Synthese von infektiösen Bakteriophagen in einem E. Coli -basierte zellfreie Expressionssystems

Zusammenfassung

Eine neue Generation von zellfreien Transkription-Übersetzung Plattformen wurde entwickelt, um die biochemischen Systemen in Vitro durch die Ausführung des Gens Schaltungen aufbauen. In diesem Artikel beschreiben wir, wie aus ihrem Genom mit einem alle E. Coli zellfreie TXTL System Bakteriophagen MS2, ΦΧ174 und T7, synthetisiert werden.

Zusammenfassung

Eine neue Generation von zellfreien Transkription-Übersetzung (TXTL) Systeme, entwickelt, um eine größere Vielseitigkeit und Modularität, neuartige Funktionen zur Grundlagenforschung und der angewandte Wissenschaften in Reagenzglas Reaktionen führen zu bieten haben. Im letzten Jahrzehnt ist die zellfreie TXTL eine leistungsfähige Technik für eine Vielzahl von neuartigen multidisziplinäre Forschung Bereiche im Zusammenhang mit quantitativen und synthetische Biologie geworden. Die neue TXTL-Plattformen sind besonders nützlich, um zu konstruieren und biochemische Systemen durch die Ausführung von synthetischen oder natürlichen gen Schaltungen zu verhören. In-vitro- TXTL nachweislich schnell Prototyp regulatorische Elemente und biologischer Netzwerke sowie Zusammenfassend bequem molekulare Mechanismen Selbstmontage in lebenden Systemen gefunden. In diesem Artikel beschreiben wir wie infektiöse Bakteriophagen, z. B. MS2 (RNA), ΦΧ174 (SsDNA) und T7 (DsDNA), sind völlig von ihrem Genom im ein-Topf-Reaktionen mit allen Escherichia coli, zellfreie TXTL System synthetisiert. Synthese von den drei Coliphages wird mit dem Plaque-Assay quantifiziert. Wir zeigen, wie die Rendite der synthetisierten Phagen biochemische Reaktionen-Einstellungen abhängig ist. Molekulare Verdrängung durch eine kontrollierte Konzentration von PEG 8000 emuliert beeinflusst die Höhe des synthetisierten Phagen durch Aufträge von Größen. Wir beschreiben auch die Phagen zu verstärken und ihre Genome zu reinigen. Protokolle und Ergebnisse, die in dieser Arbeit sollten in zellfreien synthetische Biologie und Biotechnologie an multidisziplinären Forscher beteiligt werden.

Einleitung

Im letzten Jahrzehnt wurde die zellfreie Expression Technologie zur Adresse neuartige Anwendungen im aufstrebenden multidisziplinäre Forschung Bereiche im Zusammenhang mit synthetischen und quantitative Biologie entwickelt. Ursprünglich verwendet, um Proteine, die unabhängig von einem lebenden Organismus auszudrücken, wurden zellfreie TXTL Neuanlagen für beide Grundlagenforschung und der angewandten Wissenschaften^1,2, Erweiterung des Geltungsbereichs dieser Technologie deutlich entwickelt. Die neue Generation der TXTL Plattformen wurde entwickelt, um benutzerfreundlich, werden effizienter (bis 2 mg/mL der Proteinsynthese im Batch-Modus³), mehr auf der Ebene der Transkription⁴vielseitig und modulare damit problemlos integrieren Roman natürliche oder synthetische Funktionen, die die Möglichkeiten von vorhandenen biologischen Systemen^5,6. Insbesondere zellfreie TXTL Systeme für das rapid Prototyping von genetischen Programmen, wie regulatorische Elemente oder kleine genetische Schaltkreise^7,8,9, handlich geworden durch die Reduzierung der Design-Build-test Radeln Sie nach ein paar Tagen. Bemerkenswert ist, sind die neuen TXTL-Systeme verarbeiten große DNA-Programme wie die komplette Synthese von Coliphages^10,11, demonstrieren stark genug Leistung um die Rekonstitution der genomischen aktiv unterstützen Lebewesen DNA kodiert.

TXTL Systeme präsentieren viele technische Vorteile gegenüber traditionellen in-vitro- konstruktive biochemischen Assays. Zellfreie TXTL verbindet den Prozess der Genexpression bis zum fertigen Produkt in einem reduzierten und offenen Umfeld, im Gegensatz zu den komplexen Zytoplasma einer lebenden Zelle. TXTL verwendet DNA biochemischen Systemen in Vitrozu rekonstruieren, die ist mit modernen DNA Montagetechniken, bezahlbar und schnell neben nicht erfordern anspruchsvolle Protein Reinigungsschritte. Zellfreie Ausdruck bietet direkten Zugriff auf die meisten Komponenten in den biochemischen Reaktionen, wodurch eine tiefere Dissektion der molekularen Wechselwirkungen¹². In einer TXTL Reaktion kann man die biochemischen und biophysikalischen Einstellungen nach Belieben, ändern, fast unmöglich in einer lebenden Zelle. Angesichts dieser Vorteile und Verbesserungen, wird die TXTL-Technologie mehr und mehr populär als eine alternative Plattform für synthetische und quantitative Biologie. Während die Forschungsgemeinschaft mit TXTL rasant wächst und TXTL eine Standardtechnologie in Bioingenieurwesen wird, es ist wichtig zu verstehen, wie solche Plattformen um angemessene Praktiken im Zusammenhang mit der Ausführung der TXTL Reaktionen und zu entwickeln die Interpretation der Ergebnisse.

In diesem Artikel beschreiben wir wie ein alle E. Coli TXTL System verwenden, um in ein-Topf-Reaktionen, Bakteriophagen von ihrem Genom¹¹, z. B. MS2 zu synthetisieren (RNA, 3,4 kb), ΦΧ174 (SsDNA, 5,4 kb), und T7 (DsDNA, 40 kb). Wir zeigen, wie die Höhe der Phagen Änderungen in Bezug auf einige der biochemischen Einstellungen der Reaktionen (Magnesium und Kalium-Konzentrationen) synthetisiert. Molekulare drängen, durch eine Reihe von PEG 8000 Konzentrationen emuliert hat einen enormen Einfluss auf die Phagen Synthese über mehrere Größenordnungen. Die Realisierung solcher großen biochemische Systeme im einzelnen Reagenzglas Reaktionen, die gleichzeitig die Prozesse der Transkription, Übersetzung, rekapitulieren und Selbstmontage, ist interessant für grundlegende Fragen im Zusammenhang mit Biologie und Biophysik ¹⁰ (Genregulation, Self-assembly), sowie für die Entwicklung von Anwendungen, wie z. B. Umnutzung Phagen-Funktionen, um neue Nanostrukturen¹³bauen. Neben einem praktischen auf TXTL bieten wir Methoden für Phagen Verstärkung, Genom-Extraktion und Reinigung und Phagen Quantifizierung von Plaque-Assay. In diesem Manuskript vorgestellten Methoden eignen sich für Forscher, die mit E. Coli Extrakt basiert zellfreien Systemen und interessieren sich für Bakteriophagen.

In dieser Arbeit vorgestellten Protokolle können wie folgt zusammengefasst werden: (1) Phagen Verstärkung (Tag1: Inokulation vorzubereiten Zellen, Tag 2: einzelne Plaque, mehrere Phagen Wachstum und Konzentration und Tag 3: Reinigung des Phagen), 2) Double-Stranded Genom DNA-Extraktion (Phenol/Chloroform Extraktion), und 3) zellfreie Phagen Reaktion und Titer Experiment (Tag1: Platte Wirtszellen und machen Agarplatten, Tag 2: zellfreie Reaktion und Host cell Vorkultur und Tag 3: Host Zelle Kultur und Phage Titer).

Protokoll

Hinweis: die folgenden Verstärkung Schritte und Extraktionsmethode sind weitgehend verallgemeinerbare für viele doppelsträngigen DNA-Phagen, z. B. Bakteriophagen T7, Enterobakterien Phagen T4 oder Enterobakterien Phagen λ (L). Sie dienen überwiegend zum ein Phage, dessen Genom nicht verfügbar für den Kauf von kommerziellen Quellen ist.

1. Phagen Verstärkung

Hinweis: die Single-Plakette, Multi-Zyklus (SPMC) Phagen Produktionstechnik ist gut beschrieben für die T4-Phagen in Chen, Et Al. ¹⁴ der folgenden Phagen Verstärkung und DNA-Extraktions-Verfahren ist eine Verallgemeinerung für die Verwendung mit E. Coli doppelsträngigen DNA-Phagen, z.B., T7, T4 oder L. Der endgültige Erfolg des Protokolls hängt stark von der ausgewählten Gastfamilien Zelle Stamm ' s Fähigkeit, Superinfektion Bedingungen zu widerstehen. Wenn die Wirtszellen unter Superinfektion, instabil sind oder Superinfektion wird nie erreicht, und Lyse wird nie in dieser kritischen Phase erreicht, ist es am besten mit einem konfluierende Lyse Protokoll Vorgehen. Dazu gehören die Zelltrümmer durch High-Speed-Zentrifugation und Phagen Pelletierung Ultrazentrifugation Geschwindigkeiten zu trennen. Alle folgenden Bedingungen und Parameter sind als allgemeine Ausgangspunkt bestimmt. Die optimalen Bedingungen für einen lokalen Host-Zell-Linie abweichen; bestimmen und die entsprechenden Bedingungen einhalten.

1. Bereiten Inokulation Zellen
   1. impfen 10 mL Luria-Bertani (LB) Medien in einem 15 mL Kultur Rohr mit E. Coli Zellen, z. B. B oder K12.
   2. Platz in einem Boston-Shaker set 250 u/min und 37 ° C. lassen Sie über Nacht auf Sättigung anwachsen.
2. Single-Plakette, Multi-Zyklus Phagen Wachstum und Konzentration
   1. um einen Teller mit kompetenten Phagen Plaketten vorzubereiten, warm mehrere LB-Agar-Platten bei 37 ° C für 1 Stunde oder über Nacht.
   2. Bereiten Sie mehrere Verdünnungen von Phagen-Lager (z.B. T7, T4 oder L) bekannter Konzentration in LB Medien, mit dem Ziel für ~ 10 ²-10 ³ Phagen/mL.
   3. Über Nacht Wachstum von konzentrierten Wirtszellen auf jede Platte hinzufügen 100 µL.
   4. Wählen Sie Mengen an die vorbereiteten Phagen Verdünnungen, eine Reihe von 10-100 Phagen/Platte entspricht. Fügen Sie die gewünschte Lautstärke des Phagen Verdünnungen auf jede Platte (z.B., 100 µL 10 ³ Phagen/mL; Dies sollte ~ 100 Plaketten produzieren). Inkubieren Sie Platten bei 37 ° C und beginnen Sie eine Count-Up-Timer (+ 0 h). Inkubieren Sie für 4-5 h
   5. Bereiten 49 mL LB Medien in einer 250 mL Flasche und in rotary Shaker set 250 u/min und 37 ° c
   6. Bei + 2,5 h, verdünnte Zellen 50 X durch Zugabe von 1 mL der gesättigten Zellkultur aus Übernachtung Wachstum in eine vorgewärmte Kanne mit 49 mL LB-Medium. Sobald die Zellen Log Wachstum (+ 4-5 h) erreichen, Messen Extinktion bei 600 nm (OD ₆₀₀). Bestimmen Sie die Konzentration der Zellen mittels der Umwandlung OD ₆₀₀ von 1,0 = 8 x 10 ⁸ Zellen/mL.
   7. Verdünnt, 2 x 10 ⁷ Zellen/mL mit zusätzlichen LB Wachstumsmedium. Entfernen Sie die Agarplatte enthält die Phagen-Plaketten aus dem Inkubator. Sofort verwenden Sie zum Jahresende einen sterilen Pasteurpipette Kern und eine einzige Plaque zu entfernen. Schlag die Plaque in den verdünnten Zellen und Inkubation bei 37 ° C für weitere 2 h (+ 6-7 h).
   8. Test für volle Infektion durch 500 µL Probenahme in einem 1,5 mL-Tube, Hinzufügen von 10 µL Chloroform (KCHL ₃) und sofort vortexen mit hoher Geschwindigkeit. Beobachten Sie, ob die Lösung geklärt hat. Wenn Zellen vollständig infiziert sind, eine weitere 2 h (+ 8-9 h) inkubieren.
      Hinweis: Wenn die Zellen voll infiziert sind, sie werden schnell lösen (< 2 min) und die Lösung zu klären. Andere Ergebnisse gelten im Diskussion Abschnitt unten. Die Zellen werden superinfected aber werden nicht bis zu diesem Zeitpunkt aufzulösen. Lyse beginnt, die Zugabe von DNase und Ernte durch Zentrifugation muss beginnen sofort, Phagen Abbau zu verhindern.
   9. Zellen hinzufügen DNase 5 µg/mL und Zentrifuge bei 8.000 x g bei 4 ° C zu Pellets. Verwerfen Sie den überstand. Aufschwemmen, das Pellet in 10 mL von 1 X TRIS Magnesiumchlorid (TM) (50 mM Tris bei pH 7,8, 10 mM MgCl ₂) Puffer mit 5 µg/mL DNase. Fügen Sie 500 µL KCHL ₃ und Vortex mit hoher Geschwindigkeit auf die Zellen lysiert. Klären Sie durch Zentrifugation bei 12.000 x g für 10 min bei 4 ° C. Dekantieren der Überstand in ein 15 mL konische Rohr und bei 4 ° c

2. Reinigung des Phagen

Hinweis: Saccharose Reinigung ist weitgehend abhängig von der Größe der Phagen. Überlegungen für die Masse des Phagen isoliert werden müssen getroffen werden und Anpassungen an Gradientenbedingungen durchgeführt. Endgültige virale Titer von mehr als 10 ¹³ Phagen/mL sind mit dieser Methode leicht erreicht werden können.

1. 12 mL von 5 % und 45 % w/V Saccharose in 1 x TM Puffer vorzubereiten.
2. Vorbereitung 4 x 5-45 % Saccharose Steigungen von 45 % Saccharose in 4 Ultrazentrifugen Röhrchen pipettieren 2,5 mL. Top mit ~ 2,6 mL 5 % Saccharose, stoppen, wenn Flüssigkeit 2 mm vom Rand des Rohres erreicht.
   Hinweis: Setzen Sie die Pipettenspitze in Kontakt mit der Oberfläche der Saccharoselösung und verzichten Sie sehr langsam Flüssigkeit zu. Die leichtere Saccharoselösung wird schwerer, oben auf Schwimmen bildet eine deutliche Grenze. Haben eine richtig mehrschichtige Lösung ~ 1 mm Schnittstelle, wenn gegen Hintergrundlicht gehalten.
3. Mischen die Gradienten durch Steuerführungsrohr Rotation mit einem Farbverlauf bilden Instrument für 43 s bei 86° bei 23 u/min. Wenn nicht sofort benötigt, mit Paraffin Film abdecken und Lagerung bei 4 ° c
4. Entfernen Sie 500 µL aus der Spitze eines jeden vorbereitet Saccharose Farbverlauf mit 1 mL Pipette und Gleichgewicht innerhalb ± 0,002 g.
5. Pool-Phagen-Suspensionen aus allen Rohren (Schritt 1.2.9). Fügen Sie mithilfe einer 1-mL-Pipette 500 µL der Suspension die Spitze mit flüssigen Oberfläche in Kontakt zu bringen und sehr langsam die Lautstärke auf den oberen Teil der Saccharose Farbverlauf, dabei darauf achten, nicht durch schnelle Pipettieren mischen. Zentrifuge bei 70.000 x g für 20 min bei 4 ° c
   Hinweis: Balance bereiten Steigungen zu innerhalb ± 0,002 g. kleiner Phagen können dauern bis zu 1 h
6. Die Phagen-Bänder mit einem sterile Spritze und stumpfen Kanüle entfernen.
   Hinweis: Von der Seite betrachtet, die Phagen-Band werden dick und milchig im Vergleich zu der Umgebung, ca. 5 mm in der Höhe, und halbem Weg nach unten die Zentrifugenröhrchen gelegen.
   1. Submerge einer stumpfen Kanüle in die Lösung, bis die Spitze an der Oberkante der Phagen Band zentriert ist. Entfernen Sie das Band durch Rückgriff auf den Spritzenkolben, bis die Mehrheit der Phagen Band entfernt worden ist.
7. 3-4 Ultrazentrifugen Röhren der Saccharose-Volumen mit abgehängten Phagen hinzufügen. Fügen Sie nicht mehr als 1,5 mL/Tube. Füllung auf ~ 3-4 mm von der Spitze des Rohres mit Kälte 1 x TM. Cover mit Paraffin Film und kehren Sie um zu mischen. Bereits in einer Ultrazentrifuge und Spin bei 145.000 x g für 1 h bei 4 ° C zu Pellets. Kleinere Phagen dauert bis zu 2 h.
8. Schnell überstand abgießen und abtropfen auf den Kopf gestellt auf Einwegtücher. Wischen Sie die Innenseite des Rohres mit sterilen Wattestäbchen entfernen überschüssige überstand.
9. Teilen 200-400 µL kalt 1 X TM in allen pellets und erneut über Nacht bei 4 ° C; kein Schütteln ist erforderlich.
   Hinweis: Wenn die Pellets nicht sauber ist, z. B. strähnig Bits der Membran, DNS, etc., zu bündeln und führen Sie zusätzliche Zentrifugation in einem Microcentrifuge auf 17.000 x g.
10. Am Vortag machen Titer, bereiten eine Kultur von E. Coli Wirtszellen in 10 mL LB Wachstumsmedien und verlassen in einem schütteln Inkubator legen auf 250 u/min und 37 ° C über Nacht. Inkubieren Sie die entsprechende Menge an Kultur-Platten bei 37 ° C für mindestens 1 h vor Titer von Phagen Lager.
    Hinweis: Die Anzahl der Platten zu inkubieren hängt von der Anzahl der Verdünnungen von Phagen Material, das beschichtet werden: jede einzigartige Verdünnung des Phagen Lager erfordert zwei Kultur Platten (z.B. vier verschiedene Verdünnungen des Phagen Lager erfordern acht Kultur-Platten).
11. 100 mL obere Agar durch Hinzufügen von 2,5 g LB und 0,6 g Bacto-Agar, eine 100-mL-Flasche vorbereiten. Lösen sich die Feststoffe in entionisiertem Wasser in einem Volumen von 100 mL und Autoklaven. Nach Autoklav, langsam invertieren die Flasche 6 - 8 Mal auf das Agar in der Lösung zu homogenisieren. Stellen Sie die Flasche im Wasserbad 45 ° C für 15-20 min, um die Temperatur . equilibrate
12. Serielle Verdünnung der Phagen Bestände mit der LB-Lösung vorbereiten.
    1. Hinzufügen 990 µL LB bis 10 µL Phagen Lager für eine 100-fold Verdünnung. Wirbel zu homogenisieren. Ein Verdünnungsfaktor von 10, 100 µL des Phagen Bestand hinzufügen 900 µL lb Vortex zu homogenisieren.
    2. Wiederholen Sie die oben genannten Verdünnungsreihen so oft wie erforderlich, um eine zählbare Anzahl von Plaques (10-100-Plaketten).
       Hinweis: Um dies zu erreichen, verdünnen Sie die Phagen-Lager 2-3 Größenordnungen weniger als die erwarteten Phagen-Rendite in Bezug auf die Phagen/mL Reaktion. Beispielsweise wenn eine bestimmte Phagen-Aktie 10 ¹¹ infektiöse Phagen/mL enthält, Platte die Phagen-Aktie bei einem 10 ⁸-Falte oder 10 ⁹-Falten Verdünnung.
13. Phage Titer eine Fläche vorbereiten, durch den Zusammenbau 14 mL Kultur Röhren (Anzahl der Kultur Röhrchen entspricht der Anzahl der Phagen Lager Verdünnungen, vergoldet sein). Legen Sie die verdünnte Phagen Lager Proben aus Schritt 2.12 und bakterielle Wirtszellen aus Schritt 2.10 auf Ice
14. Bereiten Sie einen master-Mix durch Pipettieren 5,25 mL obere Agar (Schritt 2.11), 220 µL verdünnt Phagen Proben (Schritt 2.12) und 50 µL bakterielle Wirtszellen (Schritt 2.10) zu einer Kultur 14 mL tube. Cap der Kultur Rohr und Strudel mit hoher Geschwindigkeit.
    1. Lagerung die restlichen Phagen-Lösung bei 4 ° c
15. Zwei Kultur Platten (Schritt 2.10) von 37 ° C Inkubator abrufen. Fügen Sie 2,5 mL des master-Mix langsam in die Mitte der ersten Platte (ohne Bläschen). Drehen Sie behutsam die Platte von hand, um den master-Mix gleichmäßig zu verteilen, so dass es erstreckt sich über die gesamte Kultur-Platte. Mit der zweiten Platte zu wiederholen. Warten Sie 20 Minuten zur Verfestigung der obere Agar zu gewährleisten. Inkubieren Platten bei 37 ° C für 4-7 h
16. Zählen die Plaques und bestimmen die Phagen-Konzentration für jede Reaktion Probe.
    Hinweis: Plaques erscheint als 1-2 mm klar Kreise in den undurchsichtigen Teppich von Wirtszellen. Siehe Abbildung 1 für repräsentative Ergebnisse. Eine erfolgreiche Phagen-Produktion führt Endkonzentrationen von 10-¹² -10 ¹³ Phagen/mL.

3. Doppelsträngige DNA-Extraktion Genom

Hinweis: Verdünnung, schütteln, und Zentrifugation Schritte müssen optimiert werden, um eine dicke, solide Protein Grenzschicht zwischen Phenol und wässrigen Phasen zu entwickeln. Dies erzeugt die höchste Reinheit-Genome, die frei von Protein Verunreinigungen sind. Die anfängliche Verdünnung ist abhängig von der endgültigen Phage Titer. Eine extrem hohe Titer-Phagen-Lager (≥ 10 ¹³ Phagen/mL) können eine 10-20-fache Verdünnung vor der Extraktion, brauchen, während niedrige Titer Bestände (~ 10 ¹⁰ -10 ¹¹ Phagen/mL) nur müssen eine 2-fold oder gar nicht. Sollten Sie es ist schwierig, eine solide Protein-Schicht in den nachfolgenden Schritten zu bilden oder die wässrige Suspension ist zu klebrig, aufgrund der hohen Konzentration der DNA durchführbar sein, eine stärkere Verdünnung des Phagen Aktien bevor Sie fortfahren Extraktion. Während jedem Schritt Genom-Handling ist es wichtig, weite Bohrung Pipettenspitzen zu verwenden, wenn irgendwelche Pipettieren wässrigen Phasen. Viele Phagen Genome sind recht groß und leicht fragmentiert durch Pipette zu scheren. Darüber hinaus jede vortexen ausdrücklich vermieden werden da dies stark die Genome Scheren wird.

1. Verdünnen ein teils Phagen Aktien aus Schritt 2,9 bis 400 µL 1 x TM-Puffer in einem frischen 1,5 mL-Tube.
2. Fügen Sie ein gleiches Volumen des Tris:Phenol:Chloroform zur Verdünnung. Schütteln Sie die Mischung sanft auf einem Labor-Rocker oder von Hand, für 5 min. Zentrifugieren Sie die resultierende Emulsion bei 17.000 x g in einer Benchtop-Zentrifuge für 5-10 min.
   Hinweis: Eine deutliche, weiße Protein-Schicht auf der Oberfläche der zugrunde liegenden Phenol Phase vorliegt.
3. Entfernen die oberen wässrige Phase zu einem neuen Schlauch kümmert sich nicht um die Interphase Grenze stören.
4. Schritte 3.2-3.3 eine zusätzliche 2 Mal wiederholen, für eine Gesamtmenge von 3 Phenol-Extraktionen. Übertragen der wässrigen Phase zu einem frischen Schlauch und fügen Sie ein gleiches Volumen des KCHL ₃. Schütteln Sie und Zentrifugieren Sie (Schritt 3.2). Übertragen Sie die wässrige DNA-Probe auf ein sauberes Röhrchen.
5. Schätzen das Volumen der gereinigte DNA. Hinzufügen von 3 M Natriumacetat (CH ₃ COONa) 0,4 und 3 Volumina von 95 % Ethanol (EtOH). Legen Sie in-20 ° C-Gefrierschrank für Übernachtung Niederschlag. Zentrifuge bei 17.000 x g in einer Benchtop-Zentrifuge für 10-15 min.
   Hinweis: Die DNA wird sofort zu entwässern und sichtbar als Masse in der Suspension in der Röhre. Das richtige resultierende Pellet ist weiß und gut verpackt gegen den Boden des Röhrchens.
6. Entfernen und entsorgen den Überstand durch Dekantieren oder pipettieren. Hinzufügen 500 µL 70 % EtOH und das Rohr vorsichtig schütteln, bis das Pellet frei von der Unterseite des Schlauches schwimmt. Zentrifugieren bei 17.000 x g für 5 min. entfernen und entsorgen Sie EtOH, kümmert sich um das Diabolo nicht zu stören.
7. Wiederholen Schritt 3.6. Luft trocknen das Pellet auf Tischgerät für 30-60 min. hinzufügen 50 µL DdH ₂ O zum Pellet und 1 h bei RT inkubieren oder über Nacht bei 4 ° C zu Aufschwemmen. Bestimmen der DNA-Konzentration mit Hilfe von Absorptionsmessungen bei 280 nm.
   Hinweis: Die erwarteten Konzentrationen sind 0,5 bis 5 µg/µL mit dieser Technik. Dividieren durch das total genomische Molekulargewicht die endgültige Genom-Konzentration bestimmt.

4. Zellfreie Phagen Reaktion und Phage Titer Experiment

1. 25 g LB-Medium und 15 g Bacto-Agar fest vorbereiten, in eine 1 L Flasche gießen und 1 L. Autoklaven deionisiertes Wasser hinzufügen.
2. Nach Sterilisation, invertieren die Flasche langsam 6 - 8 Mal die Pflege um Blasenbildung zu vermeiden. Die Flasche Inversion wird die Agar-Solid in die 1 L-Lösung homogenisieren. Stellen Sie die Flasche im Wasserbad 58 ° C für 20 min vor der Abgabe auf Kultur Teller.
3. Sobald die Temperatur der LB-Agar-Lösung equilibriert hat, bereiten Sie eine Flamme neben den Kultur-Platten um die Umwelt in der Nähe von die offene Kultur Platten zu sterilisieren. Halten Sie die 1 L Flasche im Wasserbad, Erstarrung der Agar bei der Herstellung der Aliquote zu vermeiden. Fügen Sie 25 mL in einen 100 mm x 15 mm-Kultur-Teller. 1 L 40 Kultur Platten produzieren werden.
4. Kultur Teller beiseite und lassen Sie für mindestens 1 h bei RT zu festigen, diese Platte für Beschichtung der Wirtszellen verwendet werden. Lassen Sie die anderen 39 Kultur Platten für 2 Tage bei RT Store bei 4 ° C zu festigen oder sofort verwenden für die Herstellung von Titer.
5. Platte die Wirtszellen durch ausstreichen der entsprechenden Bakterienstamm (z. B. host B für T7), wurde bei-80 ° C auf LB-Agar-Kultur-Platte gespeichert. Streifen neben einer offenen Flamme zu einer Kontamination der Umwelt zu vermeiden. Über Nacht bei 37 ° c inkubieren Die Wirtszellen haben keine Antibiotika-Resistenz, so arbeiten in einer sterilen Umgebung unerlässlich.
6. Zellfreie Reaktion
   Hinweis: Die zellfreie TXTL Reaktionen bestehen aus 33 % Rohöl E. Coli extrahieren (8,9-9,9 mg/mL Protein) die restlichen 67 % bestehend aus Reaktion Puffer und Phagen Genom. Die rohe-Extrakt ist wie zuvor beschrieben ^{15 , 16} bereit. Endgültige Reaktionsbedingungen sind: 8,9-9,9 mg/mL Protein (aus Rohöl Extrakt), 3-6 mM Mg-Glutamat, 40-100 mM K-Glutamat, 2-4 % PEG 8000, 3-4 mM der einzelnen Aminosäuren, als zuvor beschriebenen ¹⁷ und eine Mischung Energielösung beschrieben vorbereitet bisher ¹⁵, bestehend aus 0,33-3,33 mM DVB-t, 50 mM HEPES, 1,5 mM ATP und GTP, 0,9 mM CTP und UTP, 0,2 mg/mL tRNA, 0,26 mM CoA 0,33 mM NAD, 0,75 mM Lager, 0,068 mM Folinic Acid, Spermidine 1 mM und 30 mM 3-PGA. DNA-Art Phagen erfordern Genom Konzentrationen von 0,5 bis 10 nM und RNA-Art Phagen erfordern eine Palette von 50-150 nM. Letzte Reaktion Konzentrationen sind einzigartig, das bestimmtes Bakterium synthetisiert und werden innerhalb der oben beschriebenen Bereiche fallen. Für optimale Sauerstoffversorgung der Reaktionen sollte die letzte Reaktion Volumen zwischen 10-20 µL. Es gibt kleine Abweichungen in der Reaktion-Protokoll, die Form von genomischen Molekül abhängen. Beispielsweise erfordern lineare Genom Moleküle eine zusätzliche Komponente in der Reaktion auf die Verdauung von linearen DNA-Stücke durch das RecBCD-Enzym, die in der rohen Extrakt hemmen.
   1. Complete die " Reaktion Details " Abschnitt in Tabelle 1 (PhageTXTL_JOVE) indem Sie die Gesamtzahl der Reaktionen und letzte Band der Reaktion.
   2. Design des Experiments durch die Bestimmung der konstanten Komponenten und Variable Bestandteile der Reaktion. Geben Sie die gebrochene Volumenanteil von master-Mix, also das Verhältnis des Gesamtvolumens der konstanten Reaktionskomponenten, das Produkt der letzten Reaktionsvolumen und Anzahl der Proben. Geben Sie den Bestand und die Endkonzentrationen der Reaktion Reagenzien in die " Mix Reaktion Planungsrezept " Abschnitt in PhageTXTL_JOVE. Geben Sie die Lager und Endkonzentrationen von der Variable Reagent(s) getestet werden.
      Hinweis: Die Bände der Reaktionskomponenten werden automatisch berechnet basierend auf der master-Mix-Volumen und der letzte Band der jede einzelne Reaktion.
   3. Entfernen Sie die notwendige Menge an Rohren (angegeben der " Röhren zu tauen " Abschnitt des PhageTXTL_JOVE.xlsx) des groben Zelle extrahieren, Puffer Energiemix und Aminosäure-Mix von-20 ° C oder-80 ° C und Tauwetter auf Ice
      Hinweis: Einmal aufgetaut, kombinieren mehrere Aliquote des wie Komponenten (falls erforderlich).
   4. Aliquot das angegebene Volumen von Rohöl zu extrahieren, 33 % des endgültigen Reaktion, zu einem Microcentrifuge Schlauch.
   5. Vorbereitung der master-Mix gemäß Tabelle 1. Homogenisieren alle Komponenten unter " Master Mix Reaktion Rezept " durch aufschütteln. Die Rohöl-Extrakt das entsprechende Volumen der einzelnen Komponenten hinzufügen.
   6. Hinzufügen, wenn arbeiten mit einem Phagen mit linearen DNA-Genom (z. B. T7), 1 µM Gam des Bakteriophagen Lambda-Proteins der Reaktion ¹¹. Wirbel um die Lösung zu homogenisieren, und die Reaktion für 5 min auf Eis legen. Dies hemmt die Verdauung der linearen DNA-Stücke durch die RecBCD Komplex, die endogene im Rohöl Extrakt ist.
   7. Nach dem Hinzufügen der letzten Komponente gemäß Tabelle 1, Homogenisieren die Reaktion durch aufschütteln. Teilen den master-Mix in n Mikrozentrifugenröhrchen.
      Hinweis: Die Lautstärke der einzelnen Split ist das Produkt aus der Volumenanteil gebrochene master-Mix und der letzte Band der Reaktion. Das Volumen der einzelnen Split ist beispielsweise für eine gebrochene master-Mix Volumenanteil von 90 % und die endgültige Reaktionsvolumen von 12 µL, 10,8 µL.
   8. Fügen Sie die angegebenen Mengen der Variablen Bauteile auf das master-Mix-Array (siehe Tabelle 1). Jede Reaktion auf die gewünschte endgültige Reaktionsvolumen erreichen fügen Sie Wasser hinzu. Jede Reaktion durch Vortexen zu homogenisieren. Mikrozentrifugenröhrchen bei 29 ° C für mindestens 8 Stunden oder über Nacht inkubieren.
7. Host Pre-Zellkultur
   Hinweis: die Übernachtung Vorkultur ist verdünnter 50: 1, um sicherzustellen, dass die Wirtszellen verwendet für die Titer-Experiment in der Mitte des Log-Phase der Infektion Effizienzsteigerungen. Die Mid Log-Zellen sind dann wieder durch 10-fach konzentriert und gespeichert auf dem Eis.
   1. Mit einem sterilen Pipettenspitze impfen eine Kultur Tube 5 mL LB mit 3-5 gesunde Host Zelle Kolonien. Arbeit neben einer offenen Flamme, um Verunreinigungen zu vermeiden.
   2. Inkubieren die Kultur-Röhre in einem schütteln Inkubator bei 37 ° C und 250 u/min 16 h oder über Nacht. Zellen können Sättigung Phase bis zum nächsten Tag zu erreichen.
8. Host Zelle Kultur und Probe Vorbereitung Phage Titer
   1. 50 mL LB in einen 500-mL-Erlenmeyerkolben und bedecken mit Alu-Folie zu verzichten. Den Kolben bei 37 ° C für 20 min. warm
   2. Aliquoten 1 mL der Host über Nacht vor Zellkultur in die vorgewärmte lb inkubieren 3-4 h bei 37 ° C und schütteln bei 250 u/min.
   3. Zentrifuge die 50 mL-Host-Zellkultur für 10 min bei 5.000 x g. verwerfen die LB
   4. Aufschwemmen der Pellet mit kalt (4 ° C) 5 mL LB und halten auf dem Eis.
   5. Eine Stunde vor Beginn der Titer-Experiment, brüten die Kultur-Platten bei 37 ° c
      Hinweis: Jede einzigartige Phagen Reaktion (und entsprechenden Verdünnungsfaktor) werden zwei Platten nutzen. Darüber hinaus 4 Platten für experimentelle Kontrollen (siehe Abbildung 1 für repräsentative positive und negative Kontrollen) inkubieren.
   6. Vorbereiten 100 mL Top Agar (Schritt 2.11).
9. Eine serielle Verdünnung der zellfreien Reaktion mit LB Lösung vorbereiten, wie beschrieben in Abschnitt 2.12.
10. Phage Titer
    Hinweis: Beginnen Sie, Platte nach Kultur Gerichte für mindestens 1 h inkubiert haben und die obere Agar im Wasserbad 45 ° C für 15-20 min nach der Entnahme aus dem Autoklaven war.
    1. Titer der endgültigen zellfreie Reaktion-LB wie in Abschnitt 2 beschriebenen Lösungsschritte 2.14-2.16.

Ergebnisse

Wir zeigen vier repräsentative Ergebnisse. In Abbildung 1, präsentieren wir eine Reihe von negativen Kontrollen sicherstellen, dass das zellfreie TXTL-System und die Phagen-DNA-Bestände nicht mit lebenden kontaminiert sind E. Coli Zellen. Wir überprüfen, dass das zellfreie TXTL System intakt E. Coli ist Zell-Kontamination durch Ausplattieren beide ein nicht inkubiert und inkubierten Reaktionslösung leer von genomischer DNA (

Diskussion

Nach der Technik in Chen, Et Al. ¹⁴ für SPMC ist ein wichtiger Schritt erreicht, wenn die richtigen Bedingungen für Superinfektion zu bestimmen. Der Parameter, der am ehesten ein Host Stamm Fähigkeit steuert, Superinfektion zu widerstehen ist häufig der Ausgangskonzentration des infizierenden Phagen. Die Wirtszellen muss logarithmischen Wachstumsphase vor Erstinfektion mit einer sehr kleinen Menge von Phagen. Schließlich die Phagen werden auch logarithmische Wachstum erreichen und da...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ultracentrifugation tubes	Beckman Coulter	344057
Conical tubes	Falcon	352070
Gradient maker	BioComp Gradient Master	see Anal Biochem. 1985 Jul;148(1):254-9.
Syringe and Blunt Cannula	Monoject	8881513918 and 888202017
Wide-bore pipette tips	Fischerbrand	02-707-134
Plaque counter	New Brunswik Scientific	Colony Counter Model C-110
Culture tubes	Fischerbrand	14-961-33
Cell-free system	Mycroarray Inc	Mytxtl
BioComp Gradient Master	BioComp Instruments	Model 105ME
LB agar plate recipe			25 g/L Luria-Bertani medium (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents product number BP1426) and 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson and Company - product number 214010).