Синтез инфекционных бактериофагов в E. coli-на основе свободных клеток выражение системы

Резюме

Новое поколение свободных клеток транскрипции перевод платформ был инженерии построить биохимических систем в vitro через исполнение цепи гена. В этой статье мы опишем, как бактериофагов, таких как MS2, ΦΧ174 и Т7, синтезируются из их геном, с использованием всех в свободных клеток E. coli TXTL системы.

Аннотация

Новое поколение систем свободных клеток транскрипции перевод (TXTL), для большей гибкости и модульности, предоставляют новые возможности для выполнения базовых и прикладных наук в пробирке реакция. За последнее десятилетие свободных клеток TXTL стала мощным инструментом для широкого круга новых междисциплинарных исследований районах связанные с количественным и синтетических биологии. Новые платформы TXTL особенно полезны для строительства и допросить биохимических систем через выполнение синтетических или природных гена цепей. В пробирке TXTL оказалось удобно быстро прототип регуляторных элементов и биологических сетей также относительно пилки молекулярной самосборки нашли механизмов в живых системах. В этой статье мы расскажем как инфекционные бактериофагов, например мс2 (РНК), ΦΧ174 (ssDNA) и Т7 (dsDNA), полностью синтезируются из их геном в реакциях одно горшок с помощью всех Escherichia coli, свободных клеток TXTL системы. Синтез трех Коли количественно с помощью assay металлической пластинкы. Мы покажем, как доходность синтезированных Фаговые зависит от биохимических параметров реакций. Молекулярные скученности, подражания через контролируемые концентрации PEG 8000, влияет на количество синтезированных бактериофаги приказами величин. Мы также описывают, как усилить бактериофаги и очистить их геномов. Набор протоколов и результаты, представленные в этой работе должна представлять интерес для многодисциплинарного исследователей, участвующих в свободной ячейке синтетической биологии и биотехнологии.

Введение

За последнее десятилетие адрес Роман приложениям в эмерджентных междисциплинарных исследований областей, связанных с синтетическими и количественных биологии была разработана технология ячейки свободного выражения. Первоначально используется для выражения независимо от живого организма белки, новые клетки-TXTL систем были разработаны для оба фундаментальных и прикладных наук^1,2, значительно расширение сферы применения этой технологии. Новое поколение TXTL платформ была разработана чтобы быть удобным для пользователя, более эффективным (достигнув 2 мг/мл синтеза белка в пакетный режим³), более универсальным на уровне транскрипции⁴и модульные тем чтобы легко интегрировать Роман природных или синтетических функций, которые расширяют возможности существующих биологических систем^5,6. В частности свободных клеток TXTL системы стали удобно для быстрого прототипирования генетических программ, таких как регуляторных элементов или небольших генетической цепи^7,8,9, уменьшая дизайн строить тест цикла на несколько дней. Удивительно, новый TXTL системы способны также обработки больших программ ДНК, таких как полный синтез Коли^10,11, демонстрируя сильный достаточно выступления в поддержку воссоздания активных геномной ДНК закодированы живых существ.

TXTL систем представляют многие технические преимущества, по сравнению с традиционными в vitro конструктивного биохимических анализов. Бесплатный сотовый TXTL связывает процесс экспрессии генов конечного продукта в ограниченной и открытой среды, в отличие от сложных цитоплазме живой клетки. TXTL использует ДНК для воссоздания биохимических систем в пробирке, который, с современными методами Ассамблеи ДНК, является доступным и быстрым в дополнение к не требующие требовательных белка очистки шагов. Клетки свободной выражение обеспечивает прямой доступ к большинству компонентов в биохимических реакциях, таким образом позволяя глубже рассечение молекулярных взаимодействий¹². В TXTL реакции можно изменить биохимические и биофизические параметры по желанию, который почти невозможно в живой клетке. Учитывая эти преимущества и недавние улучшения, TXTL технология становится все более и более популярным как альтернативную платформу для синтетических и количественных биологии. В то время как научно-исследовательское сообщество, с помощью TXTL стремительно растет и TXTL становится стандартной технологии в биоинженерии, важно, чтобы понять, как использовать такие платформы, с тем чтобы разработать адекватные практики, связанные с исполнением TXTL реакций и к Интерпретация результатов.

В этой статье, мы опишем, как использовать все системы TXTL E. coli синтезировать в один горшок реакциях, бактериофаги от их геном¹¹, таких как MS2 (РНК, 3.4 kb), ΦΧ174 (ssDNA, 5.4 kb) и Т7 (dsDNA, 40 КБ). Мы покажем, как количество бактериофаги синтезированных изменения в отношении некоторых биохимических параметров реакций (концентрации магния и калия). Молекулярные скученности, подражания через диапазон PEG 8000 концентрации, имеет огромное влияние на синтез Фаговые на несколько порядков. Реализация таких больших биохимических систем в одной пробирке реакциях, которые одновременно пилки процессы транскрипции, перевод и самостоятельной сборки, это интересно для решения основных вопросов, связанных с биологии и биофизики ¹⁰ (ген регулирование, самостоятельной сборки), а также для разработки приложений, таких как повторное использование фага функций для построения новых наноструктур¹³. Помимо практических на TXTL мы предоставляем методы для Фаговые амплификации, геном добычи и очистки и ФАГ количественной оценки в assay металлической пластинкы. Методы, представленные в этой рукописи являются подходящими для исследователей, которые используют E. coli экстракт на основе клеток-систем и заинтересованы в бактериофагов.

Протоколов, представленных в этой работе можно резюмировать следующим: 1) фага амплификации (1 день: подготовить прививка клетки, день 2: Одноместный зубного налета, несколько Фаговые роста, концентрации и день 3: Очистка ФАГ), 2) Double-stranded экстракции ДНК генома (извлечение фенола/хлороформ) и 3) свободных клеток Фаговые реакции и титр эксперимента (1 день: плиты клетки хозяина и сделать плиты агара, день 2: реакции свободных клеток и принимающей ячейки до культуры и день 3: принимающей ячейки культуры и ФАГ титр).

протокол

Примечание: следующие шаги усиления и метод извлечения значительной степени обобщаемым для многих двуцепочечной ДНК фага, например, бактериофага Т7, энтеробактерий ФАГ T4 или энтеробактерий Фаговые λ (L). Они используются преимущественно для фага, чей геном не доступны для покупки из коммерческих источников.

1. Фаговые усилители

Примечание: технология производства Фаговые сингл доска, мульти цикла (ГФПК) хорошо описана для ФАГ T4 в Чэнь, et al. ¹⁴ следующие Фаговые амплификации и ДНК извлечения метод представляет собой обобщение для использования с E. coli двуцепочечной ДНК бактериофаги, например, Т7, T4 или L. Конечный успех Протокола в значительной степени зависит от выбранного узла клеток штамма ' s способность выдерживать условия суперинфекции. Если клетки хозяина неустойчивы под суперинфекция, или суперинфекции никогда не достиг, и лизис никогда не будет достигнуто в ходе этого критического этапа, то лучше приступить вырожденная лизис протокол. Это включает в себя разделение сотовой мусора через высокоскоростной центрифугирования и ФАГ гранулирование на ultracentrifugation скоростях. Все следующие условия и параметры предназначены в качестве общей отправной точки. Оптимальные условия для локального хоста клеток линии могут быть разными; определить и соблюдать соответствующие условия.

1. Подготовить прививка клетки
   1. инокуляции 10 мл Бертани Лурия (LB) СМИ в трубке культуры 15 мл с E. coli клеток хозяина, например, B или K12.
   2. Место в шейкере, равным 250 об/мин и 37 ° C. оставить на ночь вырастет до насыщения.
2. Сингл доска, фаг мульти цикл роста и концентрация
   1. подготовить тарелку компетентных Фаговые бляшки, теплый несколько LB-агар пластин при 37 ° C за 1 ч, или на ночь.
   2. Подготовить несколько разведений Фаговые акций (например, Т7, T4 или L) известной концентрации LB средств массовой информации, направленных на ~ 10 ² -10 ³ ФАГ/мл.
   3. Добавить 100 мкл ночь роста клеток концентрированной хозяина к каждой табличке.
   4. Выбрать тома подготовленных Фаговые разведений соответствующий диапазон от 10-100 Фаговые/пластины. Добавьте необходимый объем Фаговые разведений на каждой пластине (например, 100 мкл 10 ³ ФАГ/мл; это следует производить ~ 100 бляшки). Инкубировать пластины при 37 ° C и начать таймер-вверх (+ 0 h). Инкубируйте 4-5 ч.
   5. Подготовить 49 мл LB СМИ в 250 мл флакон и место в Ротари шейкер, равным 250 об/мин и 37 ° C.
   6. На + 2,5 ч, разбавляют клеток 50 x, добавив 1 мл насыщенного клеточной культуры от ночи роста в подогретым флакон, содержащий 49 мл LB среднего. После того, как клетки прирост журнала (+ 4-5 ч), измерения оптической плотности на 600 Нм (₆₀₀ OD). Определить концентрацию клеток с использованием преобразования ОД ₆₀₀ 1,0 = 8 x 10 ⁸ клеток/мл.
   7. Развести до 2 x 10 ⁷ клеток/мл с помощью дополнительных фунтов роста средств массовой информации. Снять пластину агар, содержащий Фаговые бляшки из инкубатора. Немедленно используйте в конце стерильные пипетки Пастера для основных и удалить один налет. Удар бляшки в разреженных клетки и инкубировать при 37 ° C для дополнительных 2 h (+ 6-7 ч) и.
   8. Тест для полного инфекции, приняв 500 мкл пример в 1,5 мл, добавление 10 мкл хлороформ (₃ КХКЛ) и сразу же vortexing на высокой скорости. Соблюдайте, если решение прояснил. После того, как клетки полностью инфицированных, инкубировать еще 2 h (+ 8-9 h).
      Примечание: Если клетки полностью инфицированы, они будут быстро лизируют (< 2 мин) и уточнить решение. Другие исходы, считаются обсуждения ниже в разделе. Клетки будут superinfected, но не будет лизируют вплоть до этой точки. Если лизис начинается, DNase и уборки центрифугированием должны немедленно приступить к предотвращению деградации ФАГ.
   9. Добавить DNase 5 мкг/мл и центрифуги клеток на 8000 x g при 4 ° C для пеллет. Выбросите супернатант. Ресуспензируйте Пелле в 10 мл магния хлорида 1 x TRIS (TM) (50 мм трис при pH 7,8, 10 мм MgCl ₂) буфер с 5 мкг/мл DNase. Добавьте 500 мкл КХКЛ ₃ и вихрь на высокой скорости, чтобы лизировать клетки. Уточнить центрифугированием при 12000 g x 10 мин на 4 ° C. Decant супернатант в 15 мл Конические трубки и хранить при 4 ° C.

2. Очистка фага

Примечание: сахароза очистки в значительной степени зависит от размера ФАГ. Соображения для массы Фаговые быть изолированы должны быть сделаны и корректировки градиента условий выполнено. Окончательный вирусный титры свыше 10 ¹³ Фаговые/мл легко достижимы с помощью этого метода.

1. Подготовить 12 мл 5% и 45% w/v сахарозы в 1 x ТМ буфера.
2. Подготовка 4 x 5-45% сахарозы градиенты дозирования 2,5 мл 45% сахарозы в 4 ультрацентрифуга трубы. Топ с ~ 2,6 мл 5%-ая сахароза, останавливаясь, когда жидкости достигает 2 мм от края трубки.
   Примечание: Поместите наконечник пипетки контакт с поверхностью раствора сахарозы и очень медленно обойтись жидкость. Легче раствора сахарозы будет плавать на верхней части тяжелее, образуя различные границы. Должным образом слоистых решение будет иметь интерфейс ~ 1 мм, если против фона света.
3. Mix градиентов наклон труба вращения с помощью градиента, образуя инструмент для 43 s 86 ° при 23 об/мин. При необходимости не сразу, покрыть пленкой парафина и хранить при 4 ° C.
4. Удалить 500 мкл от верхней части каждого подготовленного градиента сахарозы с 1 мл дозаторов и баланса в пределах ± 0,002 г.
5. Бассейн Фаговые суспензий от всех трубок (шаг 1.2.9). С помощью пипетки 1 мл, добавьте 500 мкл суспензии путем привлечения кончик контакт с поверхности жидкости и очень медленно дозирования тома на вершину сахарозы градиента, будьте осторожны, чтобы не смешивать через быстрое закупорить. Центрифуга на 70000 x g 20 мин при 4 ° C.
   Примечание: Баланс подготовленных градиентов для в пределах ± 0,002 г. меньше бактериофаги может занять до 1 ч.
6. Удалить Фаговые полос с использованием стерильных шприцев и тупой канюлей.
   Примечание: Если смотреть со стороны, Фаговая группа будет густой и Млечный по сравнению с окрестностями, около 5 мм в высоту и находится на полпути вниз по трубе центрифуги.
   1. Submerge тупым канюли в раствор до тех пор, пока кончик центрируется в верхней полосе ФАГ. Удаление группы, опираясь на поршень шприца, до тех пор, пока большинство Фаговая группа была удалена.
7. Добавить объем сахарозы с отсрочкой Фаговые 3-4 ультрацентрифуга трубы. Добавьте не более чем 1,5 мл. Заливка-~ 3-4 мм от верхней части трубки с холодной 1 x ТМ. Покрытие пленкой парафина и инвертировать смешивать. Место обратно в ультрацентрифугирования и спина на 145 000 x g за 1 час при температуре 4 ° C для окатышей. Меньшие бактериофаги может занять до 2-х.
8. Быстро слить супернатант и слейте вниз на одноразовые салфетки. Протрите внутри трубки с стерильным ватным тампоном удалить избыток супернатант.
9. Делят 200-400 мкл холодной 1 x ТМ всей гранулы и Ресуспензируйте на ночь при 4 ° C; не встряхивания требуется.
   Примечание: Если гранулы не является чистым, мембраны, например, тягучий бит ДНК и т.д., бассейн и выполнить дополнительные центрифугирования в microcentrifuge на 17.000 x г.
10. За день до приготовления титры, подготовить культуры клеток хозяина E. coli в 10 мл LB роста СМИ и оставить в тряску инкубатора, равным 250 об/мин, 37 ° C ночь. Инкубировать соответствующее количество культуры пластин при 37 ° C для по крайней мере 1 час прежде чем титры акций ФАГ.
    Примечание: Количество пластин для инкубации зависит количество разведений акций Фаговые покрываемые: каждый уникальный разрежения Фаговые запасов требует двух пластин культуры (например, четыре различных разведениях Фаговые запасов требуют восемь культуры пластин).
11. Подготовить 100 мл Топ агар, добавив 2.5 g LB и 0,6 г bacto агар бутылка 100 мл. Растворяют твердые в деионизированной воде в объем 100 мл и автоклав. После автоклава, медленно инвертировать бутылку 6 - 8 раз для гомогенизации агар во всем решении. Поместите бутылку в ванну с водой 45 ° C на 15-20 минут, чтобы сбалансировать температуры .
12. Подготовить серийный разрежения Фаговые запасов с решением LB.
    1. Добавить 990 мкл фунтов до 10 мкл Фаговые сток для 100-кратного разбавления. Вортекс для гомогенизации. Для разбавления фактор 10, добавить 100 мкл акций Фаговые 900 мкл LB. Vortex для гомогенизации.
    2. Повторять выше серии разрежения, как столько раз, сколько необходимо для получения Счётное количество бляшек (10-100 бляшки).
       Примечание: Для достижения этой цели, разбавляют фага запас 2-3 порядка меньше ожидаемого Фаговые доходность с точки зрения реакции Фаговые/мл. Например, если запас особое ФАГ содержит 10 ¹¹ инфекционные Фаговые/мл, пластины Фаговые запасов на 10 ⁸-фолд или 10 ⁹-сложите разрежения.
13. Подготовить площадью для Фаговые титры, монтаж 14 мл культуры трубы (количество трубок культуры равно количество запасов разведений Фаговые покрываемые). Место разреженных Фаговые Фондовый Образцы из шага 2.12 и бактериальной клетки хозяина от шага 2.10 на льду
14. Подготовить основной микс, закупорить 5,25 мл Топ агар (шаг 2.11), 220 мкл разбавленный Фаговые образцы (шаг 2.12), и 50 мкл хост бактериальной клетки (шаг 2.10) к культуре 14 мл трубки. Крышка трубки культуры и вихрь на высокой скорости.
    1. Сохранить оставшиеся Фаговые решение на 4 ° C.
15. Получить две культуры пластины (шаг 2.10) из инкубатора 37 ° C. Добавьте 2,5 мл мастер смеси медленно в центр первой пластины (без пузырей). Осторожно поверните пластину вручную, чтобы равномерно распределить Мастер микс, так, что он охватывает всю культуру пластины. Повторите с второй пластины. Подождите 20 минут для обеспечения затвердевание верхней агар. Инкубировать пластин при 37 ° C для 4-7 ч.
16. Рассчитывать бляшек и определить концентрацию Фаговые для каждого образца, реакция.
    Примечание: Таблички будет отображаться как ясно круги 1-2 мм в непрозрачный ковер клеток хозяина. Смотрите Рисунок 1 для представителя результаты. Успешный Фаговые производства приведет к окончательной концентрации 10 ¹² -10 ¹³ Фаговые/мл.

3. Double-stranded экстракции ДНК генома

Примечание: разбавление, тряска, и центрифугирования шаги должны быть оптимизированы для разработки толстых, прочной белка пограничный слой между фенола и водной фаз. Это создает высокой чистоты геномов, которые свободны от белковых загрязнений. Первоначальный разрежения зависит окончательный Фаговые титр. Чрезвычайно высокий титр Фаговые складе (≥ 10 ¹³ Фаговые/мл) может понадобиться 10-20 раз разбавления до извлечения, в то время как низкий титр запасов (~ 10 ¹⁰ -10 ¹¹ Фаговые/мл) может потребоваться только 2 раза или нет. Если это трудно сформировать слой твердого протеина в последующих шагах или водной суспензией слишком липким удачным из-за высокой концентрации ДНК, рассмотрим выше разрежения Фаговые запасов для продолжения добычи. На любом этапе обработки генома, важно использовать широкий родила наконечники, когда закупорить любой водной фазы. Многие Фаговые геномов довольно большой и легко фрагментированных через пипетку стрижки. Кроме того, любой vortexing следует прямо избегать, поскольку это будет сильно наклонить геномы.

1. Разбавлять часть Фаговые акций от шага 2.9 до 400 мкл с 1 x ТМ буфера в свежий 1,5 мл.
2. Добавить равное количество Tris:Phenol:Chloroform разбавлением. Взбалтывают смесь осторожно на лабораторных рокер, или вручную, для 5 минут центрифуга результирующая эмульсии на 17.000 x g в настольная центрифуга для 5-10 мин
   Примечание: Собственный, белый белка слой на поверхности этапа основной фенол присутствует.
3. Удалить верхний водной фазе к новой пробке, стараясь не нарушить межфазной границы.
4. Повторите шаги 3.2-3.3 еще 2 раза для в общей сложности 3 извлечение фенола. Передать свежие трубки водной фазе и добавить равное количество КХКЛ ₃. Встряхните и центрифуги (шаг 3.2). Передача водный образец ДНК чистую пробирку.
5. Оценить объем очищенная ДНК. Добавление 0.4 объемов ацетат натрия 3 M (CH ₃ COONa) и 3 тома 95% этанола (EtOH). Место в морозильной камере-20 ° C для ночи осадков. Центрифуга на 17.000 x g в настольная центрифуга для 10-15 мин
   Примечание: Немедленно ДНК обезвоживает и становятся видимыми как массы в виде суспензии в трубку. Надлежащего результате гранулы белого и упакованном виде против нижней части трубки.
6. Снимите и выбросьте супернатант сцеживать или закупорить. Добавьте 500 мкл 70% EtOH и осторожно встряхивайте трубку до тех пор, пока гранулы плавает свободно от нижней части трубки. Центрифуги на 17.000 g x 5 мин удалить и сбросить EtOH, заботясь, чтобы не нарушить гранулы.
7. Повторить шаг 3,6. Воздух сухой гранула на benchtop за 30-60 мин добавьте 50 мкл ddH ₂ O пеллеты и инкубировать 1 час на RT или на ночь при 4 ° C до Ресуспензируйте. Определение концентрации ДНК, используя измерения поглощения на 280 nm.
   Примечание: Ожидаемые концентрации, 0.5-5 мкг/мкл, используя эту технику. Разделите общее геномной молекулярный вес для определения концентрации окончательный генома.

4. Ячейки бесплатные Фаговые реакции и ФАГ титр эксперимент

1. подготовить 25 g LB средний и 15 г bacto агар твердых, залейте 1 Л бутылку и Добавьте деионизированной воды до 1 л автоклава.
2. После стерилизации, инвертировать бутылку медленно 6 - 8 раз позаботиться, чтобы избежать образования пузырьков. Инверсия бутылка будет гомогенизировать агар твердой на протяжении 1 Л раствора. Поместите бутылку в ванну воды 58 ° C 20 минут перед подачей на культуры пластин.
3. После того, как температура раствора LB-агар достижение равновесного уровня, подготовить пламени рядом с культуры пластин для стерилизации окружающей среды возле плиты открытой культуры. Держите бутылку 1 Л на водяной бане, чтобы избежать затвердевания агар делая аликвоты. Добавьте 25 мл в 100 мм x 15 мм культуры плиту. 1 Л будет производить 40 культуры пластин.
4. Выделить одну плиту культуры и пусть затвердеть для по крайней мере 1 час на RT; эта пластинка будет использоваться для покрытия клетки хозяина. Пусть другие 39 культуры пластин затвердеть в течение 2 дней на RT. магазине на 4 ° C или немедленно использовать для изготовления титры.
5. Пластина клеток хозяина, мелирование соответствующие бактериальный штамм (например, хост B для T7) который хранился при температуре-80 ° C, на плиту LB-агар культуры. Полоса рядом с открытым огнем, чтобы избежать загрязнения окружающей среды. Инкубируйте на ночь на 37 ° C. Клетки хозяина имеют не антибиотикорезистентности, поэтому работает в стерильных условиях важно.
6. Реакции клеток свободный
   Примечание: Реакции свободных клеток TXTL состоят из 33% сырой E. coli экстракт (8,9-9,9 мг/мл белка) с другими 67% состоит из буфера и ФАГ генома реакции. Незрелая выдержка подготовлена как ранее описанных ^{15 , 16}. Условия окончательного реакции являются: белки 8,9-9,9 мг/мл (от сырой экстракт), 3-6 мм Mg глутамата, 40-100 мм K-глутаминовой кислоты, 2-4% PEG 8000, 3-4 мм каждой аминокислоты, подготовленных как описано ¹⁷ и энергии микс, описанного решения ранее ¹⁵, состоящий из 0,33-3.33 мм DTT, 50 HEPES, АТФ и ГТФ, 1,5 мм 0.9 мм CTP и UTP, 0,2 мг/мл tRNA, 0.26 мм CoA, 0,33 мм NAD, 0,75 мм лагерь, 0,068 мм folinic кислоты, спермидина 1 мм и 30 мм 3-PGA. Бактериофаги ДНК типа требуют генома концентрации 0,5-10 Нм и бактериофаги РНК типа требуют широкий спектр 50-150 Нм. Концентрации окончательной реакции являются уникальными для конкретного Фаговые синтезируется и будет падать в пределах диапазонов, описанных выше. Для оптимального оксигенации реакций окончательный реакции тома должно составлять 10-20 мкл. Есть небольшие вариации в протоколе реакции, которые зависят от формы геномной молекулы. Например линейный геном молекул требуется дополнительный компонент в реакции подавляют пищеварение линейной части ДНК в сырой экстракт ферментом recBCD.
   1. Полная " реакции детали " раздела в таблице 1 (PhageTXTL_JOVE), указав общее количество реакций и окончательный объем реакции.
   2. Дизайн эксперимент путем определения постоянных компонентов и переменных компонентов реакции. Введите процент дробных объем Мастер микс, который представляет собой отношение общего объема постоянной реакции компонентов продукта окончательной реакции объем и количество выборок. Введите фондовых и окончательный концентрации реагентов реакции в " Master Mix реакции рецепт " раздел в PhageTXTL_JOVE. Введите фондовых и окончательный концентрации переменной reagent(s) тестируемых.
      Примечание: Объемы реакции компонентов будут автоматически рассчитываться на основе объема основной микс и окончательный объем каждой индивидуальной реакции.
   3. Удалить необходимое количество трубок (указано в " трубы таять " раздел PhageTXTL_JOVE.xlsx) сырой сотовый экстракт, буфер энергобаланса и смеси аминокислот от-20 ° C или ° C-80 и оттепели на льду
      Примечание: После размораживания, объединить несколько аликвоты из как компоненты (при необходимости).
   4. Алиготе указывается объем сырой экстракт, 33% от объема окончательной реакции, в пробки microcentrifuge.
   5. Подготовить основной смеси согласно таблице 1. Гомогенизации всех компонентов под " Master Mix реакции рецепт " на vortexing. Добавьте соответствующий объем каждого компонента незрелая выдержка.
   6. Если работаете с Фаговые с линейной ДНК генома (например, T7), добавить 1 мкм Гам белка Бактериофаг лямбда реакции ¹¹. Вихрь однородный раствор, и место реакции на льду на 5 мин. Это тормозит пищеварение линейной части ДНК, recBCD комплекс, который эндогенного в сырой экстракт.
   7. После добавления последнего компонента согласно таблице 1, гомогенизировать реакции на vortexing. Разделение мастер смесь в n microcentrifuge трубок.
      Примечание: Объем каждого Сплит-продукт процент объема дробных мастер смесь и окончательный объем реакции. Например, процент объема дробные мастер смесь 90% и окончательной реакции объем 12 мкл, объем каждого Сплит-10,8 мкл.
   8. Добавить указанные объемы переменных компонентов в массив главный микс (см. таблицу 1). Добавьте воду каждой реакции, чтобы достичь объема требуемой окончательной реакции. Однородный каждой реакции на vortexing. Инкубировать microcentrifuge трубы на 29 ° C в течение по крайней мере 8 часов или на ночь.
7. Принимающей ячейки до культуры
   Примечание: ночь перед культура является разреженных прочитанных обеспечить клеток хозяина, используемые для эксперимента, титр в середине журнала фазе, что повышает эффективность инфекции. Середина журнала клетки затем повторно сосредоточены в 10 раз и хранится на льду.
   1. С помощью кончика стерильной пипеткой, прививать культуру трубки 5 мл LB с 3-5 здоровых принимающей ячейки колоний. Работа рядом с открытым огнем, чтобы избежать загрязнения.
   2. Инкубировать культуры трубку в тряску инкубатора при 37 ° C и 250 об/мин для 16 h или на ночь. Клетки могут достичь этапа насыщения на следующий день.
8. Принимающей ячейки культуры и образца подготовка к ФАГ титр
   1. обойтись 50 мл фунтов в колбу Эрленмейера 500 мл и крышка с алюминиевой фольгой. Теплый настой при 37 ° C 20 мин
   2. Аликвота 1 мл принимающей ночи до культуры клеток в подогретым инкубировать фунтов за 3-4 ч при 37 ° C и тряски на 250 об/мин.
   3. Центрифуга клеточной культуры принимающей 50 мл на 10 мин на 5000 x g. отбросить фунта
   4. Ресуспензируйте лепешка с холодной (4 ° C) 5 мл LB и держать на ДВС.
   5. За один час до начала эксперимента титр, инкубировать культуры пластин при 37 ° с.
      Примечание: Каждый уникальный Фаговые реакции (и соответствующий коэффициент разрежения) будет использовать две пластины. Кроме того, инкубировать 4 пластины для экспериментальных элементов управления (см. Рисунок 1 для представителя положительной и отрицательной контроля).
   6. Подготовить 100 мл Топ агар (шаг 2.11).
9. Подготовить серийный разрежения свободной ячейки реакции с LB решение, как описано в разделе 2.12.
10. Бактериофаг титр
    Примечание: Начинают пластины после культуры блюда инкубированы для по крайней мере 1 час и топ агар в водяной бане 45 ° C на 15-20 мин после удаления из автоклава.
    1. Титр окончательного свободной ячейки реакции LB решение, как описано в разделе 2, шаги 2.14-2.16.

Результаты

Мы покажем четыре представителя результаты. На рисунке 1, мы представляем набор негативных элементов управления для обеспечения, что клетки-TXTL системы и запасы ДНК фага не загрязнены живых клетках E. coli . Мы убедитесь, что клетки-TXTL системы является ...

Обсуждение

После технику в Чэнь, и др. ¹⁴ для ГФПК, критически важный шаг достигается при определении надлежащих условий для суперинфекции. Параметр, который наиболее близко контролирует штамм хост способность выдерживать суперинфекции часто является начальной концентрации зар?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ultracentrifugation tubes	Beckman Coulter	344057
Conical tubes	Falcon	352070
Gradient maker	BioComp Gradient Master	see Anal Biochem. 1985 Jul;148(1):254-9.
Syringe and Blunt Cannula	Monoject	8881513918 and 888202017
Wide-bore pipette tips	Fischerbrand	02-707-134
Plaque counter	New Brunswik Scientific	Colony Counter Model C-110
Culture tubes	Fischerbrand	14-961-33
Cell-free system	Mycroarray Inc	Mytxtl
BioComp Gradient Master	BioComp Instruments	Model 105ME
LB agar plate recipe			25 g/L Luria-Bertani medium (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents product number BP1426) and 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson and Company - product number 214010).