ابحث عن برنامج تشغيل مسارات اكتسبت مقاومة للعلاج المستهدفة: جيل سوبكلون المقاومة للأدوية وحساسية استعادة بواسطة خبط الجينات لأسفل

Summary

هذا الوقت--وفعالة من حيث التكلفة في المختبر بروتوكول تحقق آليات المقاومة المكتسبة للعوامل العلاجية المستهدفة، وحاجة طبية العالية التي لم تلب في إدارة السرطان.

Abstract

خلال العقدين الماضيين شهدت تحولاً من العقاقير السامة للخلايا للعلاج المستهدفة في الأورام السرطانية. على الرغم من أن العوامل العلاجية المستهدفة وأظهرت الفعالية السريرية أكثر إثارة للإعجاب، والآثار الضارة مصغر من العلاجات التقليدية، أصبحت المقاومة للعقاقير إلى القيد الرئيسي لفوائدها. تم تطوير عدة نماذج الإكلينيكية في المختبر/المجراة في المقاومة المكتسبة لوكلاء المستهدفة في الممارسة السريرية أساسا باستخدام استراتيجيتين: التلاعب ط) الوراثية للنمذجة الوراثية المقاومة المكتسبة، والثاني) في المختبر/ المجراة في اختيار النماذج مقاومة. في هذا العمل، فإننا نقترح إطارا موحدا، للتحقيق في الآليات الأساسية المسؤولة عن المقاومة المكتسبة للعوامل العلاجية المستهدفة، بدءاً من توليد سوبكلونيس الخلوية المقاوم لوصف إسكات الإجراءات المستخدمة لاستعادة الحساسية للمانع. هذه المرة-وفعالة من حيث التكلفة نهج بسيط قابلاً للتطبيق على نطاق واسع، ويمكن أن تمتد بسهولة إلى التحقيق في آليات المقاومة للعقاقير العلاجية الأخرى المستهدفة في هيستوتيبيس ورم مختلفة.

Introduction

متابعة الاكتشافات الهامة في مجال البيولوجيا الجزيئية والخلوية، قد وضعت عددا من جزيئات السرطان تجميعي رواية لاستهداف مسارات إشارات النمطان في طائفة واسعة من أنواع الأورام بشكل انتقائي. على وجه الخصوص، المركبات الكيميائية الاصطناعية هي فئتين من العوامل العلاجية المستهدفة مع خصائص فريدة من نوعها في علم الأورام، والمعروف مونوكلونل المؤتلف، حققت نجاحات السريرية والرعاية سرطان غيرت جذريا في العقود الأخيرة^1،،من²³.

ومع ذلك، وضعت غالبية مرضى السرطان استجابتها الأولية مثيرة للإعجاب للعلاج، وعلى الرغم من مقاومة الأدوية لجميع العوامل العلاجية المستهدفة، كل من الأجسام المضادة ومثبطات كيناز. نتيجة لذلك، المقاومة للعقاقير، العقبة الرئيسية للأدوية المضادة للسرطان الكلاسيكية⁴، لا يزال يشكل تحديا كبيرا للناشئة العلاجات المستهدفة^5،6.

قد تكون مقاومة للعلاج المستهدفة الجوهرية (أيالابتدائية) أو مكتسبة (أي، الثانوية). يصف المقاومة المتأصلة حيثياته عدم الاستجابة للعلاج، بينما المقاومة الثانوي يحدث بعد فترة من استجابة للمخدرات العلاج⁷. بسبب تفشي أفواج صغيرة من الخلايا السرطانية داخل الجزء الأكبر الورم بدائية أو تقع في منافذ التشريحية خفي القاصي والعارضة تصل إلى 90% مقاومة لواحد أو أكثر يستهدف العوامل العلاجية. الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطور مقاومة للعلاج المستهدفة أساسا نتيجة لطفرات الجينات المستهدفة وتفعيل مسارات الإشارات الأخرى الموالية البقاء على قيد الحياة، التفاهم الذي لا يزال بعيداً عن كامل⁸زائدة عن الحاجة.

واقترحنا في هذا العمل، نهجاً الوقت--وفعالة من حيث التكلفة للتحقيق في المختبر آليات المقاومة المكتسبة للعوامل العلاجية المستهدفة، بدءاً من توليد سوبكلونيس الخلوية المقاوم للأدوية إلى وصف لإسكات الإجراءات المستخدمة لاستعادة الحساسية للمانع، أداة حاسمة المستخدمة للاختبار والتحقق من صحة فرضيات العمل. على وجه الخصوص، استخدمت نهجنا للتحقيق، في الإصابة بسرطان المعدة، آليات المقاومة تراستوزوماب (مثلاً، هيرسيبتين)، جسم [مونوكلونل] أنسنة استهداف المجال خارج الخلية ل بروتين HER2⁹. تراستوزوماب + العلاج الكيميائي مقبول على نطاق واسع كعلاج الخط الأول القياسية لسرطان الثدي المنتشر إيجابية HER2. بفضل الدراسات السريرية الحديثة تبين أن مكافحة-HER2 العلاجات لها نشاط كبير في على حد سواء في المختبر و في فيفو سرطان المعدة إيجابية HER2 نماذج^10،11، كانت العقاقير الجزيئية استهداف HER2 درس على نطاق واسع في التجارب السريرية، التي لا تزال جارية، في المرضى الذين يعانون من السرطان المعدي^12،13،،من¹⁴¹⁵.

وأكدت هذه الدراسات ارتفاع عدد المرضى التي تواجه مقاومة تراستوزوماب¹⁶، على نحو مماثل لما يتم ملاحظته لمثبطات العلاجية المستهدفة الأخرى. على وجه الخصوص، كان معدل الاستجابة من تراستوزوماب 47 في المائة، ومتوسط بقاء الشاملة للمرضى على العلاج الكيميائي + تراستوزوماب أطول من المرضى على العلاج الكيميائي وحدها¹⁷2.7 شهرا فقط. هذا يشير إلى أن المقاومة تراستوزوماب الابتدائي منتشر، لكن المقاومة تراستوزوماب الثانوي أمر لا مفر منه. لهذا السبب، هناك حاجة ملحة توضيح الآليات التي تسبب مقاومة العلاج المستهدفة HER2 في الإصابة بسرطان المعدة، وحتى أكثر صعوبة نظراً لعدم تجانس الوراثية داخل مداواة هذا نيوبلسا¹⁸.

وبالإضافة إلى ذلك، أثبتت آليات المقاومة إلى تراستوزوماب في سرطان المعدة صعبة أن يفسر، جزئيا بسبب صعوبة الحصول على نماذج موثوقة السريرية الممثل لهذا الشرط. أوشيما وآخرون عن أسلوب انتقاء في فيفو من خطوط الخلايا تراستوزوماب مقاومة سرطان المعدة، تتكون ثقافة المتكررة خبيث البريتوني الصغيرة المتبقية بعد العلاج مع تراستوزوماب¹⁹. ومع ذلك، ساهمت الحاجة من ضميمة وخبرات محددة في التعامل مع الحيوانات، وموافقة "لجنة الأخلاقيات الحيوان" يجعلها أسلوب استهلاكاً لوقت وتكلفة. النهج الذي يصف لنا في هذا العمل بسيطة وقابلة للتطبيق على نطاق واسع، ويمكن أن تمتد بسهولة إلى التحقيق في آليات المقاومة للعقاقير العلاجية الأخرى في ورم مختلفة هيستوتيبيس²⁰.

Protocol

ملاحظة: عدلت هذا البروتوكول لتحليل الآليات الكامنة وراء المقاومة المكتسبة إلى تراستوزوماب هير المصابات بسرطان المعدة خلية خطوط على وجه التحديد. وترد في الجدول للموادجميع الصكوك المختبرية اللازمة.

1-جيل سوبكلونيس مقاومة للعلاج المستهدف

ملاحظة: هذا هو أكثر المسائل حساسية وصعوبة في توحيد خطوة في البروتوكول نظراً إلى أن خطوط الخلايا المختلفة قد يحمل حساسيات مختلفة للمانع العلاجية المستهدفة بشكل مستقل من تركزها الورم هيستوتيبي أو المخدرات المستخدمة.

1. الثقافة NCI-N87 الخلية خط في المتوسط ربمي تستكمل مع مصل العجل الجنين (10 في المائة) والجلوتامين (مم 2، 1%)، كأحادي الطبقة عند 37 درجة مئوية، والبذور على 25 سم² قوارير الثقافة.
2. إضافة إلى متوسط الثقافة في كل قارورة 10 ميكروغرام/مل من تراستوزوماب كجرعة البداية. تعرض الخلايا لجرعة البداية حتى أنهم استئناف النمو.
   ملاحظة: يجب أن تكون بداية جرعة مثبط العلاج المستهدفة أقل بعشرة إضعاف من تركيز الذروة في البلازما. هو تركيز البلازما الذروة أعلى مستوى لتركيز المخدرات اكتشفت في دم المريض عادة بعد عدة جرعات من العلاج القياسي. ويمكن استرجاع هذه القيمة من دراسات بشأن الدوائية.
3. رصد نمو الخلايا باستخدام أسلوب الاستبعاد تريبان الأزرق؛ عندما يتم استئناف نمو الخلايا (عادة بعد فترة من أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع)، تعرض الخلايا إلى جرعة أعلى إذ تركز تراستوزوماب.
4. تعرض الخلايا إلى جرعة تراستوزوماب (من 100 ميكروغرام/مل إلى 400 ميكروغرام/مل) تتزايد تدريجيا حتى تبقى الخلايا المتزايد (بعد حوالي 2 أسابيع) على الرغم من وجود تركيز عالية من المخدرات (على الأقل 2.5-4-fold أعلى من ذروة البلازما).
5. القيام فحص كلونوجينيك لتقييم مستوى المقاومة للعلاج المستهدفة عند كل تغيير في تركيز مثبط العلاج المستهدف في الأجلين المتوسط والثقافة، وتعريف الفهرس₅₀ IC المقاومة النسبية (RR IC₅₀) على النحو التالي.
   1. بذور الخلايا 500 في 24 الثقافة المتعددة لوحات.
      ملاحظة: يجب إعداد الآبار 5 لكل مجموعة الشرط.
   2. يعرض الخلايا للعلاج بهدف زيادة المانع (تراستوزوماب) التركيزات من 100 ميكروغرام/مل ما يصل إلى 400 ميكروغرام/مل.
   3. احتضان الخلايا في حاضنة₂ CO في 37 درجة مئوية لمدة 15 يوما.
   4. وبعد الحضانة، إصلاح ووصمة عار عينات كما يلي.
      1. إزالة الخلايا المتوسطة والشطف مع برنامج تلفزيوني 1 x 10 مل. إزالة برنامج تلفزيوني x 1 وإضافة 2-3 مل من محلول التثبيت (حمض الخليك: الميثانول، 1:7، (المجلد/المجلد)). إزالة تثبيت الحل وإضافة الحل البنفسجي كريستال 0.5%. احتضان في درجة حرارة الغرفة ح 2
      2. إزالة الحل البنفسجي كريستال بعناية عن طريق يسفط مع ماصة وتزج لوحات في مياه الحنفية شطف أي مخلفات الحل البنفسجي كريستال. أيردري في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 2 يوما.
   5. عد مستعمرات الخلايا أكثر من 50 باستخدام مجهر مقلوب (4 X التكبير).
      ملاحظة: تحتاج اثنين من المراقبين المستقلين لهذا.
   6. حساب RR IC₅₀ كالنسبة بين القيمة₅₀ IC للخلايا المستهدفة-العلاج-مقاومة سوبكلون والقيمة للخلايا الأصلية/ساذجة.

2. بروتوكول التحقق من صحة للمرشح الذي استهدف العلاج بالجينات المقاومة (R-جين)

ملاحظة: بعد أن وصف التعبير الجيني، التواقيع المقترنة بالمقاومة المكتسبة للعلاج المستهدف وأي الجينات المرشحة كما سيتم التحقيق في برنامج التشغيل للمقاومة من خلال: أ) RT-PCR، وب) الغربية لطخة تحليل.

1. RT-PCR الوقت الحقيقي
   1. استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من خطوط الخلايا باستخدام خليط ثيوسيانات-الفينول-كلوروفورم حمض جوانيدينيوم (انظر الجدول للمواد).
   2. إجراء النسخ العكسي (RT) ردود فعل استخدام كبسولة تفجير هيكسامير عشوائي وتعيين cycler الحرارية كما يلي: فتيلة عند 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، الرايت في 46 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، والمنظمة RT عند 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
   3. استخدام 400 نانوغرام من مجموع الحمض النووي الريبي لفعل 20 ميليلتر. إعداد الخليط رد فعل للعينة على النحو التالي: 7 ميليلتر رناسي مجاناً ح₂س، 2 ميليلتر جالحمض النووي (10 نانوغرام/ميليلتر)، 1 ميليلتر 20 x الفلورسنت المسمى مسبار محددة الهدف، و 10 ميليلتر 2 × مزيج يحتوي على المخزن المؤقت، دنتبس وبوليميريز الحمض النووي (انظر الجدول للمواد).
   4. إضافة 20 ميليلتر من خليط رد فعل لكل لوح جيدا وتشغيل البرنامج التالي: عقد المرحلة عند 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق (المرحلة 1)؛ ثم 40 دورات في 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية وعند 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
2. لطخة غربية
   1. استرداد تعليق الخلية بإضافة 2 مل من محلول التربسين/يدتا 0.05% والسماح 2-3 دقيقة التربسين للعمل.
   2. إضافة 2 مجلدات متوسطة الحجم تحتوي على 10% الجنين البقري المصل لتحييد التربسين (مثلاً، 2 مل متوسط لكل 1 مل من التربسين) والطرد المركزي في 1,200 س ز للحد الأدنى 5 تجاهل طافية وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني الباردة x 1.
   3. الطرد المركزي في 1,200 س ز لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية. ريسوسبيند بيليه الخلية مع المخزن المؤقت لتحلل واحتضان في الروك عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      1. كمية تحلل المخزن المؤقت يعتمد على عدد الخلايا(مثلاً 100 ميليلتر للخلايا⁶ 1 x 10)؛ تأكد من إعداد المخزن المؤقت لتحلل جديدة في كل مرة. 1 مل من تحلل إعداد المخزن المؤقت (إجازة في الجليد): استخدام ميليلتر 975 م-كل المخزن المؤقت ليستي الثدييات ومثبطات البروتياز والفوسفاتيز 15 ميليلتر 10 ميليلتر 100 ميكرومتر مثبطات بمسف.
   4. استرداد البروتين طافية بالطرد المركزي ليساتي الخلية في 13,000 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
   5. تحديد تركيزات البروتين باستخدام مقايسة بروتين اتفاق التعاون الأساسي.
   6. إضافة 4 × لايمملي عينة المخزن المؤقت لعينات البروتين (على الأقل 20-30 ميكروغرام من البروتين) والحرارة عند 100 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
   7. استخدام المواد الهلامية الخرسانة الجاهزة 4-20% وتحميل 20-30 ميكروغرام من البروتين لايملي الحل و 5-10 ميليلتر من البروتين القياسية كل عينة.
   8. ملء الطوق لطخة غربية مع المخزن المؤقت 1 x/SDS تريس/جليسيني وتشغيل جل في 110 V لمدة 30-60 دقيقة (عندما يتوقف الوقت تحقق من أن الصبغة قد وصلت إلى نهاية الهلام، إلا تشغيل لبضع دقائق إضافية)
   9. اليكتروبلوت لنقل البروتينات إلى غشاء PVDF (انظر الجدول للمواد) باستخدام نظام شبه جاف.
   10. كتلة الغشاء مغطس في الحل المناسبة من البروتين (اللبن/جيش صرب البوسنة 5 ٪) على شاكر في درجة حرارة الغرفة ح 1.
   11. جعل حلاً 1: 400 مع جسم الأساسي مكافحة IQGAP1 في حل حليب 5 في المائة (انظر الجدول للمواد).
   12. وضع الغشاء في حل جسم الأولية على شاكر في غرفة باردة بين عشية وضحاها.
   13. في اليوم التالي، تجاهل حل جسم ونقع في الحل 1 x T-تبس (1 × تي-تبس: x 1 أضاف "تريس المالحة المخزن المؤقت" قبل Tween20 0.1%) على شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 7 دقائق.
   14. تجاهل تي-تبس 1 × الحل واستبدال. كرر 3 مرات.
   15. جعل حلاً جسم ماوس ثانوي المضيفين بإضافة جسم الغربية القياسية لطخة الكشف (انظر الجدول للمواد) ومكان الغشاء على شاكر؛ تترك في درجة حرارة الغرفة ح 2.
   16. تجاهل حل جسم ونقع في تي-تبس 1 x الحل على شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 7 دقائق.
   17. تجاهل تي-تبس 1 × الحل واستبدال. كرر 3 مرات.
   18. نقع غشاء لمدة 5 دقائق في حل تشيميلومينيسسينت، وصورة الغشاء في تصوير تشيميلومينيسسينسي.

3-استعادة حساسية المانع المستهدفة-العلاج بمرشح R-جين تدق إلى أسفل

1. إعداد الخلية
   1. إعداد تعليق خلية واحدة من تريبسينيزيشن. أداء تعداء في اليوم الذي يتم مطلي بالخلايا.
      1. أغسل NCI-N87 الخلايا مع برنامج تلفزيوني، واحتضان في 37 درجة مئوية مع حل التربسين/يدتا 0.05% 5-10 دقيقة 2 إضافة حجم ربمي المتوسطة تحتوي على 10% الجنيني البقري المصل لتحييد التربسين (مثلاً، 2 مل متوسط لكل 1 مل من التربسين).
      2. حساب عدد الخلايا مع هيموسيتوميتير استخدام التلوين تريبان الأزرق. بذور 2.5 × 10⁵ خلايا (التقاء 60 ٪) على قارورة² سم T25 لكل شرط.
         ملاحظة: يتحدد العدد المناسب من الخلايا لبذر الوقت مضاعفة خط الخلية ومدة التجربة. ويهدف إلى تحقيق الجينات المستهدفة أسفل تدق لمدة التجربة بأكملها. تسعة T25 سم² قوارير تعتبر مثالية لظروف تعداء والتحليل كلونوجينيك (3 قوارير لعناصر التحكم، 3 قوارير لعناصر سلبية تعداء، 3 قوارير للجينات المستهدفة تعداء).
2. عكس تعداء
   1. إعداد الجينات المستهدفة والسلبية تحكم تعداء ميكس لكل قارورة² سم T25 كما يلي.
      1. تمييع ميليلتر 12.5 كل استهداف الجين siRNA النوكليوتيد أو "المراقبة السلبية" siRNA النوكليوتيد في المتوسط تعداء الأساسية الحد الأدنى (نسبة 01:55؛ انظر الجدول للمواد).
      2. إضافة كاشف تعداء الحويصلية الأيوني (نسبة 1:1 مع استهداف الجين النوكليوتيد siRNA؛ انظر الجدول للمواد). احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
         ملاحظة: الحجم الإجمالي لهذا المزيج تعداء هو 700 ميليلتر.
      3. إضافة 700 ميليلتر من مزيج تعداء لكل قارورة² سم T25. احتضان خلايا في 37 درجة مئوية لمدة 1-3 أيام.
   2. تحقق من الجينات تدق لأسفل RT-PCR وتحليل لطخة غربية. إعادة التحقق من أثر المفترضة R-جين تدق لأسفل على استعادة حساسية لوكيل العلاجية المستهدفة من خلال تجارب تشكيل مستعمرة (كرر الخطوة 1، 5).

النتائج

الشكل 1 يبين الإطار الداخلي التجريبية. ثلاثة سرطان المعدة خلية خطوط التعبير عن مستوى عال من HER2 وحساسة إلى تراستوزوماب (IC₅₀ < مستوى البلازما الذروة من المخدرات، الشكل 2 ألف، الرسم البياني الأيسر) كانت تزرع في الثقافة المتوسطة التي تحتو?...

Discussion

بينما شخصية واستهدفت العلاجات أثارت الحماس المتزايد، تواجه هذه العلاجات ما يسمى 'الذكية' العقبة الرئيسية نفسها كالمخدرات العلاج الكيميائي التقليدي، أي، واكتساب المقاومة للأدوية سريعة ولا يمكن التنبؤ بها. لتحسين نتائج العلاج المستهدفة، يجب أن تحل مشاكل مقاومة العقاقير من خلال فهم أ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizol Reagent	Invitrogen	15596026	TRIzol Reagent is a reagent for isolating high-quality total RNA or simultaneously isolating RNA, DNA, and protein from a variety of biological samples
ISCRIPT CDNA SYNTHESIS KIT	Bio-Rad	1708891	The iScript cDNA synthesis kit is a sensitive and easy-to-use first-strand cDNA synthesis kit for gene expression analysis using real-time qPCR.
TaqMan gene expression assay	Life Technologies	4331182	Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays consist of a pair of unlabeled PCR primers and a TaqMan probe with an Applied Biosystems FAM or VIC dye label on the 5’ end and minor groove binder (MGB) and nonfluorescent quencher (NFQ) on the 3’ end.
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent	Thermo Scientific	78501	Thermo Scientific M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent is designed to provide highly efficient total soluble protein extraction from cultured mammalian cells.
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)	Thermo Scientific	78440	Thermo Scientific Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) provides the convenience of a single solution with full protein sample protection for cell and tissue lysates.
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	The Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit is a two-component, high-precision, detergent-compatible assay reagent set to measure (A562nm) total protein concentration compared to a protein standard.
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747	Use 4x Laemmli Sample Buffer for preparation of samples for SDS PAGE. For reduction of samples, add a reducing agent such as 2-mercaptoethanol to the buffer prior to mixing with the sample.
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels	Bio-Rad	456-1094	Long-life TGX (Tris-Glycine eXtended) Gels have a novel formulation and can be used for both standard denaturing protein separations as well as native electrophoresis.
Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards	Bio-Rad	1610376	Precision Plus Protein Prestained Standards are available in Dual Color, All Blue, Kaleidoscope, and Dual Xtra formats. All four have the same gel migration patterns, with 3 high-intensity reference bands (25, 50, and 75 kD).
10x Tris/Glycine/SDS	Bio-Rad	1610732	10x Tris/glycine/SDS is a premixed running buffer for separating protein samples by SDS-PAGE.
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs	Bio-Rad	1704156	Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs for fast, efficient transfer of proteins from mini gels using the Trans-Blot Turbo Transfer System. Each vacuum sealed, ready-to-use transfer pack contains two buffer-saturated ion reservoir stacks and a prewetted PVDF membrane.
Precision Protein StrepTactin-HRP Conjugate	Bio-Rad	1610381	StrepTactin-Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugate for chemiluminescent or colorimetric detection of Precision Plus Protein Unstained Protein Standards or Precision Plus Protein WesternC Protein Standards on western blots.
Immun-Star WesternC solution	Bio-Rad	5572	Immun-Star WesternC solution, a method of protein detection , detects mid-femtogram amounts of protein.
Universal Negative Control	Invitrogen	12935300	Negative Control siRNA has no significant sequence similarity to mouse, rat, or human gene sequences. The control has also been tested in cell-based screens and proven to have no significant effect on cell proliferation, viability, or morphology.
opti-MEM Glutamax Medium	Thermo Fisher Scientific	51985026	Opti-MEM Medium is an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in growth rate or morphology.
Silencer Select Pre-Designed & Validated siRNA	Ambion	4390824	RNA interference (RNAi) is the best way to effectively knock down gene expression to study protein function in a wide range of cell types.
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	Invitrogen	13778075	Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent offers an advanced, efficient solution for siRNA delivery. No other siRNA specific transfection reagent provides such easy and efficient siRNA delivery in a wide variety of cell lines including common cell types, stem cells and primary cells, as well as traditionally hard-to-transfect cell types.
Mouse anti-IQGAP1	Invitrigen	33-8900	working concentration: 1:400 in 5% milk solution
goat anti-mouse IgG-HRP: sc-2005	Santa Cruz	sc-2005	working concentration: 1:10000 in 5% milk solution
PMSF	Sigma Aldrich	P 7626	this is an inhibitor of serine proteases and acetylcholinesterase
Thermocycler for RT-PCR	MJ Research	MJ Research PTC-200 Thermal Cycler	it allows temperature homogeneity and a ramping speed of up to 3°C/sec. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Real Time RT-PCR instrument	Applied Biosystems	7500 RT-PCR system	This is a five-color platform that uses fluorescence-based polymerase chain reaction (PCR) reagents to provide a relative quantification using comparative CT assay type. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Microvolume Spectrophotometers	Thermo Scientific	Nanodrop	It provides an accurate and fast acid nucleid measurement using little volume of sample
Blotting system	Bio-Rad	Trans-Blot Turbo system	It perfoms a semy-dry transfer in a few minutes
Image acquisition system and gel documentation	Bio-Rad	Chemidoc image system	It is easy to use for chemiluminescent detection