Модифицированная дрожжевая гибридная система для исследований комплексных ДНК-гетерогенных белков

Резюме

Модифицированный дрожжевой одногибридный анализ, описанный здесь, является расширением классического дрожжевого одногибридного (Y1H) анализа для изучения и проверки гетеромерного белкового комплекса-ДНК-взаимодействия в гетерологичной системе для любого исследования функциональной геномики.

Аннотация

На протяжении многих лет дрожжевой одногибридный анализ оказался важным методом идентификации и подтверждения физических взаимодействий между белками, такими как транскрипционные факторы (ТФ) и их ДНК-мишень. Представленный здесь метод использует основную концепцию Y1H, но модифицируется далее для изучения и проверки связывания белковых комплексов с их ДНК-мишенью. Следовательно, он упоминается как модифицированный дрожжевой одногибридный (Y1.5H) анализ. Этот анализ экономичен и может быть легко выполнен в обычной лабораторной обстановке. Несмотря на использование гетерологичной системы, описанный способ может быть ценным инструментом для проверки и проверки связывания гетеромерного белкового комплекса с их ДНК-мишенью (ами) для функциональной геномики в любой системе исследования, особенно в геноме растений.

Введение

В общем, для понимания взаимодействия белок-ДНК анализ Y1H является предпочтительной системой, успешно используемой в лабораторных условиях ¹ . Основной анализ Y1H включает в себя два компонента: а) репортерную конструкцию с интересной ДНК, успешно клонированной выше гена, кодирующего репортерный белок; И b) конструкцию экспрессии, которая будет генерировать слитый белок между TF интересом и доменом активации транскрипции (AD). Интересную ДНК обычно называют «приманкой», в то время как слитый белок известен как «жертва». В прошлые годы были разработаны несколько вариантов анализа Y1H с учетом особых потребностей ² . Существующий анализ Y1H может быть успешно реализован для идентификации и подтверждения взаимодействия одного белка за один раз с его приманкой ДНК, но не обладает способностью идентифицировать гетеродимерные или мультимерные белковые ДНК-взаимодействия.

«> Метод, описанный здесь, представляет собой модифицированную версию существующих Y1H, позволяющих исследователям одновременно изучать множественные белки, связывающиеся с их последовательностью (ами) ДНК-мишени. Целью этого анализа является выражение интересующего белка с доменом активации (pDEST22: TF) и оценивают активацию областей ДНК-кандидатов, слитых с репортером, в присутствии и / или отсутствии взаимодействующего белкового партнера (pDEST32ΔDBD-TF) в дрожжевой системе. Этот анализ позволит нам определить, является ли взаимодействие между этими двумя Белки необходимы для активации мишени.Это совместимая с клонированием система GATEWAY, и поэтому ее можно использовать в обычной лабораторной установке.Этопротокол основан на прямой трансформации, что обеспечивает легкость коразрушения различных ТФ в дрожжевой системе Таким образом, выгодной стратегией является проверка связывания белковых комплексов с их возможными целями ДНК для молекулярной и функциональной валидации in vitro fИли любой системы. Современные методы, такие как методы тандемой аффинной очистки (TAP), являются дорогостоящими и трудоемкими, но позволяют обнаруживать белковые гетерокомплексы в больших масштабах ^{3 , 4 , 5} . Этот модифицированный дрожжевой гибрид может быть успешно выполнен в обычной лабораторной обстановке в небольшом масштабе ( рисунок 1 ), а также экономически эффективен. Анализ Y1.5H может помочь исследователям всего сообщества проверить и обосновать свою гипотезу в отношении определения роли связывания многомерного белкового комплекса с общей ДНК-мишенью с использованием гетерологичной системы. Основываясь на полученных данных, гипотеза может быть подтверждена in vivo в предпочтительной системе исследования. В последнее время мы использовали этот подход для определения роли ТФ и его способа действия для регулирования цветения в Arabidopsis ⁶ .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Конструирование и репортерная плазмидная подготовка.

1. ПЦР амплифицируют промоторные области / «фрагменты» (предпочтительно ~ 250-500 п.о.) ДНК-мишени, подлежащие анализу, для дальнейшего клонирования в векторе-записи с использованием E. coli (TOP10).
2. После подтверждения последовательности субклонеруйте положительный клон в совместимом векторе экспрессии pGLacZi ^7, как описано выше ^{8 , 9 , 10 , 11} .
3. Трансформируйте дрожжевой штамм для интеграции промотора (YM4271) путем гомологичной рекомбинации pGLacZi для генерации дрожжевого репортерного штамма, как описано ранее ^{12 , 13} . Этапы трансформации и подтверждения дрожжевого штамма с областью ДНК вместе с рецептом среды здесь не описаны, поскольку этапы аналогичны классическому протоколу Y1HAss = "xref"> 9 ^{, 10 , 11 , 12 , 13} . Контрольную плазмиду pEXP-AD502 можно использовать для целей нормализации при количественной активности β-галактозидазы, как описано ранее ⁸ .
4. Клонировать TF или белок, представляющий интерес, и затем клонировать взаимодействующего белкового партнера в векторы экспрессии pDEST22 и pDEST32ΔDBD (pDEST32 минус ДНК-связывающий домен). Трансформированные фрагменты промотора дрожжей и клоны TF впоследствии используются далее в протоколе.

2. Измененный протокол Y1.5H

1. На 1-й день (второй день) начните с 5 мл культуры в SD-Ura из чашки Петри или глицерина и инкубируйте в течение ночи в шейкере 30 ° C.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Эта культура может быть запущена из свежезаваренной пластины или непосредственно из 25% или 30% глицеринового запаса дрожжейКлоном с фрагментом ДНК.
2. На второй день (второй день) инокулируют 10 мл среды YPDA с 500 мкл ночной культуры и инкубируют в течение ночи в шейкере 30 ° C.
3. День 3 (рано утром и весь день): Подготовьте компетентные камеры (рано утром).
   1. Инокулируют 100 мл среды YPDA с 2 мл ночной культуры и инкубируют в шейкере 30 ° C. Выращивайте эту свежую культуру до тех пор, пока OD _{600 не} достигнет 0,4-0,8 (3-5 часов).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Проверьте OD ₆₀₀ культуры ночной жизни и убедитесь, что начальная точка OD ₆₀₀ для этого шага составляет 0,1 - 0,2. Использование чрезмерной или недоразвитой культуры может продлить эксперимент.
   2. Центрифуга в течение 5 мин при 1000 xg и 21 ° C. Отбросьте супернатант.
   3. Восстановить гранулы в 10 мл стерильной воды с использованием вихря или пипетирования вверх и вниз.
   4. Центрифуга в течение 5 мин при 1000 xg и 21 ° C. Отбросьте супернатант.
   5. ReconstituТ. Е. В 2 мл трис-этилендиаминтетрауксусной кислоты (TE) / ацетата лития (LiAc) с использованием вихря или пипетирования вверх и вниз.
      ПРИМЕЧАНИЕ. См. Рецепт TE / LiAc в таблице 1 .
   6. Центрифуга в течение 5 мин 1000 xg и 21 ° C. Отбросьте супернатант.
   7. Повторно суспендируйте таблетку в 4 мл TE / LiAc + 400 мкл ДНК спермы лосося (10 мг / мл), пипетируя вверх и вниз и переходите к следующей стадии.
4. Со-трансформация: тепловой удар клеток (поздно днем)
   1. Распределите 20 мкл клеток на лунку в 96-луночном смесительном планшете (U-bottom).
   2. Добавьте 150 нг (~ 1,5 мкл) из каждой плазмиды pDEST22: TF, плазмиды pDEST32ΔDBD: TF и ​​pEXP-AD502 плюс pDEST32ΔDBD: TF (контроль нормализации) в лунки.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Оптимальные результаты ожидаются с ~ 150 нг каждого из pDEST22: TF и ​​pDEST32ΔDBD: TF-плазмиды для успешного коразрушения. Может варьироваться в зависимости от выражений конструкции и плазмиды,Необходимо оптимизировать с каждым экспериментом. Другой контроль pDEST22-TF plus pDEST32deltaDBD также может быть включен по усмотрению пользователя.
   3. Добавить 100 мкл TE / LiAc / полиэтиленгликоля (ПЭГ) на лунку ( смесь три раза ).
      ПРИМЕЧАНИЕ. См. Рецепт TE / LiAc / PEG в таблице 1 .
   4. Накройте пластину воздухопроницаемым уплотнением и инкубируйте в течение 20-30 минут (может быть дольше) при 30 ° C (без необходимости перемешивания).
   5. Тепловой удар в течение 20 мин ( точно ) при 42 ° C.
5. Пластируйте ячейки.
   1. Центрифуга в течение 5 мин при 1000 xg и 21 ° C. Удалите супернатант с помощью многоканальной пипетки. Добавить 110 мкл TE и перемешать.
   2. Центрифуга в течение 5 мин при 1000 xg и 21 ° C. Удалите 100 мкл супернатанта с помощью многоканальной пипетки. Повторно суспендируйте таблетку с помощью перфоратора.
   3. Перенесите клетки на пластинки агара SD-Trp-Leu . Инкубационные пластиныПри 30 ° C до следующего шага.
6. День 5 (вторая половина дня): Перенесите клетки на новые пластины с помощью репликатора перфоратор / микропланшет.
   1. Заполните стерильную 96-луночную смесительную пластину (U-bottom) с 50 мкл TE с использованием многоканальной пипетки. Предварительно намочите перфоратор в TE.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Перфоратор или репликатор микропланшетов следует стерилизовать перед этим шагом, а затем позже в протоколе. Можно применять общий способ стерилизации перфоратора, такой как погружение его в этанол (100%, не молекулярная биология), а затем его сжигание в пламя. Подождите 1 мин, чтобы охладить штыри перфоратора.
      Внимание: при выполнении стерилизации на скамейке; Убедитесь, что скамья предварительно очищена этанолом и не содержит горючих материалов. Надеть надлежащие средства индивидуальной защиты (СИЗ).
   2. Колонии перфорации и повторно суспендировать в пластине, заполненной TE.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Если на пластине наблюдается плавный рост, колонии можно перфорировать непосредственноНа пластину, заполненную ТЕ, или, альтернативно, отдельную колонию (в случае нескольких колоний) следует собирать с использованием стерилизованной зубочистки на заполненную ТЕ платой, а затем перфоратор можно использовать для следующей стадии.
   3. Перенесите их на новые пластины агара SD-Trp-Leu для оптимального покрытия поверхности. Инкубируйте планшеты при 30 ° C до следующего шага.
7. День 7 (вторая половина дня): начать культуру для измерения активности β-галактозидазы.
   1. Заполните стерильную 96-луночную смесительную пластину (U-bottom) с 50 мкл среды SD-Trp-Leu с использованием многоканальной пипетки.
   2. Заполните стерильный 96-луночный блок с 180 мкл среды SD-Trp-Leu с использованием многоканальной пипетки.
   3. Предварительно смачивают перфоратор в средах и переносят колонии с пластины на 50 мкл среды.
   4. Передайте 20 мкл дрожжей в 180 мкл среды SD-Trp-Leu и запечатайте блок воздухопроницаемым уплотнением. высиживатьВ течение 36 ч при шейке 30 ° C.
8. День 9 (утро): Начните культуру для ферментативного измерения.
   1. Перенесите 100 мкл культуры в 500 мкл среды YPDA в стерилизованном 96-луночном блоке.
   2. Накройте стерилизованную глубокую колодец воздухопроницаемым уплотнением и инкубируйте в течение 3 - 5 часов при 30 ° C при перемешивании со скоростью 200 об / мин (до OD ₆₀₀ 0,3-0,6).
   3. Повторно суспендируют культуру и переносят 125 мкл с использованием многоканальной пипетки на пластину спектрофотометра (измерьте OD ₆₀₀ ).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Предостережение: не отпускайте последнюю каплю, чтобы избежать пузырьков, если OD ₆₀₀ ниже 0,3-0,6, инкубируйте оставшиеся ячейки в течение 1 - 2 часов в зависимости от показаний. 125 мкл культуры, используемые на этом этапе, могут быть отброшены или перенесены обратно в исходный блок глубоких скважин по усмотрению пользователя.
   4. Центрифугировать оставшиеся клетки в глубоком колодце в течение 10 минут при 3000 xg и 21 ° C. Удалить супернатанT путем инвертирования.
   5. Добавить 200 мкл Z-буфера и вихря.
      ПРИМЕЧАНИЕ. См. Рецепт для Z-буфера в таблице 1 .
   6. Центрифуга в течение 5 мин при 3000 xg и 21 ° C. Удалите супернатант путем инвертирования.
   7. Добавить 20 мкл Z-буфера и вихря.
   8. Накройте пластину уплотняющей фольгой, которая может противостоять циклам замораживания оттаивания. Выполните 4 цикла замораживания / оттаивания, используя жидкий азот в вытяжном шкафу, а затем 42 ° C на водяной бане (по 2 минуты каждый).
   9. Добавить 200 мкл Z-буфера / бета-меркаптоэтанола (β-ME) / орто-нитрофенил-β-галактозид (ONPG) (12 мл, 21 мкл, 8,4 мг соответственно даст 20 мл раствора, всегда готовят свежий ).
      ПРИМЕЧАНИЕ. ONPG займет некоторое время, чтобы раствориться правильно, поэтому подготовьте решение за час до достижения этого шага. ONPG служит в качестве субстрата для измерения активности β-галактозидазы.
   10. Инкубируйте до 17-24 часов при температуре 30 ° C (проверьте, если цвет развивается раньше prПерейдите к следующему шагу).
9. День 10 (утро): прекратите реакцию и измерьте.
   1. Добавьте 110 мкл 1 М Na ₂ CO _3, чтобы остановить реакцию и записать время.
   2. Вихрь и центрифугируют в течение 10 минут при 3000 xg и 21 ° C.
   3. Возьмите 125 мкл супернатанта с использованием многоканального и измерьте OD ₄₂₀ .
      ПРИМЕЧАНИЕ. Осторожно, не отпускайте последнюю каплю, чтобы избежать пузырьков.
   4. Вычислить активность β-gal: 1000 x OD ₄₂₀ / (время (мин) x объем (мл) x OD ₆₀₀ в электронной таблице.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Общая процедура настройки пластины для коразрушения областей ДНК в дрожжевых клетках с интересующим белком ( рис. 2 ). Настройка пластины может быть изменена в соответствии с потребностью в эксперименте и количеством тестируемых участков ДНК / фрагмен?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Существующая стандартная процедура Y1H подходит для идентификации единственной белковой жертвы, связывающей ее ДНК-приманку. С различными техническими изменениями существующая система была использована для определения сетей регулирования транскрипции. Однако известно, что TF функци?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
pDEST22 vector	Invitrogen	PQ1000101	Pro-Quest Two hybrid system kit
pDEST32delatDBD	Invitrogen	PQ1000102	Pro-Quest Two hybrid system kit; this vecor is modified. It is pDEST32 minus DNA binding Domain
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Invitrogen	K240020
YM4271 Strain	Clontech	K1603-1	MATCHMAKER One-Hybrid System
pEXP-AD502	Invitrogen	PQ1000101	Pro-Quest Two hybrid system kit
GATEWAY LR Clonase II enzyme mix	Invitrogen	11791020
YPDA media	Clontech	630410
SD-Agar	Clontech	630412
SD minimal media	Clontech	630411
Uracil DO Supplement	Clontech	630416
Tryptophan Do Supplement	Clontech	630413
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-1
EDTA	Fisher Scientific	S311-500
LiAc	Sigma-Aldrich	L4158
Saplmon Sperm (10mg/ml)	Invitrogen	15632011
96 well round bottom Plate	Greiner bio-one	650101
PEG3350	Sigma-Aldrich	1546547
96-deep well block	USA Scientific	1896-2000
Sealable Foil	USA Scientific	2923-0110
Araseal	Excel Scientific	B-100
2-mercaptoethanol	Fisher Scientific	034461-100
ONPG	Sigma-Aldrich	73660
Na2CO3	Sigma-Aldrich	223484
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S3264
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S3139
KCL	Fisher Scientific	BP366-500
MgSO4	Sigma-Aldrich	83266
HCL	Fisher Scientific	SA54-4
Drybath	Thermo Fischer
Voretx	Thermo Fischer
Centrifgue	Eppendorf	Centrifuge 5810R
Plate Reader	Molecular Device		SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer
Incubator	Thermo Fisher	Model No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees
Shaker Incubator	New Brunswick
Water Bath	Thermo Fisher	IsoTemp 205
Puncher
50 ml Falocn	BD Falcon
Beaker	Nalgene
Flask	Nalgene
Petriplates (150mm)	Greiner bio-one