigma, USA	A-6140
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Inalco, USA	1758-1400
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside	SBS Genetech, China	GX1-500
Nco I	BioLabs, New England	R0193S
Spe I	BioLabs, New England	R0133M
DIG RNA Labeling Kit	Roche, Switzerland	11175025910
Biotin RNA Labeling Kit	Roche, Switzerland	11685597910
DNase	DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland	11175025910
LiCl	Sinopharm, China	10012718
Ethanol	Sinopharm, China	10009257
Acetic acid	BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China	10000292
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands	4583
Slides	TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China	FISH0010
HCl	Sinopharm, China	80070591
Millex	Millipore, USA	SLGP033RS
Tween 20	AMRESCO, USA	0777-500ML
Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt	Roche, Switzerland	11175041910
Glycerol	Sinopharm, China	10010618
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
1×Tris-acetate-EDTA	Sigma, USA	V900483-1KG	0.04mol/L Tris-Base
1×Tris-acetate-EDTA	BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China	10000292	0.12%acetic acid
1×Tris-acetate-EDTA	Sigma, USA	03677	Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)
Luria-Bertani (LB) liquid medium	Sinopharm, China	10019392	10g/L NaCl
Luria-Bertani (LB) liquid medium	MERCK, Germany	VM335231	10g/L Peptone from casein (Tryptone)
Luria-Bertani (LB) liquid medium	MERCK, Germany	VM361526	5g/L Yeast extract
LB solid substrate plate	Sinopharm, China	10019392	10g/L NaCl
LB solid substrate plate	MERCK, Germany	VM335231	10g/L Peptone from casein (Tryptone)
LB solid substrate plate	MERCK, Germany	VM361526	5g/L Yeast extract
LB solid substrate plate	WISENT ING, Canada	800-010-CG	15g/L Agar Bacteriological Grade
10×phosphate buffer saline (pH7.1)	Sinopharm, China	10019392	8.5%NaCl
10×phosphate buffer saline (pH7.1)	Sigma, USA	V900041-500G	14mM KH2PO4
10×phosphate buffer saline (pH7.1)	Sigma, USA	V900268-500G	80mM Na2HPO4
10×Tris buffered saline (pH7.5)	Sigma, USA	V900483-1KG	1M Tris-Base
10×Tris buffered saline (pH7.5)	Sinopharm, China	10019392	1.5M NaCl
Detection Buffer (DAP)       chromogenic detection pH9.5       TSA detection pH8.0	Sigma, USA	V900483-1KG	100mM Tris-Base
Detection Buffer (DAP)       chromogenic detection pH9.5       TSA detection pH8.0	Sinopharm, China	10019392	100mM NaCl
Detection Buffer (DAP)       chromogenic detection pH9.5       TSA detection pH8.0	Sigma, USA	V900020-500G	50mM MgCl2·6H2O
20×saline-sodium citrate (pH7.0)	Sinopharm, China	10019392	3M NaCl
20×saline-sodium citrate (pH7.0)	Sigma, USA	V900095-500G	0.3M Na-Citrate
4% paraformaldehyde solution (pH9.5)	Sigma, USA	V900894-100G	4% paraformaldehyde
4% paraformaldehyde solution (pH9.5)	Sigma, USA	V900182-500G	0.1M NaHCO3
Sodium Carbonate Buffer (pH10.2)	Sigma, USA	V900182-500G	80mM NaHCO3
Sodium Carbonate Buffer (pH10.2)	Sigma, USA	S7795-500G	120mM Na2CO3
Formamide Solution (pH10.2)	MPBIO, USA	FORMD002	50% Deionized Formamide
Formamide Solution (pH10.2)			5×saline-sodium citrate
Blocking Buffer in Tris buffered saline	Roche, Switzerland	11175041910	1% Blot
Blocking Buffer in Tris buffered saline	AMRESCO, USA	0694-500ML	0.03% Triton X-100
Blocking Buffer in Tris buffered saline			1×Tris buffered saline
Alkaline phosphatase solution	Roche, Switzerland	11175041910	1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody
Alkaline phosphatase solution			Blocking Buffer in Tris buffered saline
Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution	Roche, Switzerland	11175041910	1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody
Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution	TSA kit, Perkin Elmer, USA	NEL701A001KT	1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody
Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution			Blocking Buffer in Tris buffered saline
Hybridization Buffer	MPBIO, USA	FORMD002	50% Deionized Formamide
Hybridization Buffer			2×saline-sodium citrate
Hybridization Buffer	Sigma, USA	D8906-50G	10% dextran sulphate
Hybridization Buffer	invitrogen, USA	AM7119	20 µg/ml yeast t-RNA
Hybridization Buffer	Sigma, USA	D3159-10G	0.2 mg/ml herring sperm DNA
2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate	Roche, Switzerland	11758888001	1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate (10mg/ml)
2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate	Roche, Switzerland	11758888001	1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25mg/ml)
2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate			Detection Buffer
Tyramide signal amplification substrate	TSA kit, Perkin Elmer, USA	NEL701A001KT	2% fluorescein-tyramides
Tyramide signal amplification substrate	TSA kit, Perkin Elmer, USA	NEL701A001KT	Amplification Diluent
Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrument
Freezing microtome	Leica, Nussloch, Germany	Jung CM300 cryostat
Spectrophotometer	Thermo SCIENTIFIC, USA	NANODROP 2000
Optical microscope	Olympus, Tokyo, Japan	Olympus IX71microscope
Confocal microscope	Olympus, Tokyo, Japan	Olympus BX45 confocal microscope