JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الخميرة المعدلة اختبار واحد الهجين وصفها هنا هو امتداد الخميرة الكلاسيكية واحد الهجين (Y1H) فحص لدراسة والتحقق من صحة البروتين هيتيروميريك معقدة التفاعل الحمض النووي في نظام غير متجانسة لأي دراسة الجينوم وظيفية.

Abstract

على مر السنين، وقد أثبتت الخميرة اختبار واحد الهجين لتكون تقنية هامة لتحديد والتحقق من التفاعلات المادية بين البروتينات مثل عوامل النسخ (تفس) وهدف الحمض النووي. الطريقة المعروضة هنا تستخدم المفهوم الأساسي لل Y1H ولكن يتم تعديلها كذلك لدراسة والتحقق من صحة المجمعات البروتين ملزمة للحمض النووي المستهدف. وبالتالي، فإنه يشار إلى الخميرة المعدلة واحد الهجين (Y1.5H) فحص. هذا الفحص هو فعالة من حيث التكلفة ويمكن تنفيذها بسهولة في إعداد المختبر العادية. على الرغم من استخدام نظام غير متجانسة، يمكن أن تكون الطريقة الموصوفة أداة قيمة لاختبار والتحقق من صحة بروتين هتيروميريك مجمع ملزم لهدفها (ق) الحمض النووي لعلم الجينوم وظيفية في أي نظام للدراسة، وخاصة الجينوم النبات.

Introduction

بشكل عام، لفهم التفاعلات البروتين الحمض النووي، وفحص Y1H هو النظام المفضل تستخدم بنجاح في إعداد مختبر 1 . يتضمن مقايسة Y1H الأساسية عنصرين: أ) بناء مراسل مع الحمض النووي من الفائدة المستنسخة بنجاح المنبع من الجينات ترميز بروتين مراسل. و ب) بناء التعبير الذي سيولد البروتين الانصهار بين تف الفائدة ومجال تنشيط النسخ الخميرة (أد). ويشار إلى الحمض النووي من الفائدة عادة باسم "الطعم" في حين أن البروتين الانصهار المعروف باسم "فريسة". في السنوات الماضية، وقد وضعت إصدارات متعددة من مقايسة Y1H لتناسب احتياجات محددة مع مزاياها الخاصة 2 . ويمكن تنفيذ مقايسة Y1H الحالية بنجاح لتحديد والتحقق من صحة التفاعل من بروتين واحد في وقت واحد مع الطعم الحمض النووي، ولكن يفتقر إلى القدرة على تحديد هيتيروديمريك أو مولتيمريك التفاعلات الحمض النووي البروتين.

"> الطريقة الموصوفة هنا هي نسخة معدلة من Y1H القائمة تمكن الباحثين من دراسة البروتينات المتعددة في الوقت نفسه ملزمة لتسلسل الحمض النووي المستهدف لها.والهدف من هذا الفحص هو التعبير عن البروتين من الاهتمام مع مجال التنشيط (pDEST22: تف) وتقييم تفعيل مناطق الحمض النووي المرشح تنصهر لمراسل في وجود و / أو عدم وجود شريك البروتين التفاعل (pDEST32ΔDBD-تف) في نظام الخميرة، وهذا الفحص يسمح لنا لتحديد ما إذا كان التفاعل بين هذين هناك حاجة إلى البروتينات لتنشيط الهدف.هذا هو نظام متوافق الاستنساخ غيتيواي، وبالتالي من الممكن استخدامها في إعداد المختبر العادية.وتستند هذه ثروبوتروكول على التحول المباشر، والذي يوفر سهولة التحول المشترك لمختلف تفس في نظام الخميرة ، وبالتالي، فإنه هو استراتيجية مفيدة للتحقق من صحة المجمعات البروتين ملزمة لأهداف الحمض النووي المحتملة لفي المختبر الجزيئية والتحقق وظيفية وأو أي نظام. التقنيات الحالية مثل طرق تقارب جنبا إلى جنب (تاب) أساليب مكلفة والعمل كثيفة ولكن تسمح الكشف عن البروتين هيتروكومبلكسس على نطاق واسع 3 ، 4 ، 5 . هذا الخميرة المعدلة واحد الهجين يمكن أن يؤديها بنجاح في إعداد مختبر منتظم على نطاق صغير ( الشكل 1 ) وأيضا فعالة من حيث التكلفة. يمكن لفحص Y1.5H تسهيل الباحثين في جميع أنحاء المجتمع لاختبار والتحقق من صحة فرضيتهم نحو تحديد دور البروتين مولتيمريك معقدة ملزمة هدف الحمض النووي المشترك باستخدام نظام غير متجانسة. واستنادا إلى النتائج، يمكن التحقق من صحة الفرضية في الجسم الحي في النظام المفضل للدراسة. في الآونة الأخيرة، استخدمنا هذا النهج لتحديد دور تف وطريقة عملها لتنظيم المزهرة في أرابيدوبسيس 6 .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إنشاء والمراسل إعداد البلازميد

  1. ير تضخيم مناطق المروج / "شظايا" (ويفضل ~ 250 - 500 نقطة أساس) من الحمض النووي المستهدف ليتم تحليلها لمزيد من الاستنساخ في ناقلات دخول باستخدام E. القولونية (TOP10).
  2. على تأكيد التسلسل، سوبكلون استنساخ إيجابي في متجه التعبير بلاتشي متوافق 7 كما هو موضح سابقا 8 ، 9 ، 10 ، 11 .
  3. تحويل سلالة الخميرة لدمج المروج (YM4271) عن طريق إعادة التركيب مثلي من بلاتشي لتوليد سلالة مراسل الخميرة كما هو موضح في وقت سابق 12 ، 13 . لم يتم وصف خطوات التحول والتأكيد من سلالة الخميرة مع منطقة الحمض النووي جنبا إلى جنب مع وصفة من وسائل الإعلام هنا، وخطوات مشابهة لبروتوكول Y1H الكلاسيكيةأس = "كريف"> 9 ، 10 ، 11 ، 12 ، 13 . و بيكسسب-AD502 السيطرة البلازميد يمكن استخدامها لأغراض التطبيع في حين كوانتيفيينغ β-غالاكتوزيداز النشاط كما هو موضح سابقا 8 .
  4. استنساخ تف أو البروتين من الفائدة واستنساخ في وقت لاحق شريك البروتين التفاعل في pDEST22 و pDEST32ΔDBD (pdEST32 ناقص المجال دنا ملزمة) ناقلات التعبير. وتستخدم بعد ذلك شظايا المروج الخميرة تحول واستنساخ تف مزيد من ذلك في البروتوكول.

2. تعديل بروتوكول Y1.5H

  1. في يوم 1 (بعد الظهر)، تبدأ مع 5 مل من الثقافة في سد-أورا من طبق بيتري أو الجلسرين الأسهم واحتضان بين عشية وضحاها في شاكر 30 درجة مئوية.
    ملاحظة: هذه الثقافة يمكن أن تبدأ من لوحة متسلسلة حديثا أو مباشرة من 25٪ أو 30٪ من الجلسرين الأسهم من الخميرةاستنساخ مع جزء الحمض النووي.
  2. في يوم 2 (بعد الظهر)، تطعيم 10 مل من وسائل الإعلام يبدا مع 500 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها واحتضان بين عشية وضحاها في شاكر 30 درجة مئوية.
  3. يوم 3 (في الصباح الباكر وبعد الظهر كله): إعداد الخلايا المختصة (في الصباح الباكر).
    1. تطعيم 100 مل من وسائل الإعلام يبدا مع 2 مل من الثقافة بين عشية وضحاها واحتضان في شاكر 30 درجة مئوية. تنمو هذه الثقافة الطازجة حتى أود 600 يصل 0.4-0.8 (3-5 ح).
      ملاحظة: تحقق أود 600 من الثقافة بين عشية وضحاها والتأكد من أن نقطة البداية أود 600 لهذه الخطوة هي 0،1-0،2. قد يؤدي استخدام الثقافة الزائدة أو الأقل نموا إلى إطالة مدة التجربة.
    2. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1000 x ج و 21 درجة مئوية. تجاهل طاف.
    3. إعادة الكريات في 10 مل من الماء المعقم باستخدام دوامة أو بيبتينغ صعودا وهبوطا.
    4. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1000 x ج و 21 درجة مئوية. تجاهل طاف.
    5. Reconstituتي الكريات في 2 مل من تريس-إثيلينديامينيتتراسيتيكاسيد (تي) / خلات الليثيوم (لياك) باستخدام دوامة أو بيبتينغ صعودا وهبوطا.
      ملاحظة: يرجى الاطلاع على وصفة ل تي / لياك في الجدول 1 .
    6. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق 1000 x ج و 21 درجة مئوية. تجاهل طاف.
    7. إعادة تعليق بيليه في 4 مل من تي / لياك + 400 ميكرولتر من الدنا السلمون الحيوانات المنوية (10 ملغ / مل) بيبتينغ صعودا وهبوطا والمضي قدما في الخطوة التالية.
  4. شارك في التحول: صدمة الحرارة الخلايا (في وقت متأخر من بعد الظهر)
    1. توزيع 20 ميكرولتر من الخلايا لكل بئر في لوحة خلط 96 جيدا (U- القاع).
    2. إضافة 150 نانوغرام (~ 1.5 ميكرولتر) كل من pdEST22: بلازميد تف، pDEST32ΔDBD: تف بلازميد و بيكس-AD502 زائد pdest32ΔDBD: تف (السيطرة التطبيع) إلى الآبار.
      ملاحظة: ومن المتوقع النتائج المثلى مع ~ 150 نانوغرام لكل من pdEST22: تف و pDEST32ΔDBD: تف البلازميد لنجاح المشاركة في التحول. يمكن أن تختلف مع بناء والتعبيرات البلازميد، وبالتاليتحتاج إلى أن يكون الأمثل مع كل تجربة. ويمكن أيضا التحكم PDEST22-تف آخر زائد pDEST32deltaDBD يمكن أن تدرج في تقدير المستخدم.
    3. إضافة 100 ميكرولتر من تي / لياك / البولي ايثيلين جلايكول (بيج) لكل بئر ( مزيج ثلاث مرات ).
      ملاحظة: يرجى الاطلاع على وصفة تي / لياك / بيج في الجدول 1 .
    4. تغطية لوحة مع ختم تنفس واحتضان لمدة 20-30 دقيقة (يمكن أن تكون أطول) في 30 درجة مئوية (أي الإثارة اللازمة).
    5. صدمة الحرارة لمدة 20 دقيقة (على وجه التحديد ) في 42 درجة مئوية.
  5. لوحة الخلايا.
    1. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1000 x ج و 21 درجة مئوية. إزالة طاف باستخدام ماصة الأقنية. إضافة 110 ميكرولتر من تي والمزيج.
    2. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1000 x ج و 21 درجة مئوية. إزالة 100 ميكرولتر من طاف باستخدام ماصة الأقنية. إعادة تعليق بيليه مع الناخس.
    3. نقل الخلايا على لوحات أجار سد-ترب-ليو . احتضان لوحاتفي 30 درجة مئوية حتى الخطوة التالية.
  6. اليوم 5 (بعد الظهر): نقل الخلايا على لوحات جديدة باستخدام الناخس / ميكروبلات المكرر.
    1. ملء معقمة 96-جيدا لوحة خلط (U- القاع) مع 50 ميكرولتر من تي باستخدام ماصة الأقنية. قبل الرطب الناخس في تي.
      ملاحظة: يجب تعقيم الناخس أو المكرر صفيحة ميكروسكوبية قبل هذه الخطوة وبعد ذلك في وقت لاحق في البروتوكول. الطريقة الشائعة لتعقيم الناخس مثل غمر في الإيثانول (100٪، وليس البيولوجيا الجزيئية الصف) ومن ثم حرقه إلى لهب يمكن تطبيقها. انتظر لمدة 1 دقيقة لتبريد دبابيس الناخس.
      الحذر: إذا كان تنفيذ التعقيم على مقاعد البدلاء. تأكد من مقعد قبل تنظيفها مع الإيثانول وخالية من أي مواد قابلة للاحتراق حولها. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة (ب).
    2. لكمة المستعمرات وإعادة تعليق في لوحة مليئة تي.
      ملاحظة: إذا كان هناك نمو سلس على لوحة، والمستعمرات يمكن لكمات مباشرةإلى لوحة مليئة تي أو بدلا من ذلك، مستعمرة واحدة (في حالة المستعمرات متعددة) ينبغي أن يتم اختيارها باستخدام مسواك معقمة إلى لوحة تي شغلها وبعد ذلك الناخس يمكن استخدامها للخطوة التالية.
    3. نقلها على لوحات أجار سد-ترب-ليو جديدة للتغطية السطحية المثلى. احتضان لوحات في 30 درجة مئوية حتى الخطوة التالية.
  7. يوم 7 (بعد الظهر): بدء الثقافة لقياس النشاط β-غالاكتوزيداز.
    1. ملء معقمة 96-جيدا لوحة خلط (U- القاع) مع 50 ميكرولتر من وسائل الإعلام سد-ترب ليو باستخدام ماصة الأقنية.
    2. ملء معقمة 96 كتلة عميقة مع 180 ميكرولتر من وسائل الإعلام سد-ترب ليو باستخدام ماصة الأقنية.
    3. قبل الرطب الناخس في وسائل الإعلام ونقل المستعمرات من لوحة إلى 50 ميكرولتر من وسائل الإعلام.
    4. نقل 20 ميكرولتر من الخميرة إلى 180 ميكرولتر من وسائل الإعلام سد-ترب ليو وختم كتلة مع ختم تنفس. احتضانلمدة 36 ساعة عند 30 درجة مئوية شاكر.
  8. يوم 9 (الصباح): بدء ثقافة لقياس الأنزيمية.
    1. نقل 100 ميكرولتر من الثقافة إلى 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام يبدا في تعقيم 96 كتلة بئر عميقة.
    2. تغطية لوحة معقمة جيدا جيدا مع ختم تنفس واحتضان لمدة 3 - 5 ساعات في 30 درجة مئوية مع التحريض في 200 دورة في الدقيقة (حتى أود 600 0.3-0.6).
    3. إعادة تعليق الثقافة ونقل 125 ميكرولتر باستخدام ماصة الأقنية على لوحة مطياف (قياس أود 600 ).
      ملاحظة: الحذر: لا الاستغناء عن آخر قطرة لتجنب فقاعات، إذا كان أود 600 أقل من 0.3 - 0.6، احتضان الخلايا المتبقية لمدة 1 - 2 ساعة أكثر استنادا إلى القراءة. ثقافة 125 ميكرولتر المستخدمة في هذه الخطوة يمكن التخلص منها أو نقلها إلى كتلة بئر عميقة الأصلي وفقا لتقدير المستخدم.
    4. أجهزة الطرد المركزي الخلايا المتبقية في كتلة بئر عميقة لمدة 10 دقيقة في 3000 x ج و 21 درجة مئوية. إزالة سوبرناتانt عن طريق عكس.
    5. إضافة 200 ميكرولتر من Z- العازلة ودوامة.
      ملاحظة: يرجى الاطلاع على وصفة ل Z- العازلة في الجدول 1 .
    6. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 3000 x ج و 21 درجة مئوية. إزالة طاف عن طريق عكس.
    7. إضافة 20 ميكرولتر Z العازلة ودوامة.
    8. تغطية لوحة مع ختم احباط التي يمكن أن تقاوم دورات تجميد ذوبان الجليد. أداء 4 دورات من تجميد / ذوبان الجليد باستخدام النيتروجين السائل في غطاء الدخان ثم 42 درجة مئوية في حمام مائي (2 دقيقة لكل منهما).
    9. إضافة 200 ميكرولتر Z- العازلة / بيتا ميركابتويثانول (β-مي) / أورثو نيتروفينيل-β- غالاكتوزيد (أونبغ) (12 مل، 21 ميكرولتر، 8.4 ملغ على التوالي سوف تسفر عن حل 20 مل، وإعداد دائما الطازجة ).
      ملاحظة: سوف أونب يستغرق بعض الوقت لتذوب بشكل صحيح حتى إعداد الحل ساعة قبل الوصول إلى هذه الخطوة. أونب بمثابة الركيزة لقياس النشاط β غالاكتوزيداز.
    10. احتضان ما يصل إلى 17 حتي 24 ساعة في 30 درجة مئوية (تحقق بين، إذا كان اللون يتطور في وقت سابق بيأرانتقل إلى الخطوة التالية).
  9. يوم 10 (الصباح): وقف رد فعل وقياس.
    1. إضافة 110 ميكرولتر 1M نا 2 كو 3 لوقف رد الفعل وتسجيل الوقت.
    2. دوامة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 3000 x ج و 21 درجة مئوية.
    3. خذ 125 ميكرولتر من طاف باستخدام متعددة القنوات وقياس أود 420 .
      ملاحظة: الحذر، لا الاستغناء عن آخر قطرة لتجنب فقاعات.
    4. حساب النشاط β غال: 1000 × أود 420 / (الوقت (دقيقة) x حجم (مل) x أود 600 في جدول بيانات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

إعداد لوحة العامة الإجراء لإجراء التحول المشترك من مناطق الحمض النووي في خلايا الخميرة مع البروتين من الفائدة ( الشكل 2 ). يمكن إعداد لوحة المتابعة وفقا للحاجة إلى التجربة وعدد من مناطق الحمض النووي / شظايا اختبارها. بعد يوم 5 من البرو?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

الإجراء القياسي Y1H الحالي هو مناسبة لتحديد فريسة واحدة من البروتين فريسة ملزمة لطعم الحمض النووي. مع التعديلات الفنية المختلفة، تم تسخير النظام الحالي لتحديد الشبكات التنظيمية النسخي. ومع ذلك، من المعروف أن تفس تعمل كجزء من المجمعات التي تنطوي على اثنين أو أكثر من ت?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

لا يعلن المؤلفون أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نشكر سس وانغ، M. عمار و A. غالا على قراءة نقدية للمخطوطة. تم دعم البحوث الواردة في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة في المعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة RO1GM067837 و RO1GM056006 (إلى ساك). المحتوى هو فقط من مسؤولية المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
pDEST22 vectorInvitrogenPQ1000101Pro-Quest Two hybrid system kit
pDEST32delatDBDInvitrogenPQ1000102Pro-Quest Two hybrid system kit; this vecor is modified. It is pDEST32 minus DNA binding Domain
pENTR/D-TOPO Cloning KitInvitrogenK240020
YM4271 StrainClontechK1603-1MATCHMAKER One-Hybrid System
pEXP-AD502InvitrogenPQ1000101Pro-Quest Two hybrid system kit
GATEWAY LR Clonase II enzyme mixInvitrogen11791020
YPDA mediaClontech630410
SD-AgarClontech630412
SD minimal mediaClontech630411
Uracil DO SupplementClontech630416
Tryptophan Do SupplementClontech630413
Tris BaseFisher ScientificBP152-1
EDTAFisher ScientificS311-500
LiAcSigma-AldrichL4158
Saplmon Sperm (10mg/ml)Invitrogen15632011
96 well round bottom PlateGreiner bio-one650101
PEG3350Sigma-Aldrich1546547
96-deep well blockUSA Scientific1896-2000
Sealable FoilUSA Scientific2923-0110
ArasealExcel ScientificB-100
2-mercaptoethanolFisher Scientific034461-100
ONPGSigma-Aldrich73660
Na2CO3Sigma-Aldrich223484
Na2HPO4 Sigma-AldrichS3264
NaH2PO4 Sigma-AldrichS3139
KCLFisher ScientificBP366-500
MgSO4 Sigma-Aldrich83266
HCLFisher ScientificSA54-4
DrybathThermo Fischer
VoretxThermo Fischer
CentrifgueEppendorfCentrifuge 5810R
Plate ReaderMolecular DeviceSPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer
IncubatorThermo FisherModel No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees
Shaker IncubatorNew Brunswick
Water BathThermo FisherIsoTemp 205
Puncher
50 ml FalocnBD Falcon
BeakerNalgene
FlaskNalgene
Petriplates (150mm)Greiner bio-one

References

  1. Saghbini, M., Hoekstra, D., Gautsch, J. Media formulations for various two-hybrid systems. Methods Mol Biol. 177, 15-39 (2001).
  2. Reece-Hoyes, J. S., Marian Walhout, A. J. Yeast one-hybrid assays: A historical and technical perspective. Methods. 57 (4), 441-447 (2012).
  3. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
  4. Puig, O., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
  5. Gavin, A. -C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
  6. Tripathi, P., Carvallo, M., Hamilton, E. E., Preuss, S., Kay, S. A. Arabidopsis B-BOX32 interacts with CONSTANS-LIKE3 to regulate flowering. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (1), 172-177 (2017).
  7. Helfer, A., et al. LUX ARRHYTHMO encodes a nighttime repressor of circadian gene expression in the Arabidopsis core clock. Curr Biol : CB. 21 (2), 126-133 (2011).
  8. Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Rep. 8 (2), 622-632 (2014).
  9. Wanke, D., Harter, K. Analysis of Plant Regulatory DNA sequences by the Yeast-One-Hybrid Assay. Methods Mol Biol. 479, 291-309 (2009).
  10. Klein, P., Dietz, K. -J. Identification of DNA-Binding Proteins and Protein-Protein Interactions by Yeast One-Hybrid and Yeast Two-Hybrid Screen. Methods Mol Biol. 639, 171-192 (2010).
  11. Breton, G., Kay, S. A., Pruneda-Paz, J. L. Identification of Arabidopsis Transcriptional Regulators by Yeast One-Hybrid Screens Using a Transcription Factor ORFeome. Methods Mol Biol. 1398, 107-118 (2016).
  12. Deplancke, B., Vermeirssen, V., Arda, H. E., Martinez, N. J., Walhout, A. J. M. Gateway-Compatible Yeast One-Hybrid Screens. CSH Protoc. 2006 (5), (2006).
  13. Deplancke, B., Dupuy, D., Vidal, M., Walhout, A. J. M. A gateway-compatible yeast one-hybrid system. Genome Res. 14 (10B), 2093-2101 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

125

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved