타겟된 치료에 저항을 취득의 드라이버 경로 찾고: 약물 내성 Subclone 생성 및 감도 유전자 때 려 눕에 의해 복원

요약

이것은 시간 및 비용 effective 생체 외에서 프로토콜의 타겟된 치료제 인수 저항 메커니즘을 조사 하는 암 관리에 높은 미 충족된 의료 필요 이다.

초록

지난 2 년간 의료 종양학에서 타겟된 치료 세포 독성 약물에서 변화를 보았다. 타겟된 치료제 더 인상적인 임상 효능과 전통적인 치료법 보다 부작용 최소화에 표시 하는 있지만 약물 저항 그들의 혜택을 주요 제한 되고있다. 임상 연습에 대상된 에이전트에 저항을 취득된의 여러 전 임상/생체 외에서 또는 vivo에서 모델 두 가지 전략을 사용 하 여 주로 개발 되었습니다: 인수 저항, 및 ii) 생체 외에서 의 genotypes 모델링 i) 유전자 조작 / vivo에서 저항 모델의 선택. 현재 작업에서 우리는 기본 메커니즘의 설명에 약물 내성 세포 subclones의 세대에서 시작 타겟된 치료제에 저항을 취득된에 대 한 책임을 조사 통합 프레임 워크를 제안 입을 절차는 억제 물 감도 복원에 사용. 간단한 시간 그리고 비용 effective 이렇게 광범위 하 게 적용 이며 다른 종양 histotypes에 다른 대상된 치료 약물에 저항 메커니즘을 조사를 쉽게 확장할 수 있습니다.

서문

분자와 세포 생물학에 있는 중요 한 발견에 따라, 새로운 합성된 항 암 분자 수 선택적으로 종양 종류의 광범위 한 배열에 종양 신호 경로 대상으로 개발 되었습니다. 특히, 타겟된 치료제 종양학에서 독특한 속성의 두 가지 범주, 즉 합성 화학 화합물 및 재조합 단일 클론 항 체, 임상 성공 및 극적으로 변경 된 암 치료에서 달성 하는 것으로 알려져 있습니다. 최근 수십 년간^1,2,3.

그럼에도 불구 하 고, 치료에 그들의 인상적인 초기 대응에도 불구 하 고 암 환자의 대부분 모든 타겟된 치료제, 단일 클론 항 체와 kinase 억제제 약물 저항을 개발 했습니다. 결과적으로, 약물 내성, 고전적인 항 암 약⁴에 대 한 주요 장애물은 여전히 신흥 표적으로 한 치료^5,6에 대 한 큰 도전.

타겟된 치료에 저항을 내장 될 수 있습니다 (즉, 기본) 또는 (즉, 보조)를 인수. 본질적인 저항 보조 저항 약물 치료⁷응답의 기간 후에 발생 하는 반면 치료, 응답의 드 노 보 부족을 설명 합니다. 후자는 기본 종양의 대부분 내의 종양 세포의 작은 동료의 발생으로 인 한 또는 원심 비밀 해 부 틈새에 자리 잡고 있으며, 최대 90%까지 전시 저항 하나 이상의 타겟 치료제. 기본 타겟된 치료에 저항 개발 주로 분자 메커니즘 대상 유전자 변이 그 이해 완료⁸멀지는 다른 프로 생존 신호 통로의 중복 활성화에서 유래한 다.

이 작품에서는, 우리는 시간 및 비용 effective 접근의 약물 내성 세포 subclones의 세대에서 시작 하는 침묵의 설명에 타겟된 치료제 인수 저항 메커니즘 체 외에서 조사 제안 사용 감도 억제제, 테스트 작업 가설의 유효성을 검사 하는 사용 되는 중요 한 도구를 복원 하는 절차. 특히, 우리의 접근은 조사, 위 암, trastuzumab (예를 들어, Herceptin), HER2 단백질⁹의 세포 외 도메인을 대상으로 인간 답게 단일 클론 항 체를 저항 메커니즘에에서 사용 되었다. Trastuzumab + 화학요법 HER2 양성 전이성 유방암에 대 한 표준 첫 줄 치료로 널리 인정 됩니다. 그 안티 HER2 보여주는 최근 전 임상 연구 덕분에 치료에 있는 중요 한 활동 둘 다 생체 외에서 그리고 HER2 양성 vivo에서 위 암 모델^10,11, HER2를 표적으로 하는 분자 약물 되었습니다. 임상 시험에서 광범위 하 게 검사, 일부는 여전히 지속적인 환자 위 식도 암^12,13,,1415에 있습니다.

이러한 연구 환자 trastuzumab¹⁶, 유사 하 게 어떤 다른 타겟된 치료 억제제에 대 한 관찰은 저항을 발생의 상승 수를 강조 했다. 특히, trastuzumab의 응답 속도 47%, 그리고 trastuzumab + 화학요법에 환자에 대 한 평균 전반적인 생존은 불과 2.7 개월 환자 화학 요법 혼자¹⁷에 대 한 이상. 이 기본 trastuzumab 저항 유행 이다, 하는 동안 보조 trastuzumab 저항 불가피 하다 제안 했다. 이러한 이유로,이 neoplasia¹⁸의 내부 종양 유전자이 주어진 더욱 문제는 위 암에 HER2 타겟 치료 저항을 일으키는 메커니즘을 명확히 하는 긴급 한 필요가 있다.

또한,의 위 암에 trastuzumab 저항 메커니즘 설명 하 고, 부분적으로 신뢰할 수 있는 전 임상 모델 대표가 조건의 취득에 어려움으로 인해 어려운 입증 했다. 오시마 외 는 vivo에서 선택 방법을 trastuzumab 내성 위 암 세포 선, 작은 잔여 복 막 전이의 반복된 문화 trastuzumab¹⁹치료 후 구성 된의 보고. 그러나, 필요를, 특정 동물 처리 전문, 그리고 동물 윤리 위원회의 승인의 시간 그리고 비용 소모 메서드에 기여. 우리가이 작품에 설명 하는 방법은 간단 하 고 광범위 하 게 적용 이며 다른 종양 histotypes²⁰에서 다른 치료 약물에 저항 메커니즘을 조사 하기 위해 쉽게 확장할 수 있습니다.

프로토콜

참고:이 프로토콜은 특별히 조정 되었습니다 그녀의 긍정적인 위 암 세포 선의 trastuzumab 인수 저항을 기본 메커니즘의 분석에 대 한. 필요한 모든 실험실 계기는 자료의 테이블에에서 보고 됩니다.

1입니다. 타겟된 치료 저항 Subclones 세대

참고: 이것은 가장 중요 하 고 어려운 사실은 다른 셀 라인 수 전시 하지 다른 감도 타겟된 치료 억제제를 독립적으로 그들의 종양 histotype 또는 약물 농도에서 단계 프로토콜에서을 표준화 하 사용.

1. 문화 NCI N87 셀 RPMI 매체 37 ° C에서 단층으로 송아지 태아 혈 청 (10%)와 글루타민 (2 mM, 1%), 보충에 라인 그리고 25 cm² 문화 플라스 크에 씨앗.
2. 시작 하는 복용량으로 문화 매체 trastuzumab의 각 플라스 크 10 µ g/ml에서를 추가 합니다. 그들은 성장 하 고 다시 시작할 때까지 시작 하는 복용량에 셀을 표시 합니다.
   참고: 대상된 치료 억제제의 시작 하는 복용량의 플라즈마 피크 농도 보다 10 배 낮은 해야 합니다. 플라즈마 피크 농도 약물 농도 일반적으로 다음 표준 치료의 여러 복용량 환자 혈액에서 검출의 가장 높은 수준 이다. 약물 동력 학에 대 한 연구에서이 값을 검색할 수 있습니다.
3. Trypan 블루 제외 방법; 세포 성장 모니터링 세포 성장 (일반적으로 2 ~ 3 주 기간) 후 다시 시작할 때 셀 trastuzumab의 사진 높은 복용량 농도에 노출.
4. 높은 약물 농도 (적어도 2.5-4-fold 플라즈마 피크 보다 높은)의 존재에도 불구 하 고 (약 2 주) 후 성장 세포 유지까지 셀 trastuzumab (400 µ g/mL를 100 µ g/mL)에서 점차적으로 증가 복용량을 노출 합니다.
5. Clonogenic 분석 결과의 문화 매체에서 대상 치료 억제제의 농도 있는 모든 변화에 타겟된 치료 저항 수준을 평가를 수행 하 고 상대 저항 IC₅₀ 색인 (RR IC₅₀)를 다음과 같이 정의.
   1. 24 다 잘 배양 배지에서 500 셀 씨
      참고: 5 우물 각 조건 집합에 대 한 준비 되어야 한다.
   2. 400 µ g/mL까지 100 µ g/mL에서 증가 대상 치료 억제제 (trastuzumab) 농도에 세포를 노출 합니다.
   3. 15 일 동안 37 ° C에서 CO₂ 배양 기에서 세포를 품 어.
   4. 부 화, 후 수정 하 고 샘플을 다음과 같이 얼룩.
      1. 10 mL 1 x PBS 가진 매체와 린스 셀을 제거 합니다. 1 x PBS를 제거 하 고 고정 솔루션 (아세트산 산: 메탄올, 1:7, (vol/vol))의 2-3 mL를 추가 합니다. 고정 솔루션을 제거 하 고 0.5% 크리스탈 바이올렛 솔루션을 추가 합니다. 2 시간에 대 한 실 온에서 품 어
      2. 피 펫으로 발음 하 여 크리스탈 바이올렛 솔루션을 신중 하 게 제거 하 고 접시 모든 크리스탈 바이올렛 솔루션 잔류물을 씻어 하 수도 물에 담가. 최대 2 일 동안 실 온에서 건조.
   5. 식민지는 거꾸로 한 현미경 (4 배 확대)를 사용 하 여 50 개 이상의 셀을 계산 합니다.
      참고: 두 명의 독립적인 관찰자가 필요 합니다.
   6. RR IC₅₀ 대상 치료 저항 subclone 셀의 IC₅₀ 값과 원래/순 진 셀의 값 사이 비율로 계산 합니다.

2. 유효성 검사는 후보에 대 한 프로토콜 타겟 치료 저항 유전자 (R-유전자)

참고: 유전자 발현의 특성, 후 서명 관련 된 대상 치료와 모든 후보 유전자 획득된 저항 저항 드라이버 통해 조사 될 것 이다: a) RT-PCR, 및 b) 서쪽 오 점 분석.

1. 실시간 RT-PCR
   1. 산 guanidinium 안산 클로 페 놀 프롬-혼합물을 사용 하 여 셀 라인에서 총 RNA 추출 ( 재료의 표참조).
   2. 반전 녹음 방송 (RT) 반응 임의의 hexamer 뇌관을 사용 하 여 수행 하 고 열 cycler를 다음과 같이 설정: 5 분, 20 분, 46 ° C에서 RT와 RT 비활성화 1 분 동안 95 ° C에서 25 ° C에서 못쓰게.
   3. 20 µ L 반응에 대 한 총 RNA의 사용 400 ng. 다음과 같이 샘플에 대 한 반응 혼합물 준비: 7 µ L RNase 무료 H₂O 2 µ L cDNA (10 ng / µ L), 형광 표시 된 특정 대상 조사, x 1 µ L 20 및 10 µ L 2 x 믹스 포함 버퍼, dNTPs, DNA 중 합 효소 ( 재료의 표참조).
   4. 각 잘 플레이트에 반응 혼합물의 20 µ L을 추가 하 고 다음 프로그램 실행: 2 분, 10 분 (1 사이클); 95 ° C에서 50 ° C에서 무대를 들고 95 ° C에서 15에 대 한 다음 40 주기 s 1 분 동안 60 ° C에서.
2. 서쪽 오 점
   1. 세포 현 탁 액의 0.05 %trypsin / EDTA 용액 2 mL를 추가 하 고 작동 하도록 트립 신에 대 한 2-3 분을 허용 하 여 복구 합니다.
   2. 2 권 중간 포함 10% 태아 둔감 한 혈 청의 트립 신 (예를 들어, 각 1 mL의 트립 신에 대 한 매체의 2 개 mL)을 중화 하 고 차가운 1 x PBS 가진 삭제 표면에 뜨는 및 세척 셀 5 분에 대 한 1200 x g에서 원심을 추가 합니다.
   3. 5 분 동안 1200 x g에서 centrifuge 고 상쾌한 삭제. 세포의 용 해 버퍼 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 30 분 동안 4 ° C에서 로커에 품 어.
      1. 세포의 용 해 버퍼의 셀 (예를 들어, 1 x 10⁶ 셀 100 µ L);의 수에 따라 다릅니다. 매번 신선한 세포의 용 해 버퍼를 준비 해야 합니다. 세포의 용 해 버퍼 준비 (얼음에 두고)의 1 ml: 975 µ M L를 사용 하 여-포유류 lysate 버퍼, 15 µ L 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제, 및 10 µ L 100 µ M PMSF 억제제.
   4. 15 분 동안 4 ° C에서 13000 x g에 세포 lysate 원심 분리에 의해 표면에 뜨는 단백질을 복구 합니다.
   5. BCA 단백질 분석 결과 사용 하 여 단백질 농도 결정 합니다.
   6. 단백질 견본 (적어도 20-30 µ g 단백질)을 3 분 동안 100 ° C에서 열 LaemmLi 샘플 버퍼 x 4를 추가 합니다.
   7. 캐스트 4-20% 젤을 사용 하 고 부하 LaemmLi 단백질 해결책의 20-30 µ g 및 샘플 당 표준 단백질의 5-10 µ L.
   8. 서쪽 오 점 링 트리 스/GLICYNE /SDS 1 x 버퍼를 실행 젤 110 V 30-60 분 (시간 중지 염료 젤, 그렇지 않으면 몇 가지 추가 분에 대 한 실행의 끝에 도달 했습니다 확인)
   9. PVDF 막으로 단백질을 전송 하는 Electroblot ( 재료의 표참조) 세미 건조 시스템을 사용 하 여.
   10. 막 1 시간 실 온에서 흔드는에 적절 한 단백질 해결책 (우유/BSA 5%)에 몸을 담글 하 여 차단 합니다.
   11. 5% 우유 솔루션에서 안티-IQGAP1 1 차 항 체로 1:400 솔루션으로 만들기 ( 재료의 표참조).
   12. 차가운 방에서 밤새 통에 1 차적인 항 체 솔루션에 막 장소.
   13. 다음 날, 항 체 솔루션을 삭제 하 고 T-큰 술 1 x 솔루션에 흠뻑 젖어 (1 x T-큰 술: 1 x 트리 스 염 분 버퍼 추가 Tween20으로 0.1%) 7 분 동안 실 온에서 통에.
   14. 솔루션 및 바꾸기 x T-큰 술 1을 삭제 합니다. 3 회 반복 한다.
   15. 1:10,000 보조 마우스 항 체 솔루션 표준 서에 대 한 항 체를 추가 하 여 감지 되 리 ( 재료의 표참조) 고 막 통;에 2 시간에 대 한 실 온에 둡니다.
   16. 항 체 솔루션을 삭제 하 고 7 분 동안 실 온에서 통에 T-큰 술 1 x 솔루션에 담근 다.
   17. 솔루션 및 바꾸기 x T-큰 술 1을 삭제 합니다. 3 회 반복 한다.
   18. 화학 영상에 막 이미지와 chemiluminescent 솔루션에 막 5 분을 담근 다.

3. 대상-치료 억제제 감도 후보 R 유전자 때 려 눕에 의해 복원

1. 세포 준비
   1. Trypsinization에 의해 단일 세포 현 탁 액을 준비 합니다. 세포는 도금 당일 transfection를 수행 합니다.
      1. 씻어 NCI N87 PBS로 세포 그리고 5-10 분 RPMI 중간 포함 10% 태아 둔감 한 혈 청의 트립 신 (예를 들어, 각 1 mL의 트립 신에 대 한 매체의 2 개 mL)을 중화 하 추가 2 볼륨에 대 한 0.05 %trypsin / EDTA 솔루션 37 ° C에서 품 어.
      2. Trypan 푸른 얼룩을 사용 하 여 hemocytometer와 셀을 계산. 씨 2.5 x 10⁵ 셀 (60% 합류) 각 조건에 대해 T25 cm² 플라스 크에.
         참고: 적절 한 시드 셀 수 셀 라인의 2 배 시간 및 실험의 기간에 의해 결정 됩니다. 목표 대상 유전자 실험의 전체 기간에 대 한 노크 다운 달성 하는. 9 개의 T25 cm² 플라스 크 transfection 조건 및 clonogenic 분석 결과 (컨트롤, 부정적인 transfection 컨트롤, 유전자-대상 transfection에 대 한 3 플라스 크 3 플라스 크 3 플라스 크)에 이상적입니다.
2. Transfection 역
   1. 유전자-대상 준비 하 고 다음과 같이 각 T25 cm² 플라스 크에 대 한 제어 transfection 믹스를 부정.
      1. 각 유전자를 대상으로 siRNA oligonucleotides 또는 최소한의 필수적인 transfection 매체 (비율 1시 55분; 참조 테이블의 재료)에 부정적인 제어 siRNA oligonucleotides의 12.5 µ L를 희석.
      2. 양이온 liposome transfection 시 (siRNA oligonucleotides 유전자를 대상으로 1:1 비율, 참조 테이블의 재료)를 추가 합니다. 20 분 동안 실 온에서 품 어.
         참고: transfection 믹스의 총 볼륨 700 µ L입니다.
      3. 각 T25 cm² 플라스 크를 transfection 믹스의 700 µ L를 추가 합니다. 1-3 일 동안 37 ° C에서 세포를 품 어.
   2. 유전자를 때 려 눕 RT-PCR 및 서쪽 오 점 분석에 의해 확인 합니다. 상 상속 유전자 R 눕 (반복 단계 1.5) 식민지 형성 실험을 통해 대상된 치료 에이전트에 감도 복원에의 영향을 다시 확인 합니다.

결과

그림 1 실험 절차의 프레임 워크를 설명합니다. 3 위 암 세포-라인 HER2 trastuzumab에 민감한의 높은 수준의 표현 (IC₅₀ < 마약, 그림 2A, 왼쪽된 그래프의 피크 플라즈마 수준) 타겟된 치료 에이전트를 포함 하는 문화 매체에서 성장 했다. 복용량은 10 배 trastuzumab (10 µ g/mL)의 피크 플라즈마 농도 시작 하는 복용량으로 설정 되었...

토론

맞춤 및 타겟 치료 성장 열정을 elicited 있다, 전통적인 화학 요법 약물, 즉, 약물 내성의 신속 하 고 예측할 수 없는 인수 같은 주요 장애물을 직면 하는이 소위 '스마트' 치료. 타겟된 치료의 결과 개선 하기 위해, 그들을 일으키는 원인이 되는 메커니즘의 더 나은 이해를 통해 약물 저항 문제를 해결 해야 합니다. 여기, 우리는 방법론을 광범위 하 게 액세스할 수 있는 시험관에 암 세포...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizol Reagent	Invitrogen	15596026	TRIzol Reagent is a reagent for isolating high-quality total RNA or simultaneously isolating RNA, DNA, and protein from a variety of biological samples
ISCRIPT CDNA SYNTHESIS KIT	Bio-Rad	1708891	The iScript cDNA synthesis kit is a sensitive and easy-to-use first-strand cDNA synthesis kit for gene expression analysis using real-time qPCR.
TaqMan gene expression assay	Life Technologies	4331182	Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays consist of a pair of unlabeled PCR primers and a TaqMan probe with an Applied Biosystems FAM or VIC dye label on the 5’ end and minor groove binder (MGB) and nonfluorescent quencher (NFQ) on the 3’ end.
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent	Thermo Scientific	78501	Thermo Scientific M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent is designed to provide highly efficient total soluble protein extraction from cultured mammalian cells.
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)	Thermo Scientific	78440	Thermo Scientific Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) provides the convenience of a single solution with full protein sample protection for cell and tissue lysates.
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	The Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit is a two-component, high-precision, detergent-compatible assay reagent set to measure (A562nm) total protein concentration compared to a protein standard.
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747	Use 4x Laemmli Sample Buffer for preparation of samples for SDS PAGE. For reduction of samples, add a reducing agent such as 2-mercaptoethanol to the buffer prior to mixing with the sample.
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels	Bio-Rad	456-1094	Long-life TGX (Tris-Glycine eXtended) Gels have a novel formulation and can be used for both standard denaturing protein separations as well as native electrophoresis.
Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards	Bio-Rad	1610376	Precision Plus Protein Prestained Standards are available in Dual Color, All Blue, Kaleidoscope, and Dual Xtra formats. All four have the same gel migration patterns, with 3 high-intensity reference bands (25, 50, and 75 kD).
10x Tris/Glycine/SDS	Bio-Rad	1610732	10x Tris/glycine/SDS is a premixed running buffer for separating protein samples by SDS-PAGE.
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs	Bio-Rad	1704156	Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs for fast, efficient transfer of proteins from mini gels using the Trans-Blot Turbo Transfer System. Each vacuum sealed, ready-to-use transfer pack contains two buffer-saturated ion reservoir stacks and a prewetted PVDF membrane.
Precision Protein StrepTactin-HRP Conjugate	Bio-Rad	1610381	StrepTactin-Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugate for chemiluminescent or colorimetric detection of Precision Plus Protein Unstained Protein Standards or Precision Plus Protein WesternC Protein Standards on western blots.
Immun-Star WesternC solution	Bio-Rad	5572	Immun-Star WesternC solution, a method of protein detection , detects mid-femtogram amounts of protein.
Universal Negative Control	Invitrogen	12935300	Negative Control siRNA has no significant sequence similarity to mouse, rat, or human gene sequences. The control has also been tested in cell-based screens and proven to have no significant effect on cell proliferation, viability, or morphology.
opti-MEM Glutamax Medium	Thermo Fisher Scientific	51985026	Opti-MEM Medium is an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in growth rate or morphology.
Silencer Select Pre-Designed & Validated siRNA	Ambion	4390824	RNA interference (RNAi) is the best way to effectively knock down gene expression to study protein function in a wide range of cell types.
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	Invitrogen	13778075	Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent offers an advanced, efficient solution for siRNA delivery. No other siRNA specific transfection reagent provides such easy and efficient siRNA delivery in a wide variety of cell lines including common cell types, stem cells and primary cells, as well as traditionally hard-to-transfect cell types.
Mouse anti-IQGAP1	Invitrigen	33-8900	working concentration: 1:400 in 5% milk solution
goat anti-mouse IgG-HRP: sc-2005	Santa Cruz	sc-2005	working concentration: 1:10000 in 5% milk solution
PMSF	Sigma Aldrich	P 7626	this is an inhibitor of serine proteases and acetylcholinesterase
Thermocycler for RT-PCR	MJ Research	MJ Research PTC-200 Thermal Cycler	it allows temperature homogeneity and a ramping speed of up to 3°C/sec. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Real Time RT-PCR instrument	Applied Biosystems	7500 RT-PCR system	This is a five-color platform that uses fluorescence-based polymerase chain reaction (PCR) reagents to provide a relative quantification using comparative CT assay type. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Microvolume Spectrophotometers	Thermo Scientific	Nanodrop	It provides an accurate and fast acid nucleid measurement using little volume of sample
Blotting system	Bio-Rad	Trans-Blot Turbo system	It perfoms a semy-dry transfer in a few minutes
Image acquisition system and gel documentation	Bio-Rad	Chemidoc image system	It is easy to use for chemiluminescent detection