توليف "باكتيريوفاجيس المعدية" في كولاي-استناداً إلى "نظام التعبير" الخلية الحرة

Summary

قد تم تصميم جيل جديد من المنصات ترجمة النسخ خالية من الخلية لبناء النظم البيوكيميائية في المختبر من خلال تنفيذ الدوائر الجينات. في هذه المقالة، يصف لنا كيف bacteriophages، مثل MS2 و ΦΧ174 و T7، يتم توليفها من الجينوم استخدام نظام تكستل كولاي كل خلية خالية.

Abstract

جيل جديد من نظم خالية من الخلية النسخ الترجمة (تكستل)، إجراء هندسة عكسية لبراعة أكبر ونمطية، توفير قدرات جديدة لأداء العلوم الأساسية والتطبيقية في أنبوب اختبار ردود الفعل. على مدى العقد الماضي، أصبحت خالية من الخلية تكستل تقنية قوية لمجموعة واسعة من البحوث المتعددة التخصصات رواية مجالات البيولوجيا المتعلقة بالكمية والاصطناعية. منصات تكستل جديدة مفيدة بشكل خاص لبناء واستجواب نظم الكيمياء الحيوية من خلال تنفيذ الدوائر الجينات الطبيعية أو الاصطناعية. في المختبر تكستل ثبت مريحة لسرعة النموذج العناصر التنظيمية والشبكات البيولوجية، وكذلك فيما يتعلق بالخص الجزيئية التجميع الذاتي الآليات الموجودة في النظم الحية. في هذه المقالة، يصف لنا كيف المعدية bacteriophages، مثل MS2 (الرنا)، ΦΧ174 (سدنا)، و T7 (dsDNA)، يتم توليفها تماما من على الجينوم في وعاء واحد ردود فعل استخدام جميع الإشريكيّة القولونية، خالية من خلية النظام تكستل. توليف كوليفاجيس ثلاثة هو كمياً باستخدام مقايسة البلاك. علينا إظهار كيف غلة بالعاثية تجميعي يعتمد على إعدادات البيوكيميائية من ردود الفعل. مزاحمة الجزيئية، محاكاة عن طريق تركيز الخاضعة لربط 8000، يؤثر على مقدار فاجيس المركب بأوامر مقادير. كما يصف لنا كيفية تضخيم في phages وكيفية تنقية الجينوم. ينبغي أن يكون المجموعة من البروتوكولات والنتائج المعروضة في هذا العمل من اهتمام الباحثين متعددة التخصصات تشارك في البيولوجيا التركيبية خالية من الخلية والهندسة الحيوية.

Introduction

على مدى العقد الماضي، قد تم تصميم تكنولوجيا الخلية الحرة التعبير بعنوان تطبيقات جديدة في بحوث متعددة التخصصات الناشئة مجالات البيولوجيا المتصلة الاصطناعية والكمية. المستخدمة في الأصل للتعبير عن البروتينات مستقلة عن كائن حي، وضعت نظم تكستل خالية من خلية جديدة لكل العلوم الأساسية والتطبيقية^1،2، توسيع نطاق هذه التكنولوجيا إلى حد كبير. تم تصميم الجيل الجديد من منصات تكستل لتكون سهلة الاستعمال، أكثر كفاءة (تصل إلى 2 ملغ/مل البروتين في الوضع الدفعي³)، أكثر تنوعاً على مستوى النسخ⁴، ووحدات ذلك لأن الاندماج بسهولة في الرواية الطبيعية أو الوظائف التركيبية التي توسيع قدرات النظم البيولوجية الموجودة^5،6. على وجه الخصوص، أصبحت خالية من خلية نظم تكستل مفيد للنماذج الأولية السريعة للبرامج الوراثية، مثل العناصر التنظيمية أو الدوائر الصغيرة الوراثية^7،،من⁸⁹، بتقليل التصميم-البناء-الاختبار دورة لبضعة أيام. بشكل ملحوظ، نظم تكستل الجديدة أيضا قادرة على تجهيز البرامج الحمض النووي الكبيرة مثل التوليف كاملة من كوليفاجيس^10،11، إثبات قوية الأداء ما يكفي لدعم إعادة تشكيل نشط الجينوم الحمض النووي ترميز الكيانات الحية.

نظم تكستل يقدم العديد من المزايا التقنية مقارنة بالتقليدية في المختبر فحوصات الكيمياء الحيوية البناءة. الخلية الحرة تكستل يربط عملية التعبير الجيني للمنتج النهائي في بيئة مفتوحة وانخفاض، بدلاً من السيتوبلازم تعقيداً من خلية حية. تكستل يستخدم الحمض النووي لإعادة بناء النظم البيوكيميائية في المختبر، مع التقنيات الحديثة من الجمعية الحمض النووي، وأسعار معقولة وسريعة بالإضافة إلى لا تتطلب خطوات تنقية البروتين نيقة. الخلية الحرة التعبير يوفر الوصول المباشر إلى معظم العناصر في التفاعلات الكيميائية الحيوية، وبالتالي السماح تشريح أعمق من التفاعلات الجزيئية¹². في رد فعل تكستل، أحد تغيير إعدادات البيوكيميائية والفيزيائية في الإرادة، ويكاد يكون مستحيلاً في خلية حية. ونظرا لهذه المزايا والتحسينات الأخيرة، تكستل التكنولوجيا أصبحت أكثر وأكثر شعبية كمنصة بديلة للبيولوجيا التركيبية والكمية. بينما الأوساط البحثية باستخدام تكستل تنمو بسرعة وأصبحت تكستل تقنية قياسية في الهندسة الحيوية، من الضروري لفهم كيفية استخدام هذه المنصات لتطوير الممارسات الملائمة ذات الصلة بتنفيذ تكستل ردود فعل وإلى تفسير للنتائج.

في هذه المقالة، نحن تصف كيفية استخدام نظام تكستل كولاي جميع توليف، في وعاء واحد من ردود الفعل، باكتيريوفاجيس من على الجينوم¹¹، مثل MS2 (الجيش الملكي النيبالي، 3.4 كيلو بايت)، ΦΧ174 (سدنا، 5.4 كيلو بايت)، و T7 (دسدنا، 40 كيلو بايت). علينا إظهار كيفية توليفها مبلغ فاجيس تغييرات فيما يتعلق ببعض الإعدادات البيوكيميائية من ردود الفعل (تركيزات المغنيسيوم والبوتاسيوم). مزاحمة الجزيئية، محاكاة عن طريق تركيزات تتراوح من شماعة 8000، له تأثير كبير على توليف بالعاثية على عدة أوامر من ضخامة. تحقيق مثل هذه النظم البيوكيميائية الكبيرة في أنبوب اختبار واحد ردود الفعل أن الخص في الوقت نفسه عمليات النسخ، الترجمة، والتجميع الذاتي، من المثير للاهتمام لمعالجة المسائل الأساسية المتعلقة بعلم الأحياء والفيزياء الحيوية ¹⁰ (تنظيم الجينات، التجميع الذاتي)، فضلا عن تطوير التطبيقات، مثل repurposing بالعاثية مهام بناء جديد النانو¹³. بالإضافة إلى عملي في تكستل، نحن نقدم أساليب التضخيم بالعاثية الجينوم استخراج وتنقية والكمي بالعاثية بمقايسة اللوحة. الأساليب التي عرضت في هذه المخطوطة المناسبة للباحثين الذين يستخدمون نظم خالية من الخلية على أساس استخراج كولاي ومهتمون ب bacteriophages.

البروتوكولات المقدمة في هذا العمل يمكن تلخيصها كما يلي: 1) بالعاثية التضخيم (يوم 1: إعداد تلقيح الخلايا، يوم 2: واحد البلاك ومتعددة بالعاثية النمو، والتركيز، ويوم 3: تنقية بالعاثية)، 2) استخراج الحمض النووي الجينوم مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل (الفينول/كلوروفورم الاستخراج)، و 3) رد فعل بالعاثية خالية من الخلية والتجربة عيار (1 يوم: لوحة الخلايا المضيفة وجعل لوحات أجار، يوم 2: رد فعل الخلية الحرة والمضيف الخلية 3 الثقافة السابقة، واليوم: عيار الثقافة وبالعاثيه الخلية المضيفة).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ملاحظة: الخطوات التالية التضخيم وطريقة استخراج قابلة للتعميم إلى حد كبير للعديد من بالعاثية الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل، مثل عاثية T7, enterobacteria بالعاثية T4 أو enterobacteria بالعاثية λ (L). وهي تستخدم أساسا بالعاثية الجينوم التي ليست متاحة بسهولة للشراء من مصادر تجارية-

1-"التضخيم بالعاثية"

ملاحظة: أسلوب إنتاج بالعاثية (مفروض) لوحة واحدة، ودورة متعددة وصفاً جيدا بالعاثية T4 في تشن, et al. ¹⁴ التالية بالعاثية التضخيم والحمض النووي طريقة الاستخراج تعميم للاستخدام مع كولاي فاجيس الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل، مثلاً، T7, T4 أو ل. النجاح النهائي للبروتوكول يعتمد اعتماداً كبيرا على سلالة خلية المضيف المحدد ' s القدرة على الصمود في وجه الظروف عدوى إضافية. إذا كانت الخلايا المضيفة غير مستقرة تحت عدوى إضافية، أو لم يتم التوصل إلى عدوى إضافية، وتحلل ابدأ التوصل إلى هذه المرحلة الحرجة، فمن الأفضل المضي قدما في وضع بروتوكول تحلل المتلاقية. ويشمل هذا الفصل بين الحطام الخلوية عن طريق الطرد المركزي عالية السرعة، والتكوير بالعاثية سرعات تنبيذ فائق. جميع الشروط والمعلمات التالية هي بمثابة نقطة بداية عام. قد تكون الظروف المثلى لخط خلية المضيفة محلية المختلفة؛ تحديد، والتقيد بالشروط المناسبة.

1. إعداد تلقيح خلايا
   1. تطعيم 10 مل بيرتاني لوريا (رطل) وسائط الإعلام في أنبوب ثقافة 15 مل مع الخلايا المضيفة كولاي، مثلاً، ب أو K12-
   2. مكان في شاكر تعيين إلى 250 دورة في الدقيقة و 37 ° إجازة جيم بين عشية وضحاها ليصل إلى التشبع.
2. لوحة واحدة، والنمو بالعاثية دورة متعددة وتركيز
   1. لتحضير طبق لويحات بالعاثية المختصة، الحارة عدة لوحات أجار رطل في 37 درجة مئوية ح 1، أو بين ليلة وضحاها.
   2. يعد تخفيف العديد من الأسهم بالعاثية (مثلاً T7 أو T4 L) تركيز المعروفة في رطل، تهدف إلى تحقيق ~ 10 ²-10 ³ بالعاثية مليلتر.
   3. إضافة 100 ميليلتر للنمو بين عشية وضحاها من الخلايا المضيفة مركزة لكل لوح.
   4. اختر أحجام أعد بالعاثية تخفيف المقابلة لمجموعة من 10-100 بالعاثية/لوحة. إضافة وحدة التخزين المطلوبة لتخفيف بالعاثية إلى كل لوحة (مثلاً، 100 ميليلتر بالعاثية ³ 10/مل؛ وهذا ينبغي أن تنتج لويحات ~ 100). احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية ويبدأ جهاز ضبط وقت العد إلى أعلى (+ 0 ح). احتضانها ل h. 4-5
   5. تحضير الوسائط مل 49 رطل في قارورة 250 مل ومكان في الروتاري شاكر تعيين إلى 250 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية.
   6. في + 2.5 ح، تمييع الخلايا 50 x بإضافة 1 مل ثقافة المشبعة الخلية من النمو بين عشية وضحاها إلى قارورة المعالجون مسبقاً تتضمن المتوسطة 49 مل رطل. حالما تصل الخلايا إلى سجل النمو (+ h 4-5)، قياس امتصاص 600 نانومتر (OD ₆₀₀). تحديد تركيز الخلايا باستخدام تحويل OD ₆₀₀ 1، 0 = 8 × 10 ⁸ خلية/مل.
   7. ديلوت إلى 2 × 10 ⁷ خلية/مل باستخدام وسائط النمو رطل إضافية. قم بإزالة لوحة أجار تتضمن لويحات بالعاثية من الحاضنة. فورا استخدام نهاية ماصة باستور معقمة بالأساسية وإزالة لوحة واحدة. ضربة على اللوحة في خلايا المخفف واحتضان في 37 درجة مئوية لإضافية 2 ح (+ ح 6-7)-
   8. اختبار للإصابة الكاملة بأخذ عينة 500 ميليلتر إلى أنبوب 1.5 مل، وإضافة 10 ميليلتر كلوروفورم (شكل ₃)، وفورا فورتيكسينج بسرعة عالية. ملاحظة إذا كان الحل قد أوضحت. مجرد تماما من إصابة الخلايا، احتضانها لآخر ح 2 (+ ح 8-9)-
      ملاحظة: إذا كانت الخلايا مصابة تماما، أنهم سوف سريعاً (< 2 دقيقة) وتوضيح الحل. وتعتبر النتائج الأخرى في مناقشة الفرع الوارد أدناه. الخلايا سوف سوبيرينفيكتيد ولكن سوف لا تصل إلى هذه النقطة. إذا كان يبدأ تحلل، إضافة الدناز والحصاد بالطرد المركزي يجب أن تبدأ فورا للحيلولة دون تدهور بالعاثية.
   9. "الدناز إضافة" إلى 5 ميكروغرام/مل والطرد المركزي الخلايا في س 8,000 ز عند 4 درجة مئوية بيليه. تجاهل المادة طافية. ريسوسبيند بيليه في 10 مل كلوريد المغنيسيوم x TRIS 1 (TM) (50 مم من تريس في الأس الهيدروجيني 7.8، 10 مم مجكل ₂) المخزن المؤقت مع 5 ميكروغرام/مل الدناز. إضافة 500 ميليلتر من شكل ₃ ودوامه بسرعة عالية الخلايا. توضيح عن طريق استخدام الطرد المركزي في 12,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 جيم صب المادة طافية إلى 15 مل الأنبوبة المخروطية ومخزن في 4 ° درجة مئوية.

2. تنقية بالعاثية

ملاحظة: تنقية السكروز يعتمد إلى حد كبير على حجم بالعاثية. اعتبارات لكتلة بالعاثية أن تكون معزولة وسوف يتعين القيام بها وإجراء التعديلات على شروط التدرج. التتر الفيروسية النهائي لما يزيد على 10 ¹³ بالعاثية مليلتر قابلة بسهولة مع هذا الأسلوب.

1. إعداد 12 مل من 5% و 45% w/v السكروز في 1 × العازلة TM.
2. تحضير التدرجات السكروز 4 × 5-45% من بيبيتينج مل 2.5 من السكروز بنسبة 45% إلى 4 أولتراسينتريفوجي أنابيب. أعلى مع ~ 2.6 مل سكروز 5%، وقف عند السائل يصل إلى 2 مم من حافة الأنبوبة.
   ملاحظة: وضع طرف الماصة مع سطح محلول السكروز والاستغناء السائل ببطء شديد. سوف تطفو أخف وزنا من محلول السكروز أعلى أثقل، تشكيل حدود مميزة. حلاً طبقات بشكل صحيح سوف يكون واجهة مم ~ 1 إذا عقد على ضوء خلفية.
3. ميكس التدرجات بالتناوب إمالة أنبوب استخدام تدرج تشكل أداة ل 43 ثانية في 86° 23 لفة في الدقيقة. إذا لزم الأمر ليس على الفور، تغطية مع الفيلم البارافين وتخزينها في 4 ° C.
4. إزالة 500 ميليلتر من الجزء العلوي من كل إعداد التدرج السكروز مع 1 مل بيبيتور والتوازن داخل ± 0.002 غ.
5. المعلقات بالعاثية تجمع من جميع الأنابيب (الخطوة 1.2.9). استخدام ماصة 1 مل، إضافة 500 ميليلتر من التعليق بجلب معلومات اتصال مع سطح السائل ببطء شديد الاستغناء عن وحدة التخزين على الجزء العلوي من التدرج السكروز، مع الحرص على عدم خلط عن طريق بيبيتينج السريع. أجهزة الطرد المركزي في 70,000 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: التوازن التدرجات المعدة إلى داخل ± 0.002 غ. فاجيس أصغر قد يستغرق تصل إلى 1 h.
6. إزالة العصابات بالعاثية باستخدام المحاقن المعقمة وقنية كليلة.
   ملاحظة: عندما ينظر إليه من الجانب، الفرقة بالعاثية سوف تكون سميكة وحليبي مقارنة بالمناطق المحيطة بها، حوالي 5 مم في الارتفاع، ويقع نصف الطريق إلى أسفل الأنبوب الطرد المركزي.
   1. سوبميرجي قنية كليلة في الحل حتى التلميح يتركز على الحافة العلوية جداً من الفرقة بالعاثية. إزالة الفرقة بالاعتماد على المكبس حقنه حتى تم إزالة معظم الفرقة بالعاثية.
7. إضافة إلى حجم السكروز مع بالعاثية مع وقف التنفيذ لأنابيب أولتراسينتريفوجي 3-4. قم بإضافة لا أكثر من 1.5 مل/الأنبوبة. تعبئة إلى ~ 3-4 ملم من الجزء العلوي من الأنبوب مع الباردة 1 × TM. تغطية مع الفيلم البارافين وعكس إلى المزيج. مكان مرة أخرى في أولتراسينتريفوجي وتدور في 145,000 س ز ح 1 في 4 درجات مئوية لبيليه. فاجيس أصغر قد يستغرق مدة تصل إلى 2 حاء
8. بسرعة من أجل إيقاف المادة طافية واستنزاف رأسا على المسحات يمكن التخلص منها. يمسح داخل الأنبوب مع مسحه القطن المعقم لإزالة المادة الزائدة طافية.
9. تقسيم 200-400 ميليلتر الباردة 1 x TM عبر جميع الكريات وريسوسبيند بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية؛ ولا تهز مطلوب.
   ملاحظة: إذا لم يكن بيليه نظيفة، مثلاً، مفتول العضلات بت من الغشاء، الحمض النووي، و ما إلى ذلك، تجمع وإجراء الطرد المركزي الإضافية في ميكروسينتريفوجي في 17,000 غ. س
10. اليوم السابق مما يجعل التتر، إعداد ثقافة الخلايا المضيفة كولاي في وسائط النمو مل 10 رطل وترك في حاضنة تهتز تعيين 250 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. احتضان المقدار المناسب من لوحات الثقافة في 37 درجة مئوية على الأقل 1 ح قبل إجراء التتر المخزون بالعاثية.
    ملاحظة: عدد لوحات لاحتضان يعتمد على عدد تخفيف المخزون بالعاثية يكون مطلي: يتطلب كل تمييع فريدة من نوعها للأسهم بالعاثية هما الثقافة لوحات (مثلاً، أربعة تخفيف مختلفة من الأسهم بالعاثية تتطلب ثمانية الثقافة لوحات).
إعداد
11. 100 مل أجار أعلى عن طريق إضافة ز 2.5 رطل وغ 0.6 بكتو-أغار على زجاجة 100 مل. تذوب المواد الصلبة في المياه في حجم 100 مل والاوتوكلاف. بعد اﻷوتوكﻻف، ببطء عكس الزجاجة 6-8 مرات مجانسة أجار طوال الحل. ضع الزجاجة في حمام المياه 45 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة حجته درجة الحرارة .
12. إعداد المسلسل تمييع الأرصدة بالعاثية مع الحل رطل.
    1. ميليلتر إضافة 990 رطلا إلى 10 ميليلتر بالعاثية الأسهم لإضعاف 100-fold. دوامة مجانسة. لعامل 10 إضعاف، إضافة 100 ميليلتر من الأسهم بالعاثية إلى ميليلتر 900 "رطل دوامة" مجانسة.
    2. تكرار سلسلة تمييع أعلاه عدة مرات كما تحتاج للحصول على عدد معدود من لويحات (10-100 لويحات).
       ملاحظة: لتحقيق هذا الهدف، تضعف الأسهم بالعاثية 2-3 أوامر من حجم أقل من عائد بالعاثية المتوقعة فيما يتعلق برد فعل بالعاثية مليلتر. على سبيل المثال، إذا كان مخزون بالعاثية خاص يحتوي على 10 ¹¹ المعدية بالعاثية مليلتر، لوحة الأسهم بالعاثية في 10 ⁸-إضعاف أو 10 ⁹-إضعاف إضعاف-
13. تعد مجالاً التتر بالعاثية بتجميع أنابيب الثقافة مل 14 (عدد أنابيب الثقافة يساوي عدد بالعاثية تخفيف المخزون يكون مطلي). وضع العينات الأسهم بالعاثية المخفف من الخطوة 2.12 والخلايا البكتيرية المضيف من الخطوة 2.10 على مدت
إعداد مزيج رئيسي من
14. من بيبيتينج مل 5.25 أعلى أجار (الخطوة 2.11)، تضعف ميليلتر 220 بالعاثية عينات (الخطوة 2، 12)، وأنبوب 50 الخلايا البكتيرية المضيف ميليلتر (الخطوة 2.10) إلى ثقافة 14 مل. كاب الأنبوب الثقافة ودوامه بسرعة عالية-
    1. تخزين الحل بالعاثية المتبقية في 4 ° C.
15. استرداد اثنين الثقافة لوحات (الخطوة 2، 10) من حاضنة 37 درجة مئوية. إضافة 2.5 مل مزيج الرئيسي ببطء إلى وسط اللوحة الأولى (بدون فقاعات). بلطف تدوير اللوحة باليد لتوزيع مزيج الرئيسي بالتساوي بحيث أنه يمتد لوحة ثقافة كاملة. كرر مع اللوحة الثانية. الانتظار 20 دقيقة لضمان ترسيخ أجار أعلى. احتضان لوحات في 37 درجة مئوية حاء – 4-7
16. عد لويحات وتحديد تركيز بالعاثية لكل عينة رد فعل-
    ملاحظة: سوف تظهر لويحات كدوائر واضحة 1-2 مم في السجاد مبهمة للخلايا المضيفة. انظر الشكل 1 للنتائج التمثيلية. سيؤدي إلى إنتاج بالعاثية ناجحة في تركيزات النهائي ¹³ 10 ¹²-10 بالعاثية/مل.

3. مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل "استخراج الحمض النووي الجينوم"

ملاحظة: تمييع، تهتز، وخطوات استخدام الطرد المركزي يجب أن يكون الأمثل لوضع طبقة حدود بروتين سميكة ومتينة بين مرحلتي مائي والفينول. وهذا يولد الجينوم نقاوة أعلى خالية من الملوثات البروتين. التخفيف الأولى فيعتمد على عيار بالعاثية النهائي. أسهم بالعاثية عيار عالية للغاية (≥ 10 ¹³ بالعاثية مليلتر) قد تحتاج إلى إضعاف إضعاف-10-20 قبل الاستخراج، بينما مخزونات عيار منخفضة (¹⁰-10 ~ 10، ¹¹ بالعاثية/mL) قد تحتاج فقط إضعاف أو بلا. إذا كان من الصعب أن تشكل طبقة صلبة من بروتين في الخطوات اللاحقة أو تعليق مائي لزجة جداً تكون قابلة للتطبيق بسبب ارتفاع تركيز الحمض النووي، النظر في إضعاف أعلى من مخزونات بالعاثية قبل مواصلة الاستخراج. خلال أي خطوة معالجة الجينوم، من المهم استخدام ماصة واسعة تحمل نصائح عند بيبيتينج أي مراحل مائي. كثيرة بالعاثية الجينوم كبيرة جداً ومجزأة بسهولة عن طريق القص ماصة. بالإضافة إلى ذلك، أي فورتيكسينج وينبغي صراحة تجنب هذا سوف شدة القص الجينوم.

1. تمييع جزء من مخزون بالعاثية من الخطوة 2.9 إلى 400 ميليلتر مع 1 × TM المخزن المؤقت في أنبوب جديد 1.5 مل.
إضافة
2. بحجم Tris:Phenol:Chloroform متساوية للتخفيف. اهتز الخليط برفق في مختبر الروك، أو من جهة، للطرد المركزي الحد الأدنى 5 مستحلب الناتجة في 17,000 ز س في benchtop أجهزة الطرد مركزي للحد الأدنى 5-10
   ملاحظة: طبقة بروتين متميزة، بيضاء على سطح المرحلة الأساسية الفينول موجود.
3. إزالة المرحلة المائية العليا إلى أنبوب جديد مع الحرص على عدم الإخلال بالحدود الطور البيني.
كرر
4. 3.2-3.3 خطوات إضافية 2 مرات لما مجموعة 3 الفينول الاستخراج. نقل المرحلة المائية إلى أنبوب جديد وإضافة وحدة تخزين المساواة تشكل ₃. ويهز الطرد المركزي (الخطوة 3، 2). نقل عينات الحمض النووي مائي لأنبوب نظيفة.
5. تقدير حجم الحمض النووي المنقي. إضافة مجلدات 0.4 من خلات الصوديوم 3 م (CH ₃ كونا) و 3 مجلدات من الإيثانول 95% (EtOH). وضع في الثلاجة-20 درجة مئوية لهطول الأمطار بين عشية وضحاها. أجهزة الطرد المركزي في 17,000 س ز في أجهزة الطرد مركزي benchtop عن 10-15 دقيقة
   ملاحظة: الحمض النووي سيتم فورا يذوي وتصبح مرئية ككتلة تعليق في الأنبوب. بيليه الناتج الصحيح الأبيض ومعبأة جيدا ضد الجزء السفلي من الأنبوب.
إزالة
6. وتجاهل المادة طافية أما عن طريق الصب أو بيبيتينج. إضافة 500 ميليلتر 70% EtOH ويهز الأنبوب بلطف حتى بيليه يعوم مجاناً من الجزء السفلي من الأنبوب. الطرد المركزي في 17,000 س ز لأدنى 5 إزالة وتجاهل EtOH، مع الحرص على عدم إزعاج بيليه.
7. كرر الخطوة 3، 6. الهواء الجاف بيليه على benchtop عن 30-60 دقيقة إضافة 50 ميليلتر ddH ₂ س لبيليه واحتضانها ح 1 في الرايت أو بين ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية ريسوسبيند. تحديد تركيز الحمض النووي باستخدام قياسات الاستيعاب في 280 نانومتر.
   ملاحظة: التركيزات المتوقعة هي 0.5-5 ميكروغرام/ميليلتر باستخدام هذا الأسلوب. القسمة على مجموع الوزن الجزيئي الجينوم لتحديد تركيز الجينوم النهائية-

4. الخلية الحرة بالعاثية رد الفعل والتجربة عيار بالعاثية

1. إعداد متوسطة ز 25 رطل والصلبة أجار باكتو ز 15 وتصب في زجاجة 1 لتر، وإضافة المياه إلى 1 لام اﻷوتوكﻻف.
2. بعد التعقيم، عكس الزجاجة ببطء 6-8 مرات أخذ العناية لتجنب تشكيل الفقاعات. وسوف تجانسه انعكاس زجاجة الصلبة أجار طوال الحل 1 لتر. ضع الزجاجة في حمام مائي 58 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة قبل صرفها على لوحات الثقافة-
3. مرة واحدة وقد اكويليبراتيد درجة حرارة الحل رطل-أجار، إعداد لهب بجوار لوحات الثقافة لتعقيم البيئة قرب لوحات الثقافة مفتوحة. الاحتفاظ بزجاجة 1 لتر في حوض ماء لتجنب ترسيخ أجار حين جعل في مختبرين. إضافة 25 مل في لوحة ثقافة 100 ملم × 15 ملم. سوف تنتج 1 لتر 40 ثقافة لوحات.
4. جانبا لوح الثقافة واحد والسماح لترسيخ لمالا يقل عن 1 ح في الرايت؛ وسوف تستخدم هذه اللوحة لطلاء الخلايا المضيفة. تمكنك لوحات أخرى الثقافة 39 يصلب لمدة يومين في مخزن الرايت عند 4 درجة مئوية أو استخدامها على الفور لصنع التتر.
لوحة
5. الخلايا المضيفة قبل streaking الضغط البكتيرية المناسب (مثلاً، المضيف (ب) ل T7) التي تم تخزينها في-80 درجة مئوية، على لوح ثقافة أجار رطل. متواصلة بجوار لهب المكشوف لتجنب التلوث البيئي. تبني بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. الخلايا المضيفة لها أي مقاومة المضادات الحيوية حيث تعمل في بيئة معقمة ضروري-
6. رد فعل الخلية الحرة
   ملاحظة: ردود فعل تكستل خالية من الخلية تتألف من 33% استخراج النفط الخام كولاي (8.9 9.9 ملغ/مل بروتين) مع 67% أخرى تتألف من رد فعل المخزن المؤقت وبالعاثيه الجينوم. استخراج النفط الخام مستعدة كما سبق وصف ^{15 ، 16}. شروط الرد النهائي: 8.9 9.9 ملغ/مل من البروتين (من استخراج النفط الخام)، 3-6 مم مغ-غلوتامات، 40-100 مم كغلوتامات، 8000 ربط % 2-4، 3-4 مم من كل من الأحماض الأمينية، أعدت كما هو موضح سابقا ¹⁷، وحلا مزيج الطاقة، ووصف سابقا ¹⁵، تتألف من 0.33 3.33 مم DTT، 50 مم هيبيس، 1.5 مم ATP وأنشئ، 0.9 مم CTP و UTP، 0.2 مغ/مل الحمض الريبي النووي النقال، 0.26 مم CoA و 0.33 ملم ند، مخيم 0.75 ملم، حامض فولينيك مم 0.068، سبيرمدين 1 مم و 30 ملم 3-الشبكة. الحمض النووي من نوع فاجيس تتطلب الجينوم تركيزات 0.5-10 نانومتر والجيش الملكي النيبالي من نوع فاجيس تتطلب مجموعة من 50-150 نانومتر. هي فريدة من نوعها بالعاثية خاص توليف تركيزات الرد النهائي وسوف تقع ضمن النطاقات المذكورة أعلاه. ينبغي أن تكون وحدات الرد النهائي للأوكسجين المثلى من ردود الفعل، بين 10-20 ميليلتر. هناك اختلافات صغيرة في البروتوكول، وردود الفعل التي تعتمد على شكل الجزيء الجينوم. على سبيل المثال، تتطلب جزيئات جينوم خطي عنصرا إضافيا في رد فعل على تحول دون هضم قطع الدنا الخطي بالانزيم ريكبكد موجودة في استخراج النفط الخام.
   1. كاملة " تفاصيل رد فعل " الباب في الجدول 1 (PhageTXTL_JOVE) بإدخال العدد الإجمالي لردود الفعل والحجم النهائي للرد.
   2. تصميم التجربة بتحديد عناصر ثابتة وعناصر متغيرة من رد فعل. أدخل النسبة المئوية لحجم كسرى من مزيج الرئيسي، وهو أن نسبة الحجم الكلي لمكونات التفاعل المستمر للمنتج من حجم الرد النهائي وعدد العينات. أدخل الأسهم وتركيزات الكواشف رد فعل في النهائي " "وصفه رد فعل مزيج ماجستير" " القسم في PhageTXTL_JOVE. أدخل الأسهم وتركيزات reagent(s) متغير اختبار نهائي-
      ملاحظة: وحدات تخزين مكونات رد فعل تلقائياً ويتم احتساب استناداً إلى حجم مزيج الرئيسي والحجم النهائي لكل رد فعل الفرد.
   3. إزالة المبلغ اللازم لأنابيب (المشار إليه في " أنابيب لإذابة الجليد في " قسم من PhageTXTL_JOVE.xlsx) لاستخراج النفط الخام من الخلية، ومزيج الطاقة المخزن المؤقت، ومزيج من الأحماض الأمينية من-20 درجة مئوية أو-80 درجة مئوية وذوبان الجليد في مدت
      ملاحظة: مرة واحدة مذاب، الجمع بين مختبرين متعددة من مثل مكونات (إذا لزم الأمر).
   4. استخراج قاسمة حجم النفط الخام المشار إليه، 33% حجم الرد النهائي، في أنبوب ميكروسينتريفوجي.
   5. إعداد مزيج الرئيسي وفقا الجدول 1. مجانسة جميع العناصر تحت " "وصفه رد فعل مزيج الرئيسي" " من فورتيكسينج. إضافة وحدة التخزين المناسبة لكل مكون لاستخراج النفط الخام.
   6. إذا كان يعمل مع بالعاثية مع خطي جينوم الحمض النووي (مثلاً T7)، إضافة 1 ميكرومتر من البروتين حركة آتشيه الحرة لامدا عاثية إلى رد فعل ¹¹. دوامة مجانسة الحل، ووضع رد فعل على الجليد لمدة 5 دقائق. وهذا يحول دون هضم قطع الحمض النووي الخطية التي ريكبكد المعقدة، الذي الذاتية في استخراج النفط الخام-
   7. بعد إضافة مكون آخر حسب الجدول 1، مجانسة رد فعل من فورتيكسينج. تقسيم المزيج الرئيسي في أنابيب ميكروسينتريفوجي ن.
      ملاحظة: حجم كل تقسيم هو نتاج نسبة حجم كسرى مزيج الرئيسي وحجم الرد النهائي. على سبيل المثال، نسبة حجم مزيج رئيسي كسرى من 90% وحجم الرد النهائي من 12 ميليلتر، حجم كل تقسيم هو 10.8 ميليلتر.
   8. إضافة وحدات التخزين المشار إليها من مكونات متغير صفيف ميكس الرئيسية (انظر الجدول 1). إضافة المياه إلى كل رد فعل للوصول إلى وحدة التخزين المطلوب الرد النهائي. مجانسة رد فعل كل من فورتيكسينج. احتضان هذه الأنابيب ميكروسينتريفوجي في 29 درجة مئوية على الأقل 8 ساعات أو بين عشية وضحاها.
7. ثقافة البلد المضيف الخلية قبل
   ملاحظة: هي ثقافة ما قبل ليلة وضحاها المخفف 50: 1 التأكد من وجود الخلايا المضيفة التي استخدمت في التجربة عيار في سجل منتصف المرحلة، مما يزيد من كفاءة الإصابة. سجل منتصف الخلايا ثم إعادة مركزة بمقدار 10 إضعاف والمخزنة على الجليد.
   1. باستخدام تلميح ماصة معقمة، تطعيم أنبوب ثقافة مل 5 رطل مع مستعمرات الخلايا المضيفة صحية 3-5. العمل بجوار لهب المكشوف لتجنب التلوث.
   2. احتضان الأنبوب الثقافة في حاضنة تهتز في 37 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة 16 ح أو بين عشية وضحاها. الخلايا يمكن أن تصل إلى مرحلة التشبع في اليوم التالي-
8. استضافة إعداد خلية الثقافة وعينه لعيار بالعاثية
   1. الاستغناء عن 50 مل رطل في قارورة Erlenmeyer 500 مل وتغطي برقائق الألومنيوم. الحارة قارورة في 37 درجة مئوية ل 20 دقيقة
   2. الكوة 1 مل من ثقافة البلد المضيف قبل بين عشية وضحاها الخلية إلى "احتضان رطل" المعالجون مسبقاً ح 3-4 في 37 درجة مئوية وتهز 250 لفة في الدقيقة-
   3. تجاهل أجهزة الطرد المركزي ثقافة الخلية المضيفة 50 مل لمدة 10 دقائق في 5,000 غ. س رطل
   4. ريسوسبيند بيليه مع الباردة (4 درجة مئوية) 5 مل رطل والحفاظ على مدت
   5. ساعة واحدة قبل بدء التجربة عيار، احتضان لوحات الثقافة في 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: كل فعل بالعاثية فريدة من نوعها (والمقابلة تمييع عامل) سوف تستخدم لوحات اثنين. بالإضافة إلى ذلك، احتضان 4 لوحات لضوابط تجريبية (انظر الشكل 1 للممثل عناصر إيجابية وسلبية).
   6. إعداد 100 مل من أعلى أجار (الخطوة 2.11).
9. إعداد إضعاف مسلسل من رد فعل الخلية خالية مع الحل رطل كما هو موضح في المقطع 2.12.
10. عيار بالعاثية
    ملاحظة: تبدأ لوحة بعد أطباق الثقافة قد المحتضنة لمالا يقل عن 1 ح واجار الأعلى كان في حمام المياه 45 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة بعد إزالة من اﻷوتوكﻻف.
    1. عيار النهائي الخلية الحرة رطل رد فعل الحل كما هو موضح في القسم 2، خطوات 2.14 2.16.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

نعرض أربع نتائج تمثيلية. في الشكل 1، نقدم مجموعة من عناصر سلبية لضمان أن نظام تكستل خالية من الخلية ومخزونات الحمض النووي بالعاثية غير ملوثة بالمعيشة كولاي الخلايا. علينا التحقق من أن النظام تكستل خالية من الخلية خالية من سليمة كولاي الخلية التل...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

اتباع هذا الأسلوب في تشن, et al. ¹⁴ للشركة، هو التوصل إلى خطوة حاسمة عند تحديد الشروط المناسبة لعدوى إضافية. المعلمة التي يتحكم أوثق سلالة المضيف القدرة على الصمود في وجه عدوى إضافية هي كثيرا ما تركيز بالعاثية إصابة الأولية. يجب أن تكون الخلايا المضيفة في مرحلة النمو لوغاريت?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ultracentrifugation tubes	Beckman Coulter	344057
Conical tubes	Falcon	352070
Gradient maker	BioComp Gradient Master	see Anal Biochem. 1985 Jul;148(1):254-9.
Syringe and Blunt Cannula	Monoject	8881513918 and 888202017
Wide-bore pipette tips	Fischerbrand	02-707-134
Plaque counter	New Brunswik Scientific	Colony Counter Model C-110
Culture tubes	Fischerbrand	14-961-33
Cell-free system	Mycroarray Inc	Mytxtl
BioComp Gradient Master	BioComp Instruments	Model 105ME
LB agar plate recipe			25 g/L Luria-Bertani medium (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents product number BP1426) and 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson and Company - product number 214010).