이성질체 단백질 복합체 -DNA 상호 작용 연구를위한 수정 된 효모 원 하이브리드 시스템

요약

여기에 설명 된 수정 된 효모 하나 - 하이브리드 분석은 기능적 유전체학 연구를위한 이종 시스템에서 헤테로 머 단백질 복합체 - DNA 상호 작용을 연구하고 검증하기위한 고전적인 효모 1- 하이브리드 (Y1H) 분석법의 확장이다.

초록

지난 수년간 효모 one-hybrid assay는 전사 인자 (TFs)와 DNA 표적과 같은 단백질 간의 물리적 상호 작용을 확인하고 검증하는 중요한 기술로 입증되었습니다. 여기에 제시된 방법은 Y1H의 기본 개념을 사용하지만 대상 DNA에 결합하는 단백질 복합체를 연구하고 검증하기 위해 추가로 변형됩니다. 따라서, 이는 변형 된 효모 일 - 하이브리드 (Y1.5H) 분석으로 지칭된다. 이 분석법은 비용 효과적이며 정기적 인 실험실 환경에서 쉽게 수행 할 수 있습니다. 이종 시스템을 사용 함에도 불구 하고 기술 된 방법은 연구 시스템, 특히 식물 유전체학에서 기능적 유전체학을위한 DNA 표적 (들)에 결합하는 헤테로 성 단백질 복합체를 시험하고 검증하는 유용한 도구가 될 수 있습니다.

서문

일반적으로 단백질 -DNA 상호 작용을 이해하기 위해 Y1H 분석이 실험실 환경에서 성공적으로 사용되는 선호 시스템입니다 ¹ . 기본적인 Y1H 분석은 두 가지 요소를 포함한다 : a) 리포터 단백질을 코딩하는 유전자의 상류에서 성공적으로 복제 된 관심 DNA를 갖는 리포터 구조; 및 b) 관심있는 TF와 효모 전사 활성화 도메인 (AD) 사이에 융합 단백질을 생성시킬 발현 구조물. 융합 단백질은 '먹이'로 알려진 반면, 관심있는 DNA는 일반적으로 '미끼'라고합니다. 지난 몇 년 동안, Y1H 분석법의 여러 버전이 자신의 장점을 지닌 특정 요구에 맞게 개발되었습니다 ² . 기존 Y1H 분석법은 한 번에 한 단백질의 DNA 미끼와의 상호 작용을 확인하고 확인하기 위해 성공적으로 구현 될 수 있지만 이종이 량체 또는 다중 단백질 단백질 -DNA 상호 작용을 식별 할 수있는 능력이 부족합니다.

"여기에 설명 된 방법은 기존 Y1H의 변형 된 버전으로 연구원은 표적 DNA 서열에 결합하는 여러 단백질을 동시에 연구 할 수 있습니다.이 분석의 목표는 활성화 도메인 (pDEST22 : TF)와 상호 작용하는 단백질 파트너 (pDEST32ΔDBD-TF)의 존재 및 / 또는 부재 하에서 리포터에 융합 된 후보 DNA 영역의 활성화를 효모 시스템에서 평가할 수있다. 단백질은 목표의 활성화에 필요합니다. 이것은 GATEWAY 복제 호환 시스템이므로 정기적 인 실험실 환경에서 사용할 수 있습니다.이 프로토콜은 효모 시스템에서 여러 TF의 용이 한 동시 변형을 제공하는 직접 변환을 기반으로합니다. 따라서 in vitro 분자 및 기능 검증을 위해 가능한 DNA 표적에 결합하는 단백질 복합체를 검증하는 것이 유리한 전략이다. f또는 어떤 시스템. Tandem affinity purification (TAP) 방법과 같은 현재의 기술은 값 비싸고 노동 집약적이지만 대규모로 단백질 hetrocomplexes를 검출 할 수 있습니다 ^{3 , 4 , 5} . 이 변형 된 효모 원 하이브리드는 작은 규모의 정규 실험실 환경에서 성공적으로 수행 될 수 있으며 ( 그림 1 ) 또한 비용 효율적입니다. Y1.5H 분석은 이종 시스템을 사용하여 공통 DNA 표적에 결합하는 다중 단백질 복합체의 역할을 정의하는 방향으로 자신의 가설을 테스트하고 검증하기 위해 지역 사회 전체의 연구자를 용이하게 할 수 있습니다. 연구 결과에 따르면이 가설은 바람직한 연구 시스템 에서 생체 내 에서 검증 될 수있다. 최근 우리는이 접근법을 사용하여 TF의 역할과 Arabidopsis ^6의 개화를 조절하는 작용 기전을 정의했습니다.

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프로토콜

1. 플라스미드 준비 및 리포터

1. PCR은 대장균 (TOP10)을 사용하여 진입 벡터에 추가로 클로닝하기 위해 분석 될 표적 DNA의 프로모터 영역 / "단편"(바람직하게 ~ 250-500bp)을 증폭시킨다.
2. 시퀀싱 확인시 이전에 설명한 ^{8 , 9 , 10 , 11} 과 같이 호환 가능한 pGLacZi 발현 벡터 ⁷ 에서 양성 클론을 서브 클론합니다.
3. 이전 ^{12 , 13에서} 설명한대로 효모 리포터 변형을 생성 pGLacZi의 상 동성 재조합에 의해 발기인 통합 (YM4271)에 대한 효모 변형을 변환합니다. 매체의 제조법과 함께 DNA 영역을 갖는 효모 균주의 형질 전환 및 확인 단계는 단계가 고전적인 Y1H 프로토콜과 유사하기 때문에 여기서 설명하지 않는다ass = "xref"> 9 ^{, 10 , 11 , 12 , 13} . pEXP - AD502 제어 플라스미드는 정상화 목적으로 사용할 수 있으며 이전에 설명한대로 β - 갈 락토시다 아제 활성을 quantifiying ⁸ .
4. 관심있는 TF 또는 단백질을 클론하고 상호 작용하는 단백질 파트너를 pDEST22 및 pDEST32ΔDBD (pDEST32 마이너스 DNA 결합 도메인) 발현 벡터로 클로닝한다. 형질 전환 된 효모 프로모터 단편 및 TF 클론은 추후에 프로토콜에서 더 사용된다.

2. 수정 된 Y1.5H 프로토콜

1. 1 일 (오후), 페트리 접시 또는 글리세롤 주식에서 SD - Ura 의 문화의 5 ML로 시작하고 30 ° C 쉐이커에서 밤새 품어.
   참고 :이 문화는 신선 줄무늬 접시 또는 효모의 25 % 또는 30 % 글리세롤 주식에서 직접 시작할 수 있습니다DNA 조각으로 복제하십시오.
2. 2 일차 (오후)에 YPDA 배지 10 mL에 밤새 배양액 500 μL를 접종하고 30 ° C 쉐이커에서 밤새 배양합니다.
3. 3 일차 (아침 일찍 및 오후 내내) : 능력있는 세포 준비 (아침 일찍).
   1. 밤새 문화 2 ML와 YPDA 미디어 100 ML을 접종하고 30 ° C의 쉐이 커에서 품어. OD ₆₀₀ 이 0.4-0.8 (3-5 h)에 도달 할 때까지이 신선한 배양 물을 성장시킵니다.
      참고 : 하룻밤 문화의 OD _600을 확인하고이 단계의 시작 지점 OD _{600 0.1} 있는지 확인 - 0.2. 과도한 성장이나 미성숙 된 문화를 사용하면 실험 기간이 길어질 수 있습니다.
   2. 1000 xg 및 21 ° C에서 5 분간 원심 분리하십시오. 뜨는 물을 버린다.
   3. 소용돌이 또는 피펫 팅 (pipetting)을 사용하여 10 mL의 멸균 수로 펠렛을 재생한다.
   4. 1000 xg 및 21 ° C에서 5 분간 원심 분리하십시오. 뜨는 물을 버린다.
   5. 재구성2 mL의 Tris-Ethylenediaminetetraaceticacid (TE) / Lithium acetate (LiAc)에 vortex를 사용하거나 위아래로 pipetting하여 펠렛을 만든다.
      참고 : 표 1의 TE / LiAc 제조법을 참조하십시오.
   6. 1000 xg 및 21 ° C에서 5 분간 원심 분리하십시오. 뜨는 물을 버린다.
   7. 4 ML의 TE / LiAc + 400 μL 연어 정자 DNA (10 MG / ML) pipetting 위아래로 펠렛을 다시 일시 중지하고 다음 단계로 진행합니다.
4. 공동 변형 : 세포에 열 충격 (오후 늦게)
   1. 96 잘 혼합 접시 (U - 하단)에 잘 당 세포의 20 μL를 배포 할 수 있습니다.
   2. 우물에 pDEST22 : TF 플라스미드, pDEST32ΔDBD : TF 플라스미드 및 pEXP - AD502 플러스 pDEST32ΔDBD : TF (정상화 제어)를 각각 150 ng (~ 1.5 μL)를 추가합니다.
      참고 : ~ 150 ng 각각의 pDEST22 : TF 및 pDEST32ΔDBD : TF 플라스미드로 최적의 결과가 예상됩니다. 구조 및 플라스미드 표현에 따라 달라질 수 있으므로모든 실험마다 최적화해야합니다. 또 다른 컨트롤 인 pDEST22-TF와 pDEST32deltaDBD는 사용자의 재량에 따라 포함될 수 있습니다.
   3. 웰 당 100 μL의 TE / LiAc / 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 첨가한다 (3 회 혼합 ).
      참고 : 표 1의 TE / LiAc / PEG 제조법을 참조하십시오.
   4. 통기성이있는 뚜껑으로 플레이트를 덮고 30 ° C (교반 필요 없음)에서 20 - 30 분 (더 길어질 수 있음) 동안 배양하십시오.
   5. 42 ° C에서 20 분 동안 열충격 ( 정밀 ).
5. 세포를 판다.
   1. 1000 xg 및 21 ° C에서 5 분간 원심 분리하십시오. 멀티 채널 피펫을 사용하여 상징액을 제거하십시오. 110 μL의 TE를 넣고 섞는다.
   2. 1000 xg 및 21 ° C에서 5 분간 원심 분리하십시오. 멀티 채널 피펫을 사용하여 뜨는의 100 μL를 제거합니다. 구멍을 뚫어 펠렛을 다시 매달아 라.
   3. SD - Trp - Leu 한천 플레이트에 세포를 전송합니다. 플레이트를 부화시키다.30 ° C에서 다음 단계까지.
6. 5 일 (오후) : 펀처 / 마이크로 플레이트 복제기를 사용하여 새 플레이트에 세포를 옮깁니다.
   1. 멀티 채널 피펫을 사용하여 멸균 96 - 웰 혼합 판 (U - 하단)에 50 μL의 TE를 채 웁니다. TE의 구멍을 미리 닦으십시오.
      참고 :이 단계 전에 그리고 이후 프로토콜에서 펀처 또는 마이크로 플레이트 리플리케이터를 멸균해야합니다. 에 펀치 (100 %, 분자 생물학 등급이 아님)에 담그고 화염에 태우는 것과 같이 구멍을 뚫는 일반적인 방법이 적용될 수 있습니다. 펀처 핀을 식히기 위해 1 분 정도 기다리십시오.
      주의 : 벤치에서 살균을 수행하는 경우; 벤치를 에탄올로 사전 청소하고 가연성 물질이 없어야합니다. 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하십시오.
   2. 식민지를 펀치하고 TE로 채워진 플레이트에 다시 부순다.
      참고 : 플레이트에 부드럽게 성장하면 식민지를 직접 펀치 할 수 있습니다TE- 채워진 플레이트 또는 대안으로, 단일 콜로니 (다중 콜로니의 경우)는 TE 채워진 플레이트에 살균 된 이쑤시게를 사용하여 골라야하고,이어서 펀처를 사용하여 다음 단계에 사용할 수 있습니다.
   3. 최적의 표면 커버리지를 위해 새로운 SD-Trp-Leu 한천 플레이트 로 옮기십시오 . 30 ° C에서 다음 단계까지 플레이트를 배양하십시오.
7. 7 일 (오후) : β- 갈 락토시다 아제 활성을 측정하기위한 배양을 시작한다.
   1. 멀티 채널 피펫을 사용하여 SD - Trp - Leu 미디어 50 μL와 살균 96 - 웰 혼합 판 (U - 하단)을 작성하십시오.
   2. 멀티 채널 피펫을 사용하여 180 μl의 SD-Trp-Leu 배지로 96 웰 멸균 블록을 채 웁니다.
   3. 미디어에 구멍을 뚫어 미리 젖혀 놓은 다음 플레이트에서 식민지를 미디어 50 μL로 옮깁니다.
   4. SD-Trp-Leu 배지 180 μL에 효모 20 μL를 옮기고 통기성이있는 막을 밀봉합니다. 품다30 ° C 쉐이커에서 36 시간 동안.
8. 9 일째 (아침) : 효소 측정을위한 배양을 시작하십시오.
   1. 멸균 96 깊은 우물 블록에서 YPDA 미디어의 500 μL에 문화의 100 μL을 전송합니다.
   2. 호흡 할 수있는 씰로 멸균 된 깊은 웰 플레이트를 덮고 200 rpm에서 교반하면서 30 ° C에서 3-5 시간 동안 배양합니다 (OD ₆₀₀ 0.3-0.6까지).
   3. 문화를 다시 일시 중지하고 분광 광도계 플레이트 (측정 OD ₆₀₀ )에 멀티 채널 피펫을 사용하여 125 μL를 전송합니다.
      참고 :주의 : OD ₆₀₀ 이 0.3 - 0.6 미만인 경우 마지막 방울을 분사하지 마십시오. OD ₆₀₀ 이 판독 값에 따라 1 - 2 시간 동안 더 배양하십시오. 이 단계에서 사용 된 125 μL 배양 물은 폐기되거나 사용자의 재량에 따라 원래의 깊은 웰 블록으로 다시 옮길 수 있습니다.
   4. 3000 XG 및 21 ° C에서 10 분 동안 깊은 우물 블록에 남아있는 세포를 원심 분리기. supernatan 제거t를 반전 시켜서.
   5. Z 버퍼 및 와동의 200 μL를 추가합니다.
      참고 : 표 1 에서 Z 버퍼의 제조법을 참조하십시오.
   6. 3000 xg 및 21 ° C에서 5 분간 원심 분리하십시오. 거꾸로하여 뜨는을 제거합니다.
   7. 20 μL Z-buffer와 vortex를 첨가한다.
   8. 동결 융해 사이클에 견딜 수있는 밀봉 호일로 플레이트를 덮으십시오. 흄 후드에서 액체 질소를 사용하여 4 사이클의 동결 / 해동을 수행 한 다음 수조에서 42 ℃ (각 2 분)를 수행합니다.
   9. 200 μL Z 버퍼 / 베타 - 머 캅토 에탄올 (β-ME) / 오르토 니트로 - β 갈 락토 (ONPG)에 추가 (12 ㎖, 21 μL를 8.4 mg을 각각 20 ㎖의 용액을 수득한다; 항상 신선한 준비).
      참고 : ONPG는 올바르게 분해하기 위해 약간의 시간이 걸리므로이 단계에 도달하기 전에 1 시간 전에 용액을 준비하십시오. ONPG는 β- 갈 락토시다 아제 활성의 측정을위한 기질 역할을한다.
   10. 30 ° C에서 최대 17 - 24 시간 동안 배양하십시오. (색상이 이전 pr다음 단계로 넘어가십시오).
9. 10 일째 (아침) : 반응을 멈추고 측정하십시오.
   1. 110 μL 1M Na ₂ CO ₃ 을 첨가하여 반응을 멈추고 시간을 기록하십시오.
   2. 3000 xg 및 21 ° C에서 10 분 동안 와동과 원심 분리.
   3. 멀티 채널을 사용하여 125 μl의 상층 액을 취하여 OD _420을 측정하십시오.
      참고 : 거품이 발생하지 않도록 마지막 방울을 분사하지 마십시오.
   4. 스프레드 시트에서 β-gal 활성 : 1000 x OD ₄₂₀ / (시간 (분) x 체적 (mL) x OD ₆₀₀₎ 을 계산한다.

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결과

관심 단백질 ( 그림 2 )와 효모 세포에서 DNA 영역의 공동 변환을위한 일반적인 플레이트 설정 절차. 플레이트 셋업은 실험의 필요성 및 테스트 된 DNA 영역 / 단편의 수에 따라 수정 될 수있다. 프로토콜의 5 일 이후 well-grown 및 positive plate는 그림 3 과 같이 보여야합니다. 우리의 연구에서, 전사 시작 부위의 시작으로부터 2600 bp 상?...

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토론

기존의 Y1H 표준 절차는 DNA 미끼에 결합하는 단일 단백질 먹이를 확인하는 데 적합합니다. 다양한 기술적 변경에 따라, 기존의 시스템은 전사 조절 네트워크를 정의하는 데 이용되어왔다. 그러나 TF는 두 개 이상의 TF 또는 단백질을 포함하는 복합체의 일부로 기능하는 것으로 알려져 있으며 TF의 일부만이 DNA에 결합 할 수 있습니다. 단백질 결합 도메인만을 갖고 DNA에 결합하는 능력이 결핍 된 단백...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
pDEST22 vector	Invitrogen	PQ1000101	Pro-Quest Two hybrid system kit
pDEST32delatDBD	Invitrogen	PQ1000102	Pro-Quest Two hybrid system kit; this vecor is modified. It is pDEST32 minus DNA binding Domain
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Invitrogen	K240020
YM4271 Strain	Clontech	K1603-1	MATCHMAKER One-Hybrid System
pEXP-AD502	Invitrogen	PQ1000101	Pro-Quest Two hybrid system kit
GATEWAY LR Clonase II enzyme mix	Invitrogen	11791020
YPDA media	Clontech	630410
SD-Agar	Clontech	630412
SD minimal media	Clontech	630411
Uracil DO Supplement	Clontech	630416
Tryptophan Do Supplement	Clontech	630413
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-1
EDTA	Fisher Scientific	S311-500
LiAc	Sigma-Aldrich	L4158
Saplmon Sperm (10mg/ml)	Invitrogen	15632011
96 well round bottom Plate	Greiner bio-one	650101
PEG3350	Sigma-Aldrich	1546547
96-deep well block	USA Scientific	1896-2000
Sealable Foil	USA Scientific	2923-0110
Araseal	Excel Scientific	B-100
2-mercaptoethanol	Fisher Scientific	034461-100
ONPG	Sigma-Aldrich	73660
Na2CO3	Sigma-Aldrich	223484
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S3264
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S3139
KCL	Fisher Scientific	BP366-500
MgSO4	Sigma-Aldrich	83266
HCL	Fisher Scientific	SA54-4
Drybath	Thermo Fischer
Voretx	Thermo Fischer
Centrifgue	Eppendorf	Centrifuge 5810R
Plate Reader	Molecular Device		SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer
Incubator	Thermo Fisher	Model No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees
Shaker Incubator	New Brunswick
Water Bath	Thermo Fisher	IsoTemp 205
Puncher
50 ml Falocn	BD Falcon
Beaker	Nalgene
Flask	Nalgene
Petriplates (150mm)	Greiner bio-one