JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

דור חדש של פלטפורמות תרגום תמלול חופשי תא תוכנן לבנות מערכות ביוכימיות במבחנה באמצעות הביצוע של ג'ין מעגלים. במאמר זה, אנו מתארים איך הם bacteriophages, כגון MS2, ΦΧ174 ו- T7, מסונתז מן הגנום שלהם באמצעות e. coli כל ללא תא TXTL המערכת.

Abstract

דור חדש של מערכות ללא תא תמלול-תרגום (TXTL), מתוכנן יש רב-תכליתיות גדולה יותר, מודולריות, לספק יכולות הרומן לבצע מדעי בסיסי ויישומי בתגובות מבחנה. בעשור האחרון, ללא תא TXTL הפך טכניקה חזקה עבור מגוון רחב של מחקר רב תחומי חדשניים בתחומים הקשורים כמותיים וסינתטיים ביולוגיה. פלטפורמות חדשות TXTL שימושיים בעיקר לבנות ולחקור מערכות הביוכימי דרך הביצוע של מעגלים ג'ין סינטטי או טבעי. במבחנה TXTL הוכיחה נוח במהירות רכיבי רגולטוריות אב-טיפוס, רשתות ביולוגיות כמו גם באשר לסכם מולקולרית הרכבה עצמית מנגנונים נמצאו במערכות החיים. במאמר זה, אנו מתארים איך זיהומיות bacteriophages, כגון MS2 (RNA), ΦΧ174 (ssDNA), ו- T7 (dsDNA), הם לגמרי מסונתז מן הגנום שלהם בתגובות סיר אחד באמצעות של Escherichia coliכל, ללא תאים של מערכת TXTL. סינתזה של coliphages שלושה זה לכמת באמצעות וזמינותו פלאק. אנו מראים איך התשואה של phage מסונתז תלוי בהגדרות הביוכימי של התגובות. הצפיפות המולקולרית, מדומה דרך ריכוז מבוקר של פג 8000, משפיעה על כמות phages מסונתז על ידי הוראותיו של מגניטודות. אנו נסביר גם כיצד להגביר את phages ואיך לטהר את הגנום שלהם. קבוצת פרוטוקולים ותוצאות הציג בעבודה זו צריך להיות עניין רב תחומיים החוקרים המעורבים ב ביולוגיה סינתטית ללא תא וב בביו-הנדסה.

Introduction

בעשור האחרון, הטכנולוגיה ביטוי נטולת תא מהונדס כתובת יישומים חדשניים בביולוגיה הקשור סינטתיים, כמותיים אזורי מחקר רב-תחומיים מתהווה. השתמשו במקור לבטא חלבונים עצמאית של אורגניזם חי, מערכות TXTL נטול תאים חדשים פותחו שני מדעי בסיסי ויישומי1,2, מרחיבה משמעותית את ההיקף בטכנולוגיה זו. הדור החדש של פלטפורמות TXTL תוכנן להיות ידידותי למשתמש, יעיל יותר (בדרך להשגת 2 מ"ג/מ"ל של סינתזת חלבונים אצווה מצב3), יותר ברמה של שעתוק4, ועם זאת מודולרי על מנת לשלב בקלות הרומן טבעי או פונקציות סינתטי להרחיב את היכולות של מערכות ביולוגיות קיימות5,6. בפרט, ללא תא TXTL מערכות הפכו להיות שימושי עבור שטנץ מהירה של תוכניות גנטי, כגון גורמים רגולטוריים או המעגלים גנטי קטן7,8,9, על-ידי הפחתת העיצוב-לבנות-המבחן מחזור מספר ימים. למרבה הפלא, המערכות TXTL חדש גם הם מסוגלים עיבוד תוכניות דנ א גדולים כגון הסינתזה מלאה של coliphages10,11, הוכחת חזקה מספיק הופעות כדי לתמוך את בנייתו מחדש של פעיל גנומית ה-DNA מקודד ישויות החיים.

TXTL מערכות להציג יתרונות טכניים רבים לעומת המסורתי במבחנה בונה הביוכימי מבחני. ללא תא TXTL מקשר את התהליך של ביטוי גנים המוצר הסופי בסביבה מופחתת ופתוח, בניגוד הציטופלסמה מורכבת של תא חי. TXTL משתמש דנ א כדי לשחזר מערכות ביוכימיות במבחנה, באמצעות טכניקות מודרניות של מכלול ה-DNA, וזה, במחיר נוח, מהיר בנוסף לדרישה לא בררן חלבון טיהור צעדים. תא ללא ביטוי מספקת גישה ישירה אל רוב הרכיבים השונים תגובות ביוכימיות, ובכך מאפשר ניתוח עמוק יותר אינטראקציות מולקולרית12. בתגובה TXTL, אחד באפשרותך לשנות את ההגדרות הביוכימי, ביופיזיקלי כרצונו, שבו כמעט בלתי אפשרי בתא החי. לאור יתרונות ושיפורים אחרונים אלה, הטכנולוגיה TXTL הופכת לפופולרית יותר ויותר כמו פלטפורמה חלופי עבור ביולוגיה סינתטית ולא כמותית. בעוד קהילת המחקר באמצעות TXTL מתפתחת במהירות, TXTL הופך להיות טכנולוגיה סטנדרטית בביו-הנדסה, זה חיוני כדי להבין כיצד משתמשים כזה פלטפורמות כדי לפתח נאותה שהיו קשורים ההוצאה להורג של תגובות TXTL ולחוות פרשנות של התוצאות.

במאמר זה, אנו מסבירים כיצד להשתמש במערכת TXTL כל של החיידק לסנתז, בתגובות סיר אחד, bacteriophages מ שלהם הגנום11, כגון MS2 (RNA, 3.4 kb), ΦΧ174 (ssDNA, 5.4 kb), ו- T7 (dsDNA, 40 kb). אנו מראים איך כמות phages מסונתז שינויים ביחס כמה הגדרות הביוכימי של התגובות (ריכוזים מגנזיום ואשלגן). הצפיפות המולקולרית, מדומה דרך ריכוזים טווח של פג 8000, יש השפעה דרמטית על סינתזה phage במספר סדרי גודל. מימוש מערכות הביוכימי גדולים כאלה בתגובות מבחנה אחת אשר מסכם את הדברים במקביל את התהליכים של תמלול, תרגום, הרכבה עצמית, מעניין למיעון שאלות בסיסיות הקשורות לביולוגיה וביופיזיקה 10 (הכונה הרכבה עצמית), כמו גם עבור פיתוח יישומים, כגון שינוי פונקציות phage לבנות nanostructures חדש13. בנוסף מעשית על TXTL, אנו מספקים שיטות phage הגברה, חילוץ הגנום, טיהור של כימות phage מאת וזמינותו פלאק. השיטות שהוצגו בכתב היד מתאימים לחוקרים להשתמש במערכות ללא תא תמצית מבוסס e. coli , מעוניינים bacteriophages.

הפרוטוקולים הציג בעבודה זו ניתן לסכם כדלקמן: 1) Phage הגברה (יום 1: להכין חיסון תאי, יום 2: יחיד פלאק, מרובים phage צמיחה, ואת לריכוז יום 3: טיהור של phage), 2) מיצוי DNA הגנום גדילי כפול (פנול/כלורופורם מיצוי), ו-3) ללא תא התגובה phage וניסוי כייל נוגדנים (יום 1: צלחת התאים המארחים ולעשות פלטות אגר, יום 2: התגובה ללא תא ומנחה תא תרבות קדם, ו יום 3: מארח תא phage ותרבות כייל נוגדנים).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: השלבים הבאים הגברה ושיטת מיצוי הם במידה רבה להכליל עבור רבים כפול גדילי DNA phage, למשל, bacteriophage T7, אנטרובקטריופאג phage T4 או אנטרובקטריופאג phage λ (L). הם משמשים בעיקר phage הגנום שלו אינה זמינה לרכישה ממקורות מסחריים.

1. הגברה phage

הערה: הטכניקה הייצור phage (SPMC) יחיד-פלאק, מחזור רב מתואר היטב עבור phage T4 חן, et al. 14 הבאים phage הגברה ו- DNA שיטת החילוץ הוא הכללה לשימוש עם e. coli כפול גדילי DNA phages, למשל, T7, T4 או ל' ההצלחה האולטימטיבי של הפרוטוקול בכבדות תלויה במתח התא המארח שנבחר ' s היכולת לעמוד בתנאים superinfection. אם התאים מארח לא יציבים תחת superinfection, או superinfection היא לא הגיעה, פירוק לא הגיעה במהלך שלב קריטי זה, עדיף להמשיך עם פרוטוקול פירוק confluent. זה כולל הפרדת ההריסות הסלולר באמצעות צנטריפוגה במהירות גבוהה, phage pelleting במהירויות ultracentrifugation. כל התנאים הבאים ואת הפרמטרים מיועדים כנקודת התחלה כללי. התנאים האופטימליים עבור קו תא מארח מקומי עשוי להיות שונה; לקבוע, לדבוק התנאים המתאימים.

  1. להכין חיסון תאי
    1. לחסן 10 מ"ל לוריא-Bertani (LB) מדיה בשפופרת תרבות 15 מ"ל עם התאים המארחים e. coli, למשל, B או K12.
    2. המקום ב שייקר מוגדר 250 סל"ד ו-37 ° ג להשאיר למשך הלילה לגדול כדי הרוויה.
  2. יחיד-פלאק, צמיחה phage מחזור רב וריכוז
    1. כדי להכין צלחת של הפלאק phage המוסמכת, לחמם מספר צלחות LB-אגר ב 37 ° C עבור 1 h, או למשך הלילה.
    2. להכין מספר דילולים phage מניות (למשל, T7, T4 או L) ריכוז ידוע בתקשורת ליברות, מכוון ~ 10 2-10 3 phage/mL....
    3. להוסיף 100 µL של לילה צמיחת התאים המארחים מרוכז על כל צלחת.
    4. בחר כרכי-מוכנה phage דילולים המתאים לטווח של 10-100 phage/צלחת. להוסיף את הנפח הנדרש של דילולים phage כל צלחת (לדוגמה, µL 100 של phage 3 10/mL; זה צריך לייצר לוחות ~ 100). דגירה צלחות ב 37 מעלות צלזיוס ולהתחיל להמציא ספירת טיימר (+ 0 h). תקופת דגירה של 4-5 ח'
    5. להכין 49 מ ל LB מדיה הבקבוק 250 מ ל ובמקום שייקר רוטרי מוגדר 250 סל ד ו- 37 מעלות צלזיוס.
    6. - + H 2.5, שתדללו תאים 50 x על-ידי הוספת 1 מ"ל של תרבית תאים רווי מגידול לילה לתוך בקבוקון מראש ומחוממת המכיל 49 מ ל LB בינוני. ברגע התאים להגיע לצמיחה יומן (+ h 4-5), למדוד את ספיגת על 600 nm (OD 600). לקבוע את הריכוז של תאים באמצעות המרה OD 600 של 1.0 = 8 x 10 8 תאים למ"ל.
    7. Dilute 2 x 10 7 תא/mL באמצעות מדיה נוספים של צמיחה ליברות. הסר את לוחית אגר המכיל את הפלאק phage מן החממה. מיד להשתמש סוף פיפטה פסטר סטרילי ליבה ולהסיר שלט יחיד. לפוצץ את הפלקיו לתוך התאים מדולל, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 נוספים (+ h 6-7).
    8. מבחן מלא זיהום על ידי לקיחת דגימת 500 µL לתוך צינור 1.5 mL, הוספת 10 µL כלורופורם (CHCL 3), מיד vortexing במהירות גבוהה. שים לב אם הפתרון הוא הבהיר. ברגע תאים נגועים לחלוטין, תקופת דגירה של עוד 2 h (+ h 8-9).
      הערה: אם התאים נגועים לחלוטין, הם במהירות lyse (< 2 דקות) ולהבהיר את הפתרון. תוצרים נלווים נחשבים דיון בסעיף שלהלן. התאים להיות superinfected, אך לא lyse עד לנקודה זו. אם פירוק מתחילה, התוספת של DNase קצירת על ידי צנטריפוגה חייבים להתחיל מיד למנוע השפלה phage.
    9. להוסיף DNase 5 µg/mL, צנטריפוגה תאים ב g 8,000 x ב 4 ° C כדי גלולה. למחוק את תגובת שיקוע. Resuspend בגדר ב 10 מ"ל של x TRIS 1 מגנזיום כלורי (TM) (50 מ מ טריס ב- pH 7.8, 10 מ מ MgCl 2) מאגר עם 5 µg/mL DNase. להוסיף 500 µL של CHCL 3 ו מערבולת במהירויות גבוהות lyse התאים. להבהיר על ידי צנטריפוגה ב g x 12,000 10 דקות ב-4 ° C. Decant תגובת שיקוע לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל החנות ב-4 מעלות צלזיוס

2. טיהור של Phage

הערה: סוכרוז טיהור תלויה במידה רבה בגודל של phage. שיקולים של המונים phage להיות מבודד יהיה חייב להתבצע וביצע התאמות לתנאים הדרגתיות. האחרונים ויראלי titers של מעל 10 13 phage/mL השגה בקלות באמצעות שיטה זו.

  1. להכין 12 מ של סוכרוז w/v 5% ו- 45% 1 x מאגר TM-
  2. הכנת 4 x 5-45% סוכרוז מעברי צבע על-ידי pipetting 2.5 מ של 45% סוכרוז לתוך צינורות ultracentrifuge 4. למעלה עם ~ מ 2.6 ל 5% סוכרוז, ומפסיק כאשר הנוזל מגיע 2 מ מ בקצה הצינור.
    הערה: הנח את הטיפ פיפטה במגע עם משטח של הפתרון סוכרוז, לאט מאוד לוותר על נוזלי. הפתרון סוכרוז בהיר יותר יצוף מעל כבד, ויוצרים גבול ברור. פתרון בשכבות כראוי יהיה ממשק ~ 1 מ מ אם שנערכה נגד אור רקע.
  3. לערבב את מעברי צבע על ידי סיבוב הטיה-שפופרת באמצעות מעבר צבע ויוצרים נכשיר 43 s ב ° 86-23 סל ד. אם יש צורך. לא באופן מיידי, לכסות עם סרט פרפין ולאחסן ב-4 מעלות צלזיוס
  4. µL 500 להסיר מהחלק העליון של כל אחד מוכן סוכרוז הדרגתי עם pipettor 1 מ"ל, איזון בתוך ± 0.002 g...
  5. בריכה המתלים phage משפופרות כל (שלב 1.2.9). באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, להוסיף 500 µL של התליה על ידי מביא את הטיפ במגע עם משטח נוזלי, לאט מאוד מחלק את עוצמת הקול על החלק העליון של מעבר הצבע סוכרוז, נזהר לא לערבב דרך מהירה pipetting. צנטריפוגה ב 70,000 x g כעשרים דקות ב 4 º C
    הערה: איזון מעברי הצבע מוכן כדי בתוך ± 0.002 g. phages קטן עשוי להימשך עד 1 ח'
  6. להסיר את הלהקות phage באמצעות מזרק סטרילי ואת בצינורית בוטה.
    הערה: כאשר במבט מהצד, הלהקה phage יהיה חלבי ועבה לעומת הסביבה, כ 5 מ מ גובה, והוא ממוקם בחצי הדרך דרך צינור צנטריפוגה.
    1. Submerge סיגריה בצינורית לתוך הפתרון עד הקצה ממורכזת על הקצה העליון מאוד של הלהקה phage. הסר את הלהקה על ידי ציור על הבוכנה המזרק עד הרוב המכריע של הלהקה phage הוסר.
  7. להוסיף האחסון סוכרוז עם phage על תנאי 3-4 ultracentrifuge צינורות. להוסיף יותר מ 1.5 mL/צינור. מילוי כדי ~ 3-4 מ מ מתוך החלק העליון של הצינור עם קר 1 x TM. מכסה עם סרט פרפין, היפוך לערבב. בחזרה בבית, ultracentrifuge ו ספין-145,000 g x עבור h 1 ב 4 ° C כדי גלולה. Phages קטן יותר יכול לקחת עד 2 ה
  8. יוצקים את תגובת שיקוע ובמהירות לנקז במהופך על מגבונים חד פעמיים. לנגב את החלק הפנימי של צינור עם אוזניים סטרילי כדי להסיר עודפי תגובת שיקוע.
  9. לחלק 200-400 µL קר 1 x TM על-פני כל גללים ו resuspend בין לילה ב 4 ° C; אי אפשר לנער נדרש.
    הערה: אם בגדר אינו נקי, כגון: בכיפות פיסות ממברנה, דנ א, וכדומה, בריכה ולבצע צנטריפוגה נוספים ב- microcentrifuge-17,000 ג x
  10. היום לפני ביצוע titers, להכין תרבות של e. coli התאים המארחים בתקשורת הצמיחה 10 מ ל LB, להשאיר חממה חזק מוגדר 250 סל ד ו- 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. דגירה את הכמות המתאימה של תרבות צלחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה לפני ביצוע titers של המניה phage.
    הערה: מספר צלחות דגירה תלויה במספר של דילולים phage מניות כדי להיות מצופה: כל דילול ייחודי של מניות phage דורש שתי צלחות תרבות (למשל, בארבע דילולים שונים של מניות phage דורשות שמונה צלחות תרבות).
  11. להכין 100 מ של אגר העליון על-ידי הוספת 2.5 g ק ג ו- 0.6 g מה נשארתי-אגר בקבוק 100 מ. להמיס המוצקים במים יונים באמצעי אחסון של 100 מ ל, תא לחץ. לאחר החיטוי, לאט להפוך את הבקבוק 6 - 8 פעמים כדי homogenize את אגר ברחבי הפתרון. מקם את הבקבוק באמבט מים 45 º C למשך 15-20 דקות עד equilibrate הטמפרטורה .
  12. להכין טורי דילול מניות phage עם הפתרון LB-
    1. µL להוסיף 990 LB 10 phage µL במניה לדילול 100-fold. המערבולת homogenize. עבור גורם לדילול של 10, להוסיף µL 100 מניות phage 900 µL המערבולת LB. homogenize.
    2. חוזרת הסדרה דילול לעיל כמה פעמים לפי הצורך כדי לקבל מספר אפשר לספור של הפלאק (10-100 הפלאק).
      הערה: כדי להשיג זאת, לדלל המניה phage 2-3 סדרי גודל פחות מאשר התשואה הצפויה phage מבחינת התגובה phage/mL. לדוגמה, אם מניה phage מסוים מכיל 10 11 זיהומיות phage/mL, צלחת המניה phage ב 10 8-קיפול או 10 9-מקפלים דילול.
  13. להתכונן אזור phage titers על ידי הרכבת צינורות תרבות 14 מ"ל (מספר צינורות תרבות שווה מספר phage דילולים מניות כדי להיות מצופה). במקום הדגימות מניות phage מדולל מהשלב 2.12, התאים חיידקי מארח מהשלב 2.10 על קרח
  14. להכין תערובת בסיס על-ידי pipetting מ"ל ו 5.25 העליון אגר (שלב 2.11), 220 µL מדולל phage דגימות (שלב 2.12) ולאחר 50 µL מארח תאים חיידקיים (שלב 2.10) לתרבות מ 14 ל צינור. קאפ את תרבות שפופרת ואת מערבולת במהירות גבוהה-
    1. אחסן את הפתרון phage הנותרים 4 ° C.
  15. להחזיר התרבות שתי צלחות (שלב 2.10) מן החממה 37 º C. להוסיף 2.5 מ של מיקס מאסטר לאט במרכז צלחת הראשונה (ללא בועות). סובב בעדינות את הצלחת ביד כדי להפיץ את תערובת הבסיס באופן שווה כך על פני לוח תרבות שלמה. חזור עם לוחית השני. לחכות 20 דקות כדי להבטיח ייבוש של אגר העליון. דגירה צלחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4-7 ח'
  16. נחשב הפלאק ולקבוע את הריכוז phage עבור כל דגימה התגובה.
    הערה: שלטי יופיעו כעיגולים ברור 1-2 מ מ בשטיח אטום של התאים המארחים. לקבלת תוצאות נציג, ראה איור 1. הפקה מוצלחת phage תגרום בריכוזים הסופי של 10 12-10 13 phage/mL-

3. גדילי כפול מיצוי DNA הגנום

הערה: דילול, רועדת, צנטריפוגה צעדים חייב להיות אופטימיזציה לפתח שכבה עבה, מוצק חלבון גבול בין פנול שלבים מימית. זה יוצר הגנום טוהר הגבוהה חופשיים של חלבון מזהמים. דילול הראשונית תלויה כייל phage הסופי. מניות phage כייל נוגדנים גבוה ביותר (≥ phage 13 10/mL) עשוי להזדקק לדילול 10-20-קיפול לפני החילוץ, בעוד יזדקק רק מניות כייל נמוך (~ 10 10-10 11 phage/mL) 2-fold או אף אחד. אם זה קשה ליצור שכבת חלבון מוצק בצעדים העוקבים או המתלה מימית הוא דביק מדי להיות ישימה בשל הריכוז הגבוה של ה-DNA, שקול לדילול גבוה יותר של מניות phage לפני שתמשיך החילוץ. במהלך צעד הגנום-טיפול כלשהו, חשוב להשתמש רחב נשא פיפטה טיפים כאשר pipetting כל שלבי מימית. הגנום phage רבים וגדולים די בקלות מפוצלים באמצעות פיפטה הטיה. בנוסף, כל vortexing במפורש להימנע כמה זה חמור להטיה הגנום.

  1. לדלל חלק phage מניות מ שלב 2.9-400 µL עם 1 x TM המאגר בצינור mL 1.5 טריים.
  2. להוסיף אמצעי שווה של Tris:Phenol:Chloroform הדילול. לנער את התערובת בעדינות על כיסא נדנדה מעבדה, או בעבודת יד, עבור 5 דק Centrifuge האמולסיה תוצאות ב g x 17,000 ומפרידה benchtop במשך 5-10 דקות
    הערה: שכבת חלבון ברורים, לבן על פני השטח של השלב הבסיסי פנול קיים.
  3. להסיר את שלב מימית העליון צינור מטפל שלא להפריע את הגבול לאטמוספרה.
  4. חזור על צעדים 3.2-3.3 נוספים 2 פעמים בסך הכל 3 עקירות פנול. להעביר את פאזה מימית צינור טריים ולהוסיף אמצעי שווה של CHCl 3. טלטול, צנטריפוגה (שלב 3.2). להעביר את דגימת DNA מימית צינור נקי.
  5. מעריכים את אמצעי האחסון של ה-DNA מטוהרים. מוסיפים 0.4 כרכים של 3 מ' סודיום אצטט (CH 3 COONa) שלושה כרכים של 95% אתנול (EtOH). מניחים במקפיא-20 ° C עבור לילה משקעים. צנטריפוגה ב g x 17,000 ומפרידה benchtop במשך 10-15 דקות
    הערה: ה-DNA מיד מייבשים ולהיות גלוי כמו מסה ההשעיה בצינור. בגדר וכתוצאה מכך ראוי הוא לבן, ארוזה היטב בתחתית השפופרת.
  6. להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע decanting או pipetting. להוסיף 500 µL 70% EtOH וללחוץ בעדינות את הצינורית עד בגדר צף חינם מהחלק התחתון של צינור. צנטריפוגה-17,000 g x עבור 5 דק להסיר ולמחוק EtOH, מקפיד לא להפריע בגדר.
  7. חזור על שלב 3.6. האוויר יבש בגדר על benchtop במשך 30-60 דק להוסיף 50 µL ddH 2 O כדי בגדר תקופת דגירה של 1 h RT או לילה ב 4 ° C עד resuspend. לקבוע את ריכוז הדנ א באמצעות מדידות הקליטה ב 280 ננומטר.
    הערה: ריכוז הצפוי הם 0.5-5 µg/µL בעזרת טכניקה זו. לחלק ב- סה כ משקל מולקולרי גנומית כדי לקבוע ריכוז הגנום הסופי.

4. ללא תא Phage התגובה וניסוי כייל נוגדנים Phage

  1. להכין 25 גרם ליברות בינוני ויציב מה נשארתי-אגר 15 גרם, שופכים לתוך בקבוק 1 ליטר, ולהוסיף מים יונים 1 ל' אוטוקלב.
  2. לאחר עיקור, להפוך את הבקבוק באיטיות 6 - 8 פעמים לדאוג כדי למנוע היווצרות בועות. היפוך הבקבוק homogenize המוצק אגר ברחבי הפתרון 1 ליטר. למקם את הבקבוק בתוך אמבט מים 58 מעלות כעשרים דקות לפני dispensing על גבי לוחות תרבות.
  3. ברגע הטמפרטורה של הפתרון LB-אגר יש equilibrated, להכין להבה ליד הלוחות תרבות לחטא הסביבה ליד הלוחות תרבות הפתוחים. שמור את הבקבוק 1 ליטר באמבט מים כדי למנוע ייבוש של אגר בעת ביצוע של aliquots. להוסיף 25 מ לתוך צלחת תרבות 100 מ"מ x 15 מ"מ. 1 ליטר יהיה לייצר הצלחות תרבות 40.
  4. לוח תרבות אחד להפריש ולתת לחזק במשך לפחות שעה-RT; הצלחת הזו תשמש עבור ציפוי התאים מארח. תן שאר הצלחות 39 תרבות לחזק במשך יומיים בחנות RT. ב 4 ° C או להשתמש מיד להכנת titers.
  5. צלחת התאים מארח על-ידי ומבטא את המתח בקטריאלי המתאים (לדוגמה, מחשב מארח B עבור T7) זה היה מאוחסן ב- 80 ° C, על גבי צלחת תרבות LB-אגר. פס ליד להבה פתוחה כדי למנוע זיהום סביבתי. דגירה בין לילה ב 37 º C. התאים מארח יש עמידות לאנטיביוטיקה אין אז עובד בסביבה סטרילית חיוני.
  6. התגובה ללא תא
    הערה: התגובות TXTL נטול תאים מורכבים 33% גולמי e. coli לחלץ (חלבון 8.9-9.9 מ"ג/מ"ל) % 67 אחרים מורכבת התגובה מאגר ו phage הגנום. תמצית גולמי מוכן כמו בעבר תיאר 15 , 16. תגובה אחרונה התנאים: חלבון 8.9-9.9 mg/mL (מתמצית גולמי), 3-6 מ מ Mg-גלוטמט, 40-100 מ מ K-גלוטמט, 2-4% יתד 8000, 3-4 מ מ של כל חומצת אמינו, מוכנים כמו שתואר לעיל 17 ולאחר פתרון תמהיל האנרגיה, תיאר בעבר 15, המורכב 0.33-3.33 DTT, מ מ 50 מ מ. HEPES, מ מ 1.5 ATP ו- GTP, מ מ CTP, זוג שזור, 0.2 מ"ג/מ"ל tRNA, 0.26 מ מ CoA, 0.33 מ מ NAD, 0.75 מ מ מחנה, חומצה פולינית מ"מ 0.068, spermidine 1 מ מ ו- 30 מ מ 3-PGA. דנ א-סוג phages דורשים ריכוזים הגנום של 0.5-10 ננומטר, מסוג RNA phages דורשת טווח של 50-150 ננומטר. התגובה האחרונה ריכוזים ייחודית phage מסוים מסונתז, תיפול בטווחים שתוארו לעיל. עבור חמצון אופטימלית של התגובות, כרכים התגובה הסופי צריך להיות בין 10-20 µL. ישנן וריאציות קטנות בפרוטוקול התגובה, אשר תלויים צורת המולקולה גנומית. לדוגמה, הגנום ליניארי מולקולות דרוש מרכיב חשוב נוסף בתגובה לעכב את העיכול של חתיכות DNA ליניארי על ידי האנזים recBCD נוכח תמצית גולמי.
    1. להשלים " התגובה פרטים " בסעיף טבלה 1 (PhageTXTL_JOVE) על-ידי הזנת המספר הכולל של תגובות ונפח הסופי של תגובה.
    2. תכנון הניסוי על-ידי קביעת הרכיבים קבוע ואת מרכיבי המשתנה של התגובה. הזן את האחוז נפח החלקי של המיקס ראשיים, אשר הוא היחס מהנפח הכולל של רכיבי התגובה קבוע למוצר של התגובה האחרונה אמצעי האחסון, מספר הדגימות. הזן את המלאי הסופי ריכוזי ריאגנטים התגובה ב " מאסטר תערובת התגובה מתכון " בסעיף PhageTXTL_JOVE. הזן את המלאי הסופי ריכוזי reagent(s) המשתנה ייבדק.
      הערה: אמצעי האחסון של רכיבי התגובה באופן אוטומטי יחושב בהתבסס על מיקס מאסטר ונפח האחסון הסופי של כל תגובה בודדים.
    3. להסיר את הסכום הדרוש של צינורות (המצוין " צינורות להפשיר " בסעיף PhageTXTL_JOVE.xlsx) של תמצית תא גולמי, תמהיל מאגר האנרגיה חומצת אמינו לערבב מ-20 ° C או -80 ° C ו הפשרה על קרח
      הערה: פעם הקרת, לשלב מספר aliquots של כמו רכיבים (במקרה הצורך)-
    4. Aliquot הנפח המצוין של גולמי לחלץ, 33% של אמצעי האחסון התגובה האחרונה, לתוך צינור microcentrifuge.
    5. להכין את תערובת הבסיס לפי טבלה 1. Homogenize כל הרכיבים תחת " מאסטר תערובת התגובה מתכון " על ידי vortexing. להוסיף נפח מתאים של כל רכיב תמצית גולמי.
    6. אם עובד עם phage עם גנום DNA ליניארי (למשל, T7), להוסיף 1 מיקרומטר של החלבון גאם של למדא bacteriophage תגובה 11. מערבולת כדי homogenize את הפתרון, ומניחים את התגובה על קרח למשך 5 דקות. זה מעכב עיכול החלקים DNA ליניארי על-ידי recBCD מורכבות, אשר הוא אנדוגני תמצית גולמי.
    7. לאחר הוספת הרכיב האחרון לפי טבלה 1, homogenize את התגובה על ידי vortexing. לפצל את תערובת הבסיס לתוך צינורות microcentrifuge n.
      הערה: הנפח של כל פיצול הוא התוצר של האחוז נפח מיקס מאסטר החלקי, הנפח הסופי של התגובה. לדוגמה, אחוז נפח מיקס מאסטר החלקי של 90%, את עוצמת התגובה האחרונה 12 µL, הנפח של כל פיצול הוא 10.8 µL.
    8. להוסיף את אמצעי האחסון שצוין מרכיבי המשתנה של המערך מיקס מאסטר (ראה טבלה 1). להוסיף מים כל התגובה להגיע שעוצמת התגובה הסופי הרצוי. Homogenize כל תגובה על-ידי vortexing. דגירה הצינורות microcentrifuge ב 29 מעלות צלזיוס לפחות 8 שעות או לילה.
  7. תרבות טרום תא מארחת
    הערה: התרבות מראש לילה הוא מדולל 50:1 כדי להבטיח כי התאים מארח המשמש את הניסוי כייל נוגדנים בשלב אמצע יומן, אשר מגביר את יעילות זיהום. התאים באמצע יומן מחדש מרוכז על-ידי 10-fold ואז ומאוחסנים על קרח.
    1. באמצעות טיפ פיפטה סטרילי, לחסן שפופרת תרבות של 5 מ"ל ליברות עם 3-5 מארח בריא תא מושבות. עבודה ליד להבה פתוחה כדי למנוע זיהום.
    2. דגירה הצינור תרבות בתוך חממה חזק ב 37 ° C ו 250 סל"ד במשך 16 שעות או לילה. תאים יכול להגיע שלב רוויה ביום שלמחרת.
  8. לארח תא תרבות, לדוגמה כהכנה phage כייל נוגדנים
    1. לוותר על 50 מ ל LB לתוך הבקבוק Erlenmeyer 500 מ"ל לכסות ברדיד אלומיניום. לחמם את הבקבוק ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות
    2. Aliquot 1 מ"ל של המארח תא לילה מראש התרבות לתוך מראש ומחוממת LB. תקופת דגירה של 3-4 h ב- 37 ° C, ומנענע ב 250 סל"ד.
    3. צנטריפוגה התרבות התא המארח 50 מ ל 10 דקות ב ג x 5,000 למחוק את LB.
    4. Resuspend בגדר קר (4 ° C) מ ל LB ולשמור על קרח
    5. שעה אחת לפני תחילת הניסוי כייל נוגדנים, דגירה הלוחות התרבות ב- 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: כל התגובה phage ייחודי (וגם גורם לדילול המתאימים) יהיה לנצל שתי צלחות. בנוסף, דגירה ארבע פלטות עבור פקדים ניסיוני (ראה איור 1 עבור פקדים נציג חיוביים ושליליים).
    6. להכין 100 מ של העליון אגר (שלב 2.11).
  9. להכין לדילול טורי התגובה ללא תא עם פתרון LB כמתואר בסעיף 2.12.
  10. Phage כייל נוגדנים
    הערה: להתחיל צלחת אחרי תרבות מנות יש הדגירה במשך לפחות שעה אגר העליון היה באמבטיה מים 45 º C למשך 15-20 דקות לאחר ההסרה של החיטוי.
    1. כייל הסופי התא ללא תגובה-LB פתרון כמתואר בסעיף 2, צעדים 2.14-2.16.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

אנו מראים תוצאות נציג ארבע. איור 1, אנו מציגים קבוצה של פקדים שלילי כדי להבטיח כי מערכת TXTL ללא תאים, המניות DNA phage לא נגועים עם חיים התאים e. coli . אנו מאמתים כי מערכת TXTL נטולת תא הינה ללא פגע e. coli תא זיהום על ידי ציפוי שני התגובה שאינו מתפשט, מודגרות פתר...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

בעקבות הטכניקה חן, et al. 14 עבור SPMC, שלב קריטי נגיש בקביעת תנאי נאותה superinfection. הפרמטר השולט ביותר היכולת של זן מארח לעמוד superinfection הוא לעתים קרובות הריכוז ההתחלתי של phage המזהם. התאים מארח חייב להיות בשלב הצמיחה לוגריתמי לפני זיהום ראשוני עם כמות קטנה מאוד של phage. בסופו של דבר, pha...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים מצהירים את interest(s) הפיננסיים מתחרים הבאים: מעבדה Noireaux מקבל וקרנות מחקר MYcroarray, מפיץ של ערכת ביטוי חלבון נטול תא MYtxtl.

Acknowledgements

חומר זה מבוסס על עבודה נתמכת על-ידי Office של המחקר הימי פרס מספר N00014-13-1-0074 (V.N.), תוכנית המדע הגבול האנושי להעניק מספר RGP0037/2015 (V.N.), הקרן הדו-לאומית למדע להעניק 2014400 (V.N.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Ultracentrifugation tubesBeckman Coulter344057
Conical tubesFalcon352070
Gradient makerBioComp Gradient Mastersee Anal Biochem. 1985 Jul;148(1):254-9.
Syringe and Blunt CannulaMonoject8881513918 and 888202017
Wide-bore pipette tipsFischerbrand02-707-134
Plaque counterNew Brunswik ScientificColony Counter Model C-110
Culture tubesFischerbrand14-961-33
Cell-free systemMycroarray IncMytxtl
BioComp Gradient MasterBioComp InstrumentsModel 105ME
LB agar plate recipe25 g/L Luria-Bertani medium (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents product number BP1426) and 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson and Company - product number 214010).

References

  1. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnol Adv. , (2011).
  2. Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell. Metab Eng. , (2011).
  3. Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/mL of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
  4. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS Synth Biol. 1 (1), 29-41 (2012).
  5. Chemla, Y., Ozer, E., Schlesinger, O., Noireaux, V., Alfonta, L. Genetically expanded cell-free protein synthesis using endogenous pyrrolysyl orthogonal translation system. Biotechnol Bioeng. , (2015).
  6. Hong, S. H., Kwon, Y. C., Jewett, M. C. Non-standard amino acid incorporation into proteins using Escherichia coli cell-free protein synthesis. Frontiers in Chemistry. 2, (2014).
  7. Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12672-12677 (2003).
  8. Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for Rapid Prototyping of Synthetic Biological Circuits in an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free System. Acs Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).
  9. Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. , (2015).
  10. Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction. ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).
  11. Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth Biol. , (2016).
  12. Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. Coarse-grained dynamics of protein synthesis in a cell-free system. Phys Rev Lett. 106 (4), 048104(2011).
  13. Daube, S. S., Arad, T., Bar-Ziv, R. Cell-free co-synthesis of protein nanoassemblies: tubes, rings, and doughnuts. Nano Lett. 7 (3), 638-641 (2007).
  14. Chen, X., et al. An immunoblot assay reveals that bacteriophage T4 thymidylate synthase and dihydrofolate reductase are not virion proteins. J Virol. 69 (4), 2119-2125 (1995).
  15. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp. (79), e50762(2013).
  16. Shin, J. N. V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. J Biol Eng. , (2010).
  17. Caschera, F., Noireaux, V. Preparation of amino acid mixtures for cell-free expression systems. Biotechniques. 58 (1), 40-43 (2015).
  18. Minton, A. P. How can biochemical reactions within cells differ from those in test tubes. J Cell Sci. 119, Pt 14 2863-2869 (2006).
  19. Minton, A. P. Implications of macromolecular crowding for protein assembly. Curr Opin Struct Biol. 10 (1), 34-39 (2000).
  20. Zimmerman, S. B., Minton, A. P. Macromolecular crowding: biochemical, biophysical, and physiological consequences. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 22, 27-65 (1993).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

126TXTLbacteriophagee coliassay phagephage

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved