מחפש נהג מסלולים של רכשה עמידות לטיפול ממוקד: דור Subclone עמידים בפני התרופה ורגישות שחזור על ידי ג'ין דפיקה למטה

Summary

זהו פרוטוקול זמן cost effective במבחנה חוקרים על מנגנוני ההתנגדות רכשה סוכני טיפולית ממוקד, ובגלל זה צורך רפואי קליניות מאוד בניהול סרטן.

Abstract

בעשרים השנים האחרונות ראינו משמרת של תרופות ציטוטוקסיות לטיפול ממוקד לאונקולוגיה רפואית. למרות יישוב סוכני טיפולית הראו יעילות קלינית מרשים יותר תופעות לוואי ממוזער טיפולים מסורתיים, תרופתיים הפך המגבלה העיקרית היתרונות שלהם. מספר מודלים פרה/במבחנה/ויוו של ההתנגדות רכשה סוכני ממוקד בטיפול קליני פותחו בעיקר באמצעות שתי אסטרטגיות: מניפולציה גנטית i) להכנת דגמים אחרים של ההתנגדות רכשה, ii) במבחנה / אין ויוו מבחר דגמים עמיד. בשנת העבודה הנוכחית, אנו מציעים מסגרת המאחד, על חקירת המנגנון הבסיסי אחראי על ההתנגדות רכשה סוכני טיפולית ממוקד, החל מהדור של subclones הסלולר עמידים לתרופות על תיאור של להשתיק הליכים המשמשים עבור שחזור הרגישות לחומר המדכא. פשוט הזמן cost effective בגישה זו הוא החלים נרחב, אפשרות להאריך בקלות לחקור את מנגנוני ההתנגדות לסמים אחרים טיפולית יישוב בגידול שונים histotypes.

Introduction

עוקב אחרי התגליות מכריע בביולוגיה מולקולרית, תאית, מספר מולקולות נגד סרטן מסונתז הרומן פותחו באופן סלקטיבי היעד oncogenic איתות המסלולים במגוון רחב של סוגי גידולים. בפרט, שתי קטגוריות של יישוב סוכני טיפולית עם מאפיינים ייחודיים באונקולוגיה, תרכובות כימיות כלומר סינתטי של נוגדנים חד-שבטיים רקומביננטי, ידועים השיגו הצלחות קליני וטיפול בסרטן שינו באופן דרמטי העשורים האחרונים^1,2,3.

ובכל זאת, למרות התגובה הראשונית שלהם מרשים לטיפול, הרוב המכריע של חולי סרטן פיתחו עמידות לתרופות לכל הסוכנים טיפולית יישוב, נוגדנים חד-שבטיים והן מעכבי קינאז. כתוצאה מכך, תרופתיים, המשוכה העיקריים תרופות נגד סרטן קלאסי⁴, הוא עדיין אתגר גדול עבור טיפולים ממוקדים המתעוררים^5,6.

עמידות לטיפול ממוקד עשוי להיות מהותי (קרי, ראשי) או רכשה (קרי, משני). התנגדות פנימית מתאר דה נובו חוסר תגובה לטיפול, בעוד התנגדות משני מתרחשת לאחר תקופת בתגובה סמים טיפול⁷. האחרון הוא הנגרמת על ידי התפרצויות של גדודים קטן של תאים סרטניים בתוך עיקר הגידול פרימיטיבי או בנויים דיסטלי נישות אנטומי נסתר, מפגין עד 90% עמידות לתרופה אחת או יותר ממוקד סוכני טיפולית. המנגנונים המולקולריים שבבסיס פיתוח עמידות לטיפול ממוקד בעיקר תוצאה של מוטציות היעד והפעלה מיותר של אחרים פרו-הישרדות איתות המסלולים, ההבנה של מי הוא עדיין רחוק מלהיות שלם⁸.

בעבודה זאת, הצענו זמן cost effective בגישה לחקור מנגנונים במבחנה של ההתנגדות רכשה סוכני טיפולית ממוקד, החל מהדור של subclones הסלולר עמידים לתרופות על תיאור של שתיקת הליכים המשמשים עבור שחזור הרגישות לחומר המדכא, כלי חיוני המשמש עבור בדיקה ואימות של בהנחות עבודה. בפרט, הגישה שלנו שימש לחקור, סרטן קיבה, מנגנוני ההתנגדות הרצפטין (למשל, הרצפטין), מואנשים חד-שבטיים מיקוד המחשבים חוץ-תאי של החלבון HER2⁹. הרצפטין + כימותרפיה מקובל כטיפול רגיל קו ראשון לסרטן שד גרורתי HER2 חיובי. בזכות מחקרים פרה מציג את האנטי-HER2 טיפולים יש פעילות משמעותית בשני במבחנה , ויוו HER2 חיובי סרטן קיבה מודלים^10,11, היה מולקולרית שהתרופות המתוות HER2 בחן בהרחבה בניסויים קליניים, חלקם עדיין בעיצומה, על חולים עם גסטרו סרטן^12,13,14,15.

מחקרים אלה הדגישו את המספר העולה מהמטופלים חווים התנגדות הרצפטין¹⁶, בדומה אל תצפית על מעכבי טיפולית יישוב אחרים. בפרט, קצב התגובה של הרצפטין היה 47%, חציון ההישרדות הכוללת של חולים על הרצפטין + כימותרפיה היה ארוך יותר לחולים על כימותרפיה לבד¹⁷2.7 חודשים בלבד. זה הציע כי בעוד הרצפטין העיקרי ההתנגדות היא שכיחה, הרצפטין משני ההתנגדות היא בלתי נמנעת. מסיבה זו, יש צורך דחוף כדי להבהיר את מנגנוני גרימת טיפול ממוקד-HER2 עמידות סרטן קיבה, אשר הוא בעייתי עוד יותר בהתחשב הטרוגניות גנטית אינטרה-tumoral את זה neoplasia¹⁸.

בנוסף, מנגנוני עמידות הרצפטין בסרטן קיבה הוכיחו מאתגר להסביר, חלקית עקב הקושי בהשגת במודלים פרה אמין נציג של מצב זה. אושימה. et al. דיווח על שיטת הבחירה ויוו של שורות תאים עמידים הרצפטין סרטן קיבה, המורכב תרבות חוזרות ונשנות של גרורות קטנות הצפק שיורית לאחר הטיפול עם הרצפטין¹⁹. עם זאת, הצורך של זיווד, ההתמחות לטיפול בבעלי חיים ספציפיים ועל האישור של ועדת האתיקה חיה תרמו הפיכתה לפעולת לצרוך זמן עלות. הגישה שנתאר בעבודה זו פשוט וקל החלים נרחב, אפשרות להאריך בקלות לחקור את מנגנוני ההתנגדות לסמים אחרים טיפולית גידול שונים histotypes²⁰.

Protocol

הערה: פרוטוקול זה במיוחד הותאם לניתוח של המנגנונים ההתנגדות רכשה הרצפטין של שורות תאים של סרטן קיבה וורויקשייר-חיוביות. כל מכשירי מעבדה הצורך מדווחים בטבלה של חומרים.

1. דור של Subclones עמידים לטיפול ממוקד

הערה: זה הכי קריטי, קשה לתקנן את שלב בפרוטוקול בשל העובדה כי שורות תאים שונים עשוי להפגין רגישויות שונות לחומר המדכא טיפולית יישוב עצמאי של התרכזות histotype או התרופה שלהם הגידול בשימוש.

1. תרבות NCI-N87 תא קו בינוני RPMI בתוספת סרום עגל עוברית (10%) וגלוטמין (2 מ מ, 1%), כמו טפט ב 37 מעלות צלזיוס, זרע זה על 25 ס מ² תרבות מבחנות.
2. הוסף למדיום תרבות ב כל הבקבוק 10 µg/mL של הרצפטין המינון ההתחלתי. חושפים את התאים המינון ההתחלתי עד שהם לחדש גדל.
   הערה: המינון ההתחלתי של החומר המדכא טיפול ממוקד צריך להיות 10-fold נמוך יותר ריכוז שיא פלזמה שלה. ריכוז שיא פלזמה היא הרמה הגבוהה ביותר של ריכוז התרופה זוהה דם החולה בדרך כלל בעקבות מספר מינונים של טיפול סטנדרטי. ערך זה ניתן יהיה לאחזר ממחקרים על פרמקוקינטיקה.
3. לעקוב אחר גדילת תאים עם השיטה הדרה trypan blue; כאשר יתחדש צמיחת תאים (בדרך כלל לאחר תקופה של שבועיים עד שלושה שבועות), חושפים את התאים 10-fold ריכוז מינון גבוה יותר של הרצפטין.
4. לחשוף לתאים מנה בהדרגה גדל והולך של הרצפטין (מתוך 100 µg/mL כדי µg 400/mL) עד לשמור תאים הגדלים (לאחר כשבועיים) למרות נוכחותם של ריכוז סמים גבוהה (לפחות 2.5 - 4-fold גבוה יותר מאשר הפסגה פלזמה).
5. ביצוע וזמינותו של clonogenic כדי להעריך את רמת ההתנגדות לטיפול ממוקד-כל שינוי של הריכוז של החומר המדכא טיפול המטרה בטווח הבינוני תרבות, ולהגדיר עמידות יחסית IC₅₀ אינדקס (RR IC₅₀) כדלקמן.
   1. זרע 500 תאים 24 צלחות תרבות רב טוב.
      הערה: בארות 5 צריך להיות מוכן לכל ערכת תנאים.
   2. לחשוף תאים הגדלת יעד טיפול מעכב (הרצפטין) ריכוזים של µg/mL 100 עד 400 µg/mL.
   3. דגירה בתאים חממה₂ CO ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 ימים.
   4. לאחר דגירה, לתקן, כתם דגימות כדלקמן.
      1. להסיר תאים בינונית ולאחר מכן לשטוף עם PBS 1 x 10 מ"ל. 1 x PBS להסיר ולהוסיף 2-3 מ"ל של פתרון קיבעון (חומצה אצטית: מתנול, 1:7, (כרך/כרך)). להסיר את הפתרון קיבוע ולהוסיף הפתרון קריסטל ויולט 0.5%. דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעתיים
      2. להסיר את הפתרון קריסטל ויולט בקפידה על-ידי כ רפה בעברית עם פיפטה ומשקיעים לוחות במי ברז לשטיפה מכל משקעים הפתרון קריסטל ויולט. מילה נהדרת בטמפרטורת החדר עד 2 ימים.
   5. לספור מושבות של יותר מ- 50 תאים באמצעות מיקרוסקופ הפוכה (4 X הגדלה).
      הערה: שני משקיפים עצמאיים נדרשים עבור זה.
   6. לחשב RR IC₅₀ כיחס בין ערך₅₀ IC תאי היעד-טיפול עמידים subclone, הערך של התאים המקורי/נאיבי.

2. אימות פרוטוקול עבור המועמד ממוקד בטיפול ההתנגדות ג'ין (R-גן)

הערה: לאחר אפיון גנים, חתימות המשויך ההתנגדות רכשה יעד טיפול וג'ין כל מועמד כמו נהג של התנגדות ייחקר באמצעות: א) RT-PCR, ומערבי ב) כתם ניתוח.

1. בזמן אמת RT-PCR
   1. לחלץ RNA הכולל שורות תאים באמצעות תערובת thiocyanate-פנול-כלורופורם חומצה guanidinium (ראה טבלה של חומרים).
   2. לבצע תגובות שעתוק במהופך (RT) באמצעות תחל hexamer אקראיים ולהגדיר הצנטרפוגה תרמי כדלקמן: הטרמה 25 ° c במשך 5 דקות, RT ב 46 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, ו- RT איון ב 95 ° C עבור 1 דקות.
   3. שימוש 400 ננוגרם של RNA הכולל עבור ריאקציה 20 µL. להכין לתערובת תגובה עבור מדגם כדלקמן: 7 µL RNase חינם H₂א, 2 µL cדנ א (10 ng/µL), µL 1 20 x התווית על-ידי פלורסנט בדיקה במטרה ולאחר 10 µL 2 x Mix המכילה מאגר dNTPs, ה-DNA פולימראז (ראה טבלה של חומרים).
   4. להוסיף 20 µL של תערובת התגובה כל צלחת היטב ולהפעיל את התוכנית הבאה: מחזיקים את הבמה ב 50 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (מחזור 1); אז 40 מחזורי ב 95 ° C 15 s ו ב 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה.
2. תספיג חלבון
   1. לשחזר המתלים תא על-ידי הוספת 2 מ"ל של 0.05% טריפסין/EDTA פתרון ומאפשר 2-3 דקות עבור טריפסין לעבודה.
   2. להוסיף 2 כרכים בינוני המכיל 10% עוברית שור סרום כדי לנטרל טריפסין (למשל, 2 מ ל בינונית עבור כל 1 מ"ל של טריפסין) ואת צנטריפוגה-g x 1,200 עבור 5 דק להשליך supernatant ותאי תשטוף עם PBS קר 1 x.
   3. תגובת שיקוע צנטריפוגה-g x 1,200 עבור 5 דקות וזורקים. Resuspend בגדר תא עם פירוק מאגר, דגירה על כיסא נדנדה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      1. הכמות של פירוק מאגר תלויה מספר התאים (למשל, µL 100 עבור 1 x 10⁶ תאים); הקפד להכין מאגר פירוק טריים בכל פעם. עבור 1 מ"ל של פירוק מאגר הכנה (להשאיר על קרח): שימוש 975 µL M-לכל מאגר lysate בתרבית של מעכבי פרוטאז, פוספטאז µL 15, 10 µL 100 מיקרומטר PMSF מעכבי.
   4. לשחזר את החלבון supernatant על ידי צנטריפוגה lysate תא ב g x 13,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
   5. לקבוע ריכוז חלבון באמצעות שיטת של BCA.
   6. להוסיף 4 x LaemmLi מדגם מאגר דגימות חלבון (לפחות 20-30 µg של חלבון) וחום ב 100 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות.
   7. השתמש precast 4-20% ג'ל וטען µg 20-30 של פתרון חלבון LaemmLi ו- 5-10 µL של חלבון סטנדרטית עבור דגימה.
   8. למלא את הטבעת תספיג טריס/GLICYNE /SDS 1 x מאגר ולהפעיל ג'ל-110 V למשך 30-60 דקות (עצירת הזמן בדוק כי לצבוע הגיע לסוף של הג'ל, אחרת להפעיל לכמה דקות נוספות)
   9. Electroblot להעביר את החלבון לתוך קרום PVDF (ראה טבלה של חומרים) באמצעות מערכת חצי יבש.
   10. לחסום את הקרום על-ידי לספוג את הפתרון המתאים חלבון (חלב/BSA 5%) על ניעור בטמפרטורת החדר מאובטח.
   11. להפוך את פתרון 1:400 עם נוגדן anti-IQGAP1 העיקרי בפתרון חלב 5% (ראה טבלה של חומרים).
   12. מקם את הקרום פתרון נוגדן ראשוני על מטרף בחדר קר בן לילה.
   13. למחרת, לבטל את הפתרון נוגדן ומשרים בפתרון 1 x T-TBS (1 x T-TBS: 1 x טריס מלוחים מאגר שנוספו על-ידי Tween20 0.1%) על מטרף בטמפרטורת החדר במשך 7 דקות.
   14. להתעלם T-TBS 1 x והחלפה של פתרון. חזור על 3 פעמים.
   15. להפוך את פתרון העכבר המשני-נוגדן 1:10,000 על-ידי הוספת נוגדן המערבי הסטנדרטי כתם זיהוי (ראה טבלה של חומרים) ומניחים את הקרום על מטרף; יוצאים בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.
   16. לבטל את הפתרון נוגדן ומשרים בפתרון 1 x T-TBS על מטרף בטמפרטורת החדר במשך 7 דקות.
   17. להתעלם T-TBS 1 x והחלפה של פתרון. חזור על 3 פעמים.
   18. להשרות קרום עבור 5 דקות פתרון chemiluminescent ולאחר תמונה הקרום על imager chemiluminescence.

3. שחזור רגישות מעכב היעד-טיפול על ידי המועמד R-גן דפיקה למטה

1. הכנה תא
   1. הכן תא בודד השעיה על ידי trypsinization. לבצע תרביות תאים ביום בו התאים אינם מצופים.
      1. לשטוף NCI-N87 תאים עם PBS, דגירה ב 37 ° C עם פתרון טריפסין/EDTA 0.05% 5-10 דקות להוסיף 2 נפח של RPMI בינוני המכיל 10% עוברית שור סרום לנטרל טריפסין (למשל, 2 מ ל בינונית עבור כל 1 מ"ל של טריפסין).
      2. ספירת תאים hemocytometer באמצעות צביעת trypan blue. זרע 2.5 10x⁵ תאים (60% הנהרות) לתוך בקבוקון² ס מ T25 עבור כל תנאי.
         הערה: מספר מתאים של תאים עבור זריעה נקבעת לפי זמן ההכפלה של הקו הסלולרי וכן את משך הזמן של הניסוי. המטרה היא להשיג את היעד גן דפיקה למטה משך כל זמן הניסוי. תשעה T25 ס מ² מבחנות הינם אידיאליים עבור תנאים תקנים ואת וזמינותו clonogenic (3 מבחנות עבור פקדים, 3 מבחנות עבור פקדים שלילי תרביות תאים, 3 מבחנות עבור ג'ין-יעד תרביות תאים).
2. תרביות תאים הפוכה
   1. הכן ג'ין-מטרה ושלילי שליטה מיקס תרביות תאים עבור כל הבקבוק² ס מ T25 כדלקמן.
      1. לדלל µL 12.5 כל פילוח ג'ין oligonucleotides siRNA או שליטה שלילי oligonucleotides siRNA במדיום תרביות תאים חיוניים מינימלי (יחס 1:55; ראה טבלה של חומרים).
      2. הוספת ריאגנט תרביות תאים ליפוזום cationic (יחס 1:1 עם פילוח ג'ין oligonucleotides siRNA; ראה טבלה של חומרים). דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
         הערה: הנפח הכולל של המיקס תרביות תאים הוא 700 µL.
      3. להוסיף 700 µL של תרביות תאים לערבב את הבקבוק² ס מ לכל T25. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1-3 ימים.
   2. ודא ג'ין דפיקה למטה על-ידי ה-RT-PCR וניתוח תספיג חלבון. בדוק היטב את השפעת בשם R-גן הדפיקה למטה על שחזור רגישות לסוכן טיפולי ממוקד באמצעות ניסויים היווצרות המושבה (חזור על שלב 1.5).

תוצאות

איור 1 מתווה במסגרת ההליך ניסיוני. שלושה סרטן קיבה-שורות תאים המבטאים רמה גבוהה של HER2, רגישות הרצפטין (IC₅₀ < שיא רמת הפלסמה של התרופה, 2A איור, גרף השמאלי) גדלו במדיום תרבות המכיל את הסוכן טיפולית יישוב. מנה 10-fold נמוכים מריכוז הפלסמה שיא ש?...

Discussion

בעוד אישית ממוקדת טיפולים יש elicited ההתלהבות גוברת, אלה טיפולים "חכם" כביכול עם הפנים את המשוכה הגדולות באותה תרופות כימותרפיות המסורתי, כלומר, רכישת תרופתיים מהירה ובלתי צפויים. כדי לשפר את התוצאות של טיפול ממוקד, צריך יהיה לפתור בעיות תרופתיים דרך הבנה טובה יותר של המנגנונים שגורמים ל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizol Reagent	Invitrogen	15596026	TRIzol Reagent is a reagent for isolating high-quality total RNA or simultaneously isolating RNA, DNA, and protein from a variety of biological samples
ISCRIPT CDNA SYNTHESIS KIT	Bio-Rad	1708891	The iScript cDNA synthesis kit is a sensitive and easy-to-use first-strand cDNA synthesis kit for gene expression analysis using real-time qPCR.
TaqMan gene expression assay	Life Technologies	4331182	Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays consist of a pair of unlabeled PCR primers and a TaqMan probe with an Applied Biosystems FAM or VIC dye label on the 5’ end and minor groove binder (MGB) and nonfluorescent quencher (NFQ) on the 3’ end.
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent	Thermo Scientific	78501	Thermo Scientific M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent is designed to provide highly efficient total soluble protein extraction from cultured mammalian cells.
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)	Thermo Scientific	78440	Thermo Scientific Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) provides the convenience of a single solution with full protein sample protection for cell and tissue lysates.
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	The Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit is a two-component, high-precision, detergent-compatible assay reagent set to measure (A562nm) total protein concentration compared to a protein standard.
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747	Use 4x Laemmli Sample Buffer for preparation of samples for SDS PAGE. For reduction of samples, add a reducing agent such as 2-mercaptoethanol to the buffer prior to mixing with the sample.
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels	Bio-Rad	456-1094	Long-life TGX (Tris-Glycine eXtended) Gels have a novel formulation and can be used for both standard denaturing protein separations as well as native electrophoresis.
Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards	Bio-Rad	1610376	Precision Plus Protein Prestained Standards are available in Dual Color, All Blue, Kaleidoscope, and Dual Xtra formats. All four have the same gel migration patterns, with 3 high-intensity reference bands (25, 50, and 75 kD).
10x Tris/Glycine/SDS	Bio-Rad	1610732	10x Tris/glycine/SDS is a premixed running buffer for separating protein samples by SDS-PAGE.
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs	Bio-Rad	1704156	Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs for fast, efficient transfer of proteins from mini gels using the Trans-Blot Turbo Transfer System. Each vacuum sealed, ready-to-use transfer pack contains two buffer-saturated ion reservoir stacks and a prewetted PVDF membrane.
Precision Protein StrepTactin-HRP Conjugate	Bio-Rad	1610381	StrepTactin-Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugate for chemiluminescent or colorimetric detection of Precision Plus Protein Unstained Protein Standards or Precision Plus Protein WesternC Protein Standards on western blots.
Immun-Star WesternC solution	Bio-Rad	5572	Immun-Star WesternC solution, a method of protein detection , detects mid-femtogram amounts of protein.
Universal Negative Control	Invitrogen	12935300	Negative Control siRNA has no significant sequence similarity to mouse, rat, or human gene sequences. The control has also been tested in cell-based screens and proven to have no significant effect on cell proliferation, viability, or morphology.
opti-MEM Glutamax Medium	Thermo Fisher Scientific	51985026	Opti-MEM Medium is an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in growth rate or morphology.
Silencer Select Pre-Designed & Validated siRNA	Ambion	4390824	RNA interference (RNAi) is the best way to effectively knock down gene expression to study protein function in a wide range of cell types.
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	Invitrogen	13778075	Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent offers an advanced, efficient solution for siRNA delivery. No other siRNA specific transfection reagent provides such easy and efficient siRNA delivery in a wide variety of cell lines including common cell types, stem cells and primary cells, as well as traditionally hard-to-transfect cell types.
Mouse anti-IQGAP1	Invitrigen	33-8900	working concentration: 1:400 in 5% milk solution
goat anti-mouse IgG-HRP: sc-2005	Santa Cruz	sc-2005	working concentration: 1:10000 in 5% milk solution
PMSF	Sigma Aldrich	P 7626	this is an inhibitor of serine proteases and acetylcholinesterase
Thermocycler for RT-PCR	MJ Research	MJ Research PTC-200 Thermal Cycler	it allows temperature homogeneity and a ramping speed of up to 3°C/sec. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Real Time RT-PCR instrument	Applied Biosystems	7500 RT-PCR system	This is a five-color platform that uses fluorescence-based polymerase chain reaction (PCR) reagents to provide a relative quantification using comparative CT assay type. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Microvolume Spectrophotometers	Thermo Scientific	Nanodrop	It provides an accurate and fast acid nucleid measurement using little volume of sample
Blotting system	Bio-Rad	Trans-Blot Turbo system	It perfoms a semy-dry transfer in a few minutes
Image acquisition system and gel documentation	Bio-Rad	Chemidoc image system	It is easy to use for chemiluminescent detection