Un sistema híbrido modificado de levadura-uno para estudios de interacción de ADN complejo-proteína heterotérica

Resumen

El ensayo de un híbrido de levadura modificado descrito aquí es una extensión del ensayo clásico de levadura híbrida (Y1H) para estudiar y validar la interacción heteromérica de complejo de proteína-ADN en un sistema heterólogo para cualquier estudio de genómica funcional.

Resumen

A lo largo de los años, el ensayo híbrido de levadura ha demostrado ser una técnica importante para la identificación y validación de interacciones físicas entre proteínas tales como factores de transcripción (TFs) y su diana de ADN. El método presentado aquí utiliza el concepto subyacente de la Y1H pero se modifica adicionalmente para estudiar y validar los complejos de proteínas que se unen a su ADN diana. Por lo tanto, se denomina el ensayo de hibridación de hongo de levadura modificado (Y1.5H). Este ensayo es rentable y puede realizarse fácilmente en un entorno de laboratorio regular. Aunque utilizando un sistema heterólogo, el método descrito podría ser una valiosa herramienta para probar y validar el complejo de proteína heteromérica que se une a su (s) diana (s) de ADN para genómica funcional en cualquier sistema de estudio, especialmente genómica de plantas.

Introducción

En general, para comprender las interacciones proteína-ADN, el ensayo Y1H es el sistema preferido utilizado con éxito en un entorno de laboratorio ¹ . El ensayo Y1H básico implica dos componentes: a) un constructo reportero con ADN de interés clonado con éxito aguas arriba de un gen que codifica una proteína reportera; Y b) un constructo de expresión que generará una proteína de fusión entre el TF de interés y un dominio de activación de transcripción de levadura (AD). El ADN de interés se conoce comúnmente como "cebo" mientras que la proteína de fusión se conoce como "presa". En años anteriores, se han desarrollado versiones múltiples del ensayo Y1H para adaptarse a necesidades específicas con sus propias ventajas ² . El ensayo Y1H existente puede implementarse con éxito para identificar y validar la interacción de una proteína a la vez con su cebo de ADN, pero carece de la capacidad para identificar interacciones heterodiméricas o multiméricas de proteína-ADN.

El método descrito aquí es una versión modificada del Y1H existente que permite a los investigadores estudiar simultáneamente múltiples proteínas que se unan a su secuencia o secuencias de ADN diana El objetivo de este ensayo es expresar la proteína de interés con un dominio de activación (pDEST22: TF) y evaluar la activación de las regiones de ADN candidatas fusionadas a un reportero en presencia y / o ausencia de la pareja de proteínas que interactúa (pDEST32ΔDBD-TF) en el sistema de levaduras.Este ensayo nos permitirá determinar si la interacción entre estos dos Proteínas es necesario para la activación de la diana.Este es un sistema compatible con la clonación GATEWAY y por lo tanto viable para su uso en un laboratorio regular.Este protocolo se basa en la transformación directa, que proporciona la facilidad de co-transformación de diferentes TFs en un sistema de levadura Por lo tanto, es una estrategia ventajosa para validar los complejos de proteínas vinculante a sus posibles dianas de ADN para validación molecular y funcional in vitro fO cualquier sistema. Las técnicas actuales, tales como los métodos Tandem de purificación de afinidad (TAP), son costosas y requieren mucho trabajo, pero permiten la detección de hetrocomplexos de proteínas a gran escala ^{3 , 4 , 5} . Este híbrido de levadura modificado se puede llevar a cabo con éxito en un laboratorio regular a pequeña escala ( Figura 1 ) y también es rentable. El ensayo de Y1.5H puede facilitar a los investigadores de toda la comunidad para probar y validar su hipótesis hacia la definición del papel de complejo de proteínas multiméricas vinculante a una diana común de ADN utilizando un sistema heterólogo. En base a los hallazgos, la hipótesis podría ser validada in vivo en el sistema de estudio preferido. Recientemente, hemos utilizado este enfoque para definir el papel de un TF y su modo de acción para regular la floración en Arabidopsis [ ^6] .

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Protocolo

1. Construir y preparar la preparación del plásmido

1. PCR amplificar las regiones promotoras / fragmentos (preferiblemente ~ 250-500 pb) del ADN diana para ser analizados para la clonación adicional en el vector de entrada usando E. coli (TOP10).
2. Tras la confirmación de la secuenciación, subclona el clon positivo en un vector de expresión pGLacZi compatible ⁷ como se describió anteriormente ^{8 , 9 , 10 , 11} .
3. Transformar la cepa de levadura para la integración del promotor (YM4271) por recombinación homóloga de pGLacZi para generar la cepa informador de levadura como se describió anteriormente ^{12 , 13} . Los pasos de transformación y confirmación de la cepa de levadura con la región de ADN junto con la receta de los medios no se describen aquí, ya que los pasos son similares al protocolo Y1H clásicoAsno = "xref"> 9 ^{, 10 , 11 , 12 , 13} . El plásmido de control pEXP-AD502 se puede usar con fines de normalización mientras se cuantifica la actividad de β-galactosidasa como se ha descrito anteriormente ⁸ .
4. Clonar el TF o la proteína de interés y posteriormente clonar el compañero de la proteína interactuante en los vectores de expresión pDEST22 y pDEST32ΔDBD (pDEST32 menos ADN). Los fragmentos de promotor de levadura transformados y los clones de TF se utilizan subsiguientemente más en el protocolo.

2. Protocolo Y1.5H modificado

1. El dıa 1 (tarde), comienza con 5 ml de cultivo en SD-Ura de una placa de Petri o material de glicerol y se incuba durante la noche en un agitador a 30 ◦ C.
   NOTA: Este cultivo puede iniciarse a partir de una placa recién chapada o directamente de un stock de glicerol al 25% o 30% de la levaduraClon con el fragmento de ADN.
2. En el día 2 (tarde), inocular 10 ml de medio YPDA con 500 μl del cultivo durante la noche e incubar durante la noche en un agitador a 30ºC.
3. Día 3 (temprano en la mañana y toda la tarde): Prepare células competentes (temprano en la mañana).
   1. Inocular 100 ml de medio YPDA con los 2 ml del cultivo durante la noche e incubar en un agitador a 30ºC. Cultivar este cultivo fresco hasta que la DO ₆₀₀ alcance 0,4-0,8 (3-5 h).
      NOTA: Compruebe la DO ₆₀₀ del cultivo durante la noche y asegúrese de que el punto de inicio OD ₆₀₀ para este paso sea de 0,1 - 0,2. El uso de cultivo excesivo o insuficiente puede prolongar el experimento.
   2. Centrifugar durante 5 min a 1000 xg y 21 ° C. Deseche el sobrenadante.
   3. Reconstituya los gránulos en 10 ml de agua estéril usando un vórtice o pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
   4. Centrifugar durante 5 min a 1000 xg y 21 ° C. Deseche el sobrenadante.
   5. ReconstituirTe pellets en 2 mL de Tris-Ethylenediaminetetraaceticacid (TE) / acetato de litio (LiAc) usando un vórtice o pipetando arriba y abajo.
      NOTA: Consulte la receta de TE / LiAc en la Tabla 1 .
   6. Centrifugar durante 5 min 1000 xg y 21 ° C. Deseche el sobrenadante.
   7. Vuelva a suspender la pastilla en 4 mL de TE / LiAc + 400 μl de ADN de esperma de salmón (10 mg / mL) pipeteando hacia arriba y hacia abajo y continúe con el paso siguiente.
4. Co-transformación: Choque térmico de las células (tarde por la tarde)
   1. Distribuir 20 μL de células por pocillo en una placa mezcladora de 96 pocillos (fondo en U).
   2. Añadir 150 ng (~ 1,5 μl) de cada uno de los plásmidos pDEST22: TF, pDEST32ΔDBD: plásmido TF y pEXP-AD502 más pDEST32ΔDBD: TF (control de normalización) a los pocillos.
      NOTA: Se esperan resultados óptimos con ~ 150 ng de cada uno de los plásmidos pDEST22: TF y pDEST32ΔDBD: TF para una co-transformación exitosa. Puede variar con las expresiones constructo y plásmido, asíNecesitan ser optimizados con cada experimento. Otro control pDEST22-TF más pDEST32deltaDBD también se puede incluir a discreción del usuario.
   3. Añadir 100 μl de TE / LiAc / polietilenglicol (PEG) por pocillo ( mezclar tres veces ).
      NOTA: Consulte la receta de TE / LiAc / PEG en la Tabla 1 .
   4. Cubrir la placa con un sello transpirable e incubar durante 20 - 30 min (puede ser más largo) a 30 ° C (sin agitación necesaria).
   5. Calor durante 20 min ( precisamente ) a 42 ° C.
5. Placa las células.
   1. Centrifugar durante 5 min a 1000 xg y 21 ° C. Eliminar el sobrenadante usando una pipeta multicanal. Añadir 110 μL de TE y mezclar.
   2. Centrifugar durante 5 min a 1000 xg y 21 ° C. Eliminar 100 μL del sobrenadante usando una pipeta multicanal. Vuelva a suspender el pellet con el puncher.
   3. Transferencia de células en placas de agar SD-Trp-Leu . Incubar las placasA 30 ° C hasta la siguiente etapa.
6. Día 5 (tarde): Transferir las células en placas nuevas usando un replicador de perforador / microplaca.
   1. Llene una placa de mezcla de 96 pocillos estéril (fondo en U) con 50 μl de TE usando una pipeta multicanal. Pre-humedezca el puncher en TE.
      NOTA: El perforador o el replicador de microplacas deben esterilizarse antes de este paso y posteriormente posteriormente en el protocolo. Se puede aplicar la forma común de esterilizar el punzón tal como sumergirlo en etanol (100%, no grado de biología molecular) y luego quemarlo a la llama. Espere 1 minuto para enfriar los punzones.
      Precaución: Si realiza la esterilización en el banco; Asegúrese de que el banco esté previamente limpiado con etanol y libre de cualquier material combustible alrededor. Use equipo de protección personal adecuado (PPE).
   2. Perforar las colonias y volver a suspender en la placa llena de TE.
      NOTA: Si hay un crecimiento suave en la placa, las colonias pueden ser perforadas directamenteA la placa llena de TE o, alternativamente, una colonia única (en el caso de colonias múltiples) debe recogerse usando un palillo de dientes esterilizado a la placa llena de TE y posteriormente se puede usar un punzón para la siguiente etapa.
   3. Transferirlos en las nuevas placas de agar SD-Trp-Leu para una cobertura de superficie óptima. Incubar las placas a 30 ° C hasta el siguiente paso.
7. Día 7 (tarde): Iniciar el cultivo para medir la actividad de la β-galactosidasa.
   1. Llenar una placa de mezcla estéril de 96 pocillos (fondo en U) con 50 μl de medio SD-Trp-Leu usando una pipeta multicanal.
   2. Llene un bloque estéril de 96 pocillos con 180 μL de medio SD-Trp-Leu usando una pipeta multicanal.
   3. Pre-humedezca el puncher en los medios y transfiera las colonias de la placa a los 50 μL de medio.
   4. Transferir 20 μL de levadura a los 180 μL de medio SD-Trp-Leu y sellar el bloque con un sello transpirable. IncubarDurante 36 h a 30 ° C.
8. Día 9 (mañana): Iniciar el cultivo para la medición enzimática.
   1. Transferir 100 μl de cultivo a 500 μl de medio YPDA en un bloque de 96 pozos profundos esterilizados.
   2. Cubrir la placa de pozo profundo esterilizada con un sello transpirable e incubar durante 3 - 5 h a 30 ° C con agitación a 200 rpm (hasta OD ₆₀₀ 0.3-0.6).
   3. Re-suspender el cultivo y transferir 125 μL usando una pipeta multicanal en una placa de espectrofotómetro (medida OD ₆₀₀ ).
      NOTA: Precaución: No dispensar la última gota para evitar burbujas, si la OD ₆₀₀ está por debajo de 0,3 - 0,6, incubar las células restantes durante 1 - 2 h más sobre la base de la lectura. El cultivo de 125 μL utilizado en este paso puede ser desechado o transferido de nuevo al bloque de pozo profundo original a discreción del usuario.
   4. Centrifugar las células restantes en el bloque de pozos profundos durante 10 min a 3000 xg y 21 ° C. Eliminar supernatanT por inversión.
   5. Añadir 200 μl de Z-buffer y vórtice.
      NOTA: Consulte la receta del buffer Z en la Tabla 1 .
   6. Centrifugar durante 5 min a 3000 xg y 21 ° C. Retirar el sobrenadante invirtiendo.
   7. Añadir 20 μL de tampón Z y vórtice.
   8. Cubra la placa con una lámina de sellado que pueda resistir los ciclos de descongelación por congelación. Realice 4 ciclos de congelación / descongelación utilizando nitrógeno líquido en una campana de humos y luego 42 ºC en un baño de agua (2 min cada uno).
   9. Añadir 200! L Z-buffer / beta-mercaptoetanol (β-ME) / Ortho-nitrofenil-β-galactósido (ONPG) (12 ml, 21 ml, 8,4 mg, respectivamente, dará lugar a 20 ml de solución; siempre preparar fresco).
      NOTA: La ONPG tardará algún tiempo en disolverse correctamente, así que prepare la solución una hora antes de llegar a este paso. La ONPG sirve como sustrato para la medición de la actividad de la β-galactosidasa.
   10. Incubar hasta 17 - 24 h a 30 ° C (comprobar entre si, si el color se desarrolla antes prPaso al siguiente paso).
9. Día 10 (mañana): Detener la reacción y medir.
   1. Añadir 110! L 1 M Na ₂ CO ₃ para detener el tiempo de reacción y registro.
   2. Vórtice y centrifugue durante 10 min a 3000 xg y 21 ° C.
   3. Tomar 125 μL de sobrenadante usando multicanal y medir OD ₄₂₀ .
      NOTA: Precaución, no dispensar la última gota para evitar burbujas.
   4. Calcular la actividad β-gal: 1000 x OD ₄₂₀ / (tiempo (min) x volumen (ml) x DO ₆₀₀ en una hoja de cálculo.

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Resultados

El procedimiento general de preparación de la placa para la co-transformación de regiones de ADN en las células de levadura con la proteína de interés ( Figura 2 ). La configuración de la placa puede modificarse de acuerdo con la necesidad del experimento y el número de regiones / fragmentos de ADN probados. Después del día 5 del protocolo, una placa bien crecida y positiva debe ser visible como en la Figura 3 . En nues...

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Discusión

El procedimiento estándar de Y1H existente es adecuado para identificar una presa de proteína única que se une a su cebo de ADN. Con varias modificaciones técnicas, el sistema existente ha sido aprovechado para definir las redes reguladoras transcripcionales. Sin embargo, se sabe que los TF funcionan como una parte de complejos que implican dos o más TF o proteínas, con sólo algo de TF capaz de unirse al ADN. Las proteínas o TFs que poseen sólo los dominios de unión a proteínas y carecen de la capacidad para ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
pDEST22 vector	Invitrogen	PQ1000101	Pro-Quest Two hybrid system kit
pDEST32delatDBD	Invitrogen	PQ1000102	Pro-Quest Two hybrid system kit; this vecor is modified. It is pDEST32 minus DNA binding Domain
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Invitrogen	K240020
YM4271 Strain	Clontech	K1603-1	MATCHMAKER One-Hybrid System
pEXP-AD502	Invitrogen	PQ1000101	Pro-Quest Two hybrid system kit
GATEWAY LR Clonase II enzyme mix	Invitrogen	11791020
YPDA media	Clontech	630410
SD-Agar	Clontech	630412
SD minimal media	Clontech	630411
Uracil DO Supplement	Clontech	630416
Tryptophan Do Supplement	Clontech	630413
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-1
EDTA	Fisher Scientific	S311-500
LiAc	Sigma-Aldrich	L4158
Saplmon Sperm (10mg/ml)	Invitrogen	15632011
96 well round bottom Plate	Greiner bio-one	650101
PEG3350	Sigma-Aldrich	1546547
96-deep well block	USA Scientific	1896-2000
Sealable Foil	USA Scientific	2923-0110
Araseal	Excel Scientific	B-100
2-mercaptoethanol	Fisher Scientific	034461-100
ONPG	Sigma-Aldrich	73660
Na2CO3	Sigma-Aldrich	223484
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S3264
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S3139
KCL	Fisher Scientific	BP366-500
MgSO4	Sigma-Aldrich	83266
HCL	Fisher Scientific	SA54-4
Drybath	Thermo Fischer
Voretx	Thermo Fischer
Centrifgue	Eppendorf	Centrifuge 5810R
Plate Reader	Molecular Device		SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer
Incubator	Thermo Fisher	Model No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees
Shaker Incubator	New Brunswick
Water Bath	Thermo Fisher	IsoTemp 205
Puncher
50 ml Falocn	BD Falcon
Beaker	Nalgene
Flask	Nalgene
Petriplates (150mm)	Greiner bio-one